贝克曼流式细胞仪原理及软件介绍

流式细胞仪

FLOWCYTOMETER原理及软件介绍本文档共44页；当前第1页；编辑于星期三\18点21分BeckmanCoulter流式细胞仪发展史1947年WallaceCoulter发明了库尔特原理，用于血细胞分析1953年推出了世界上第一台流式细胞分析仪CoulterCounterModelA1972年推出世界上第一台激光流式细胞仪EPICSII1975年研制出世界上第一台带计算机的流式细胞仪1997年推出世界上第一台单激光四色数字化流式细胞仪EPICSXL/MCL2000年首先将高精度数字化颜色补偿技术ADC（AdvancedDigitalCompensation）应用于流式平台，引领流式进入全新的全矩阵补偿、全自动补偿和脱机补偿时代2003年推出世界上第一台单激光五色的流式细胞仪FC500/MCL，2005年升级为FC500/MPL2006年推出世界上第一台具有EV参数同时进行无成本绝对计数的多功能细胞分析系统QuantaSC，将流式细胞术与库尔特原理完美结合，2007年推出MPL进样系统2007年收购Dako公司的Moflo和Cyan，使Beckman公司成为高端流式市场的领导者2009年，推出世界是第一台三激光十色的分析型流式细胞仪Gallios/Navios本文档共44页；当前第2页；编辑于星期三\18点21分EPICSXL-ADC

QUANTASCCytomicsFC500BeckmanCoulterCelllabFamilyMoFloXDPGallios/NaviosCyanADP本文档共44页；当前第3页；编辑于星期三\18点21分FC500硬件本文档共44页；当前第4页；编辑于星期三\18点21分Whatisflowcytometry?流式细胞术是单个细胞/颗粒流过检测装置过程中，检测到的物理和/或化学的特性。HowardShapiro,PracticalFlowCytometry,3rdEdition本文档共44页；当前第5页；编辑于星期三\18点21分分类分析型：只能分析用，液流进入废液筒分选型：回收目标细胞，用于后续实验。要求管道绝对无菌。本文档共44页；当前第6页；编辑于星期三\18点21分基本原理流路（液流系统）流动室 鞘液SHEATH样本流SAMPLE单细胞悬液5*105~1*106个/ml光路（光学系统）光源滤片光电倍增管PMTHV电路（电路系统）放大电路HV及GAIN增益A/D转换分析系统：计算机本文档共44页；当前第7页；编辑于星期三\18点21分液流系统本文档共44页；当前第8页；编辑于星期三\18点21分流路构造本文档共44页；当前第9页；编辑于星期三\18点21分流路单细胞悬液大多数仪器是在50-300µm大小的孔径中,将细胞悬液注射进入鞘液中这一过程,成为流体动力学聚焦本文档共44页；当前第10页；编辑于星期三\18点21分FLOWCELLInjector

TipFluorescencesignalsFocusedlaserbeamSheath

fluid本文档共44页；当前第11页；编辑于星期三\18点21分光路系统本文档共44页；当前第12页；编辑于星期三\18点21分光路构造本文档共44页；当前第13页；编辑于星期三\18点21分光路光源检测信号散射光信号

FS:前向角散射光

SS:侧向角散射光(90度散射光)

荧光信号 荧光染料 光学滤片本文档共44页；当前第14页；编辑于星期三\18点21分

光路光源 与通过的细胞聚焦在同一点上激光

空冷 488nmblue,633nmred,325nmUV,514nmgreen,空冷/水冷EnterpriseII水冷Innova300系列 Innova70系列本文档共44页；当前第15页；编辑于星期三\18点21分常用激光器及其通道分配表本文档共44页；当前第16页；编辑于星期三\18点21分检测信号本文档共44页；当前第17页；编辑于星期三\18点21分散射光信号—前向散射光(FS)FS----Forward

(AngelLight)Scatter

在激光束正前方的检测器,为前向散射光检测器

FS的强度与细胞或其他颗粒的大小,形状及opticalhomogeneity有关FS用于检测细胞或其他粒子的表面属性 如:大小本文档共44页；当前第18页；编辑于星期三\18点21分FALSSensorLaser前向散射光

