基因突变与原核生物的质粒

关于基因突变与原核生物的质粒第1页，讲稿共28页，2023年5月2日，星期三③可以通过转化、转导或接合作用而由一个细菌细胞转移到另一个菌细胞中，使两个细胞都成为带有质粒的细胞；质粒转移时，它可以单独转移，也可以携带着染色体（片段）一起进行转移，所以它可成为基因工程的载体。④对于细菌的生存并不是必要的⑤功能多样化原核生物的质粒第2页，讲稿共28页，2023年5月2日，星期三功能：进行细胞间接合，并带有一些基因，如产生毒素、抗药性、固氮、产生酶类、降解功能等。重组：在质粒之间、质粒与染色体之间菌可发生。存在范围：很多细菌如E.coli、Shigella（志贺氏菌）、S.aureus（金黄色葡萄球菌）、Streptococcuslactis（乳链球菌）、根癌土壤杆菌等制备：包括增殖、裂解细胞、分离质粒与染色体和蛋白质等成分、去除RNA和蛋白质等步骤。鉴定：电镜观察、电泳、密度梯度离心、限制性酶切图谱等方法原核生物的质粒第3页，讲稿共28页，2023年5月2日，星期三几种代表性质粒：1.F–因子（fertilityfactor）：又称致育因子或性因子，62×106Dalton，94.5kb，相当于核染色体DNA2%的环状双链DNA，足以编码94个中等大小多肽，其中1/3基因（tra区）与接合作用有关。存在于肠细菌属、假单胞菌属、嗜血杆菌、奈瑟氏球菌、链球菌等细菌中，决定性别。第4页，讲稿共28页，2023年5月2日，星期三Figure.RepresentativeFERTILITYPLASMID.Afertilityplasmidcarriesthegenesforconjugationaswellasanumberofothergenes.Inthisfigurethefertilityplasmidalsocarriesantibioticresistantgenes.第5页，讲稿共28页，2023年5月2日，星期三最初发现于痢疾志贺氏菌（Shigelladysenteriae），后来发现还存在于Salmonella（沙门氏菌）、Vibrio（副溶血性弧菌）、Bacillus（芽孢杆菌）、Pseudomonas（假单胞菌）和Staphylococcus（葡萄球菌）中。R因子由相连的两个DNA片段组成，即抗性转移因子（resistencetransforfactor，RTF）和抗性决定R因子（r-determinant），RTF为分子量约为11×106Dalton，控制质粒copy数及复制，抗性决定质粒大小不固定，从几百万到100×106Dalton以上。其上带有其它抗生素的抗性基因。R-因子在细胞内的copy数可从1~2个到几十个，分为严紧型和松弛型两种，经氯霉素处理后，松弛型质粒可达2000~3000个/细胞。2.R因子（resistencefactor）第6页，讲稿共28页，2023年5月2日，星期三产大肠杆菌素因子。大肠杆菌素是由E.coli的某些菌株所分泌的细菌素，能通过抑制复制、转录、转译或能量代谢等而专一地杀死其它肠道细菌。其分子量约4×104~8×104Dalton。大肠杆菌素都是由Col因子编码的。Col因子可分为两类，分别以ColE1和ColIb为代表。ColE1分子量约为5×106Dalton，无接合作用，是多copy的；ColE1研究得很多，并被广泛地用于重组DNA的研究和用于体外复制系统上。ColIb分子量约为80×106Dalton，它与F因子相似，具有通过接合作用转移的功能，属于严紧型控制，只有1~2个copy。凡带Col因子的菌株，由于质粒本身编码一种免疫蛋白，从而对大肠杆菌素有免疫作用，不受其伤害。3.Col因子（colicinogenicfactor）第7页，讲稿共28页，2023年5月2日，星期三降解性质粒只在假单胞菌属中发现。它们的降解性质粒可为一系列能降解复杂物质的酶编码，从而能利用一般细菌所难以分解的物质做碳源。这些质粒以其所分解的底物命名，例如有分解CAM（樟脑）质粒，XYL（二甲苯）质粒，SAL（水杨酸）质粒，MDL（扁桃酸）质粒，，NAP（萘）质粒和TOL（甲苯）质粒等。4.降解性质粒第8页，讲稿共28页，2023年5月2日，星期三即诱癌质粒。存在于根癌土壤杆菌（Agrobacteriumtumefaciens）中,可引起许多双子叶植物的根癌当细菌侵入植物细胞中后，在其细胞中溶解，把细菌的DNA释放到植物细胞中。这时，含有复制基因的Ti质粒的小片段与植物细胞中的核染色体发生整合，破坏控制细胞分裂的激素调节系统，从而使它转变成癌细胞。Ti质粒长200kb，是一个大型质粒。当前，Ti质粒已成为植物遗传工程研究中的重要载体。一些具有重要性状的外源基因可借DNA重组技术设法插入到Ti质粒中，并进一步使之整合到植物染色体上，以改变该植物的遗传性，达到培育植物优良品种的目的。5、Ti质粒(tumorinducingplasmid)第9页，讲稿共28页，2023年5月2日，星期三是近年来在Rhizobium（根瘤菌属）中发现的一种质粒，分子量为200~300×106Dalton，比一般质粒大几十倍到几百倍，故称巨大质粒，其上有一系列固氮基因。6.巨大质粒（mega质粒）第10页，讲稿共28页，2023年5月2日，星期三基因：能够表达和产生基因产物（蛋白质或RNA）的DNA序列。原核生物基因系统： 启动子（基因） 操纵子 操纵子（基因）基因调控系统 结构基因 调节基因第11页，讲稿共28页，2023年5月2日，星期三遗传密码：指DNA链上各个核苷酸的特定排列顺序密码子（coden）：由3个核苷酸顺序决定，负载遗传信息的基本单位不对称转录：只有DNA双链的一股才作为有意义链被转录，这种现象又称不对称转录。起始密码子：AUG，甲硫氨酸或甲酰甲硫氨酸终止密码子：UAA、UGA、UAG第12页，讲稿共28页，2023年5月2日，星期三核外DNA的种类核外染色体真核生物的“质粒”原核生物的质粒

