h day质粒的提取和电泳

上次实验小结1、观察自己组的实验结果：转化平板*培养板在37C培养12-16h卫星菌：培养时间过长2、实验中的难点*制备效率高的感受态细胞o目的DNA片段质粒TA载体连接重组质粒目的DNA转化无质粒的E.Coli死亡有质粒的E.Coli存活含抗生素培养基中生长重组质粒的鉴定PCR开始上课时介绍2-3min平板筛选小量制备质粒和电泳分析实验四开始实验操作前：本次实验介绍10-15min质粒……质粒载体是存在于细菌染色体外的小型闭合环状双链DNA分子，在宿主细胞内可独立自主复制并赋予宿主细胞一定的遗传性状筛选标记MCS（多克隆位点）复制原点质粒1)培养细菌使质粒扩增；2)收集裂解细菌；3)分离纯化质粒DNA。

质粒提取原理：质粒提取有多种方法，但都包含有3个基本步骤：√去除蛋白质√去除基因组DNA√去除RNA*酚-氯仿抽提法*RNase消化？？？质粒DNA与基因组DNA的区别大肠杆菌遗传物质1、部位不同：2、大小不同：质粒分子量较小，大小只有普通细菌染色体DNA的百分之一。基因组DNA分子量较大，细菌基因组约含3000个基因，5106

bp。基因组DNA容易断裂线性化碱裂解法提取质粒的原理原理：1、强碱和SDS裂解细菌，细菌中的质粒或基因组DNA在碱性条件下发生变性。2、怎样去除基因组DNA？当加入酸性物质进行中和时，质粒DNA很快复性，

染色体DNA则和变性蛋白质等缠绕在一起难以复性而形成沉淀，经离心随细胞碎片一起去除；3、怎样去除蛋白质？（已经学过）留有质粒DNA的上清，经酚和氯仿去除蛋白质后,用乙醇沉淀质粒DNA，即得到质粒DNA.1)细胞悬浮液（溶液I）--悬浮菌体50mmol/L葡萄糖25mmol/LTris.HclPH8.010mmol/LEDTA.Na2PH8.02)细菌裂解液（溶液II）--裂解菌体0.2mol/L

NaOH1%SDS碱裂解法提取质粒试剂：3）中和液（溶液III）----中和NaOH60ml5mol/L醋酸钾11.5ml冰醋酸28.5ml水4）20mg/mlRNase----降解细菌RNA工作浓度30～50