本文档共44页；当前第19页；编辑于星期三\18点21分前向散射光本文档共44页；当前第20页；编辑于星期三\18点21分散射光信号–侧向散射光SS-Side

(AngelLight)Scatter

与激光束垂直方向的检测器为侧向检测器,也称为90度散射光检测器SS用于检测细胞内部结构 如:胞浆内颗粒多少,核质比本文档共44页；当前第21页；编辑于星期三\18点21分FALSSensor90LSSensorLaser侧向散射光本文档共44页；当前第22页；编辑于星期三\18点21分侧向散射光本文档共44页；当前第23页；编辑于星期三\18点21分90DegreeScatter0

200

400

600

8001000815203040501002001000LymphocytesMonocytesNeutrophilsSideScatterProjectionLightScatterGatingScale本文档共44页；当前第24页；编辑于星期三\18点21分光路-荧光信号每种荧光染料均有特定的激发波长,并激发后会有发射波长,流式细胞仪检测的即是它特定的发射波长.

利用各种不同波长的光学滤片来收集(检测)这些光学信号本文档共44页；当前第25页；编辑于星期三\18点21分荧光染料的特性激发波长(EXCITING)发射波长(EMISSION)本文档共44页；当前第26页；编辑于星期三\18点21分常用荧光染料的特性荧光染料激发波长(nm)发射波长(nm)用途颜色FITC488525免疫荧光绿色PE(RD1)488575免疫荧光橙色ECD488620免疫荧光橙红PeCy5488675免疫荧光红PI488620DNA染色橙红PECy7 488 755 免疫荧光 深红PerCP 488 670APC633 670本文档共44页；当前第27页；编辑于星期三\18点21分5ColorSingleLaser(488nm)

FITC/PE/ECD/PC5/PC7本文档共44页；当前第28页；编辑于星期三\18点21分荧光染料比较(平均荧光强度)

Q-Prep/ImmunoPrep试剂系统PerCP<APC<FITC<ECD<PC5<PECD8-FITCCD8-PECD8-ECDCD8-PC5CD8-PerCPCD8-APC本文档共44页；当前第29页；编辑于星期三\18点21分FluorescenceFALSSensorFluorescencedetector(FL1,FL2,FL3,FL4,FL5,SS)本文档共44页；当前第30页；编辑于星期三\18点21分光路-滤片特性

长通滤片

–

允许长于设定波长的光通过

短通滤片–

允许短于设定波长的光通过

带通滤片–

允许一定带宽的波长通过本文档共44页；当前第31页；编辑于星期三\18点21分光路-滤片特性当以45o

角放置滤片时,该滤片可以通过一定波长的光,同时也可以阻断并折射该波长以下的光

这种方式的滤片称为二向色性滤片(dichroicfilter)

本文档共44页；当前第32页；编辑于星期三\18点21分滤片带通滤片BANDPASS(BP)只允许某些波长的光通过二向色性滤片DICHROICFILTER一定波长以上通过，该波长以下折射630nmBandPassFilterTransmittedLightWhiteLightSource620-640nmLightDichroicFilter/Mirrorat45degReflectedlightTransmittedLightLightSource本文档共44页；当前第33页；编辑于星期三\18点21分本文档共44页；当前第34页；编辑于星期三\18点21分电路系统本文档共44页；当前第35页；编辑于星期三\18点21分Optics-DetectorsPhotomultipliertube(PMT)

将光学信号转变为电脉冲(数字数据)信号

本文档共44页；当前第36页；编辑于星期三\18点21分不同的脉冲信号被转换成数字通道(CHANNEL)的过程

本文档共44页；当前第37页；编辑于星期三\18点21分本文档共44页；当前第38页；编辑于星期三\18点21分SingleParameterHistogram:CountvsMFI本文档共44页；当前第39页；编辑于星期三\18点21分SinglePa