线粒体细胞质基因 叶绿体（质体） 中心体 动体共生生物： 卡巴颗粒酵母菌的2m质粒F因子R因子Col质粒Ti质粒巨大质粒降解性质粒第13页，讲稿共28页，2023年5月2日，星期三第二节基因突变和诱变育种突变（mutation

）：指生物体的表型突然发生的可遗传的变化。

染色体畸变——细胞学上可以看到染色体的变化突变

基因突变——细胞学上看不到遗传物质的变化突变体（mutant）：发生了突变的微生物细胞或菌株野生型（wildtype）：从自然界分离到的任何微生物在其发生突变前的原始菌株第14页，讲稿共28页，2023年5月2日，星期三★依表型的改变分为：形态突变型——营养缺陷型——因突变而丧失产生某种生物合成酶的能力，并因而成为必须在培养基中添加某种物质才能生长的突变类型。发酵突变型——丧失产生某种生物合成酶能力的突变型抗性突变型——因突变而产生了对某种化学药物或致死物理因子的抗性条件致死突变型——突变后在某种条件下可正常生长繁殖，而在另一条件下却无法生长繁殖的突变型抗原突变型——因突变而引起的抗原结构发生改变产量突变型——

（一）基因突变的类型第15页，讲稿共28页，2023年5月2日，星期三★按是否比较容易、迅速地分离到发生突变的细胞来分：选择性突变株（selectivemutant）：具有选择标记（如营养缺陷性、抗性突变型、条件致死突变型），只要选择适当的环境条件，如培养基、温度、pH值等，就比较容易检出和分离到。非选择性突变株（non-selectivemutant）：无选择标记（如产量突变型、抗原突变型、形态突变型），能鉴别这种突变体的惟一方法是检查大量菌落并找出差异。第16页，讲稿共28页，2023年5月2日，星期三第17页，讲稿共28页，2023年5月2日，星期三定义：每一细胞在每一世代中发生某一性状突变的几率。突变率为10–8是指该细胞在一亿次细胞分裂中，会发生一次突变。突变率也可以用每一单位群体在每一世代中产生突变株（mutant，即突变型）的数目来表示。如一个含108个细胞的群体，当其分裂为2×108个细胞时，即可平均发生一次突变的突变率也是10–8

。突变率=突变细胞数/分裂前群体细胞数突变是独立的。某一基因发生突变不会影响其它基因的突变率。在同一个细胞中同时发生两个基因突变的几率是极低的，因为双重突变型的几率只是各个突变几率的乘积。由于突变的几率一般都极低，因此，必须采用检出选择性突变株的手段，尤其是采用检出营养缺陷型的恢复