g/ml其他试剂作用和成分同实验一。质粒DNA的制备录像5分钟：（8：20~8：25）（1）（细菌击的收渗获：孟）取1.奏5书ml工程副菌液僵6,0锄00转/分，及离心2m塘in，捆弃上溜清。（2）（细菌芹的裂鞋解：未）加入20及0l预冷略的细悟胞悬稍浮液唤（溶镜液I）悬浮细菌加入20救0l细菌武裂解泳液（秒溶液II），颠倒亿混合毫离心肚管内蝇容物柄，待群溶液天变粘旷稠为薯止。注：探粘狭稠洒：开密盖后寨出现密拉丝剩现象诱，证会明DN谊A已经枕游出拾。（3）（中牌和：嫩）加入15质0l中和颈液，优上下莫颠倒辟混合樱后置随冰上5m间in，12拿,0龟00转/陕分，4℃离心5m睛in。碱裂争解法哨提取撑质粒得操作扫步骤开始羞操作咸：（去歌除蛋迈白质团）（4）唇将上遇清移俱至另贤一离板心管虽中(注意抗不要钞混入终白色妹沉淀夏物)，加蠢入等缓体积法的TE饱和磁的酚/氯仿笛/异撕戊醇(2撕5：辟24翁:1搭)混和探液，船振荡保混匀1m眨in，12低,0擦00转/分离敬心5m凯in。（5拼）将盏上层短水相茂移至关另一趴离心拐管中廉，加许入等尊体积黄的氯异仿/异戊粮醇(2滴4:派1)溶液筐，振诸荡混鞋匀1m懂in，12答,0崖00转/分趣离心5m女in。（沉唱淀DN前A）（6榨）将惊上层醋水相息移至婶另一称离心傲管中惰，加防入2.管5倍体狮积的旧无水棋乙醇糕，腹置-2倚0℃沉淀10－15挤m牲in免。１最继续修提取矩质粒以：获取较及溶乓解沉溜淀的禾质粒DN广A2质粒DN询A电泳问分析伟：（7）12收,0票00转/狼分离器心8m棍in。弃上隶清，匀室温槐干燥童质粒DN胃A喷5-贼10纲mi禾n。（去柄除RN占A）（8）用20l含RN汪as妙e的水溶泰解质全粒DN严A，轻轻抱吹打驳混合。37南℃保温10零mi霸n20l质粒DN扛A溶液取出孤10l放于聋另一剧个离泳心管船中备蛛用剩余辉10l用于眯下一床步酶息切继续津实验石操作取10l的质迎粒DN闪A加2l上样德液混阴匀。加到0.富8%琼脂回糖凝串胶的跟加样捐孔内的。电泳阻条件振：10促0V瓣4咳0m援in。电泳辣结束互后照巾像保休存，塞结果验分析总。质粒DN发A的琼荒脂糖搭凝胶使电泳质粒拼提取娱方法质粒恐的量质粒傲的纯走度要批求决定辟使用蔑不同缎的方弓法质粒惑的大丹小质粒出过大怕：温航和裂撑解质粒雹大小江适中琴：碱妹裂解僻，煮胆沸法如：如：大量群提取休质粒殊：二做次扩渗增细辱菌，偶纯化牌方法暴要复辆杂小量穷提取很质粒骡：单冬克隆诵培养赚，普郊通碱咏裂解摸法质粒附纯度猪：要星求高投纯度宅、无河内毒壁素等请等（满敞足各否种转兔基因错实验养的要帽求）要求馆不同光的纯欺化方僻法电泳陷时讲窃授10排-2拿0m监in方法押举例坊：经典卸的方宋法：Cs泡Cl-溴化绩乙锭志梯度台密度冒离心特点井：纯涨度最玩高（帐可获洁得高程质量晋的超现螺旋闪质粒DN票A）、阿最贵绝、最辛麻烦应用寻：大量制备秘质粒挑；基右因注疫射，称基因振转染男等对确质粒号质量满要求汗高的辨实验缺口韵环状满或线遭状DN摇A闭环雕质粒DN锯A原理奖：不恐同结顶构和海大小抵的DN革A参入欠的溴爪化乙婚锭的扒量不血一样量从而楼在Cs倘Cl梯度赛密度献离心岁中处己于不尊同的京位置特点秃：小拘量质致粒制桃备、治最简昼便、岛快捷应用驶：质吧粒酶梳切鉴管定、灭克隆科（粗纽奉提）测序寨、转仅染（穿细提嫂）质粒傍提取盒试剂畏盒常用毁方法祝：小谎量碱筹裂解浇法满足恐不同鱼需要节的试产剂盒纯化靠原理鹿：离谁子交姓换柱确层析镰等小量勇制备丸质粒ki屿t大量核制备饰质粒ki简t去除桨内毒端素制饿备质践粒ki干t可用腥于大遮部分酒分生签实验质粒酿的电查泳质粒DN夺A的3鱼种形远式泳筝动速在度:油超螺霉旋>丢线性怨>开缩慧环质粒DN剖A的存战在形城式有张3种惹:1、共价眉闭环DN负A:常以糟超螺谅旋形戏式存端在2、开环DN秋A:质粒DN持A两条饮链中梢有一倘条发显生一她处或棕多处密断裂注，因箭此可滔以自裂由旋醋转从恶而消短除张水力,形成宪松弛肝的环糖状分甲子3、线性DN走A:因质茅粒DN鉴A的两晕条链窃在同侍一处芦断裂贤而造鸽成.开环超螺胳旋线性重组蠢质粒纠的鉴朽定平板皮筛选恢：大守多数妖情况耳下，亏平板使筛选锣只能列区分蜜含有赵或未奖含有曾质粒抚的细雅胞，售却无间法区楚分含畜有空胜质粒饺或重熄组质基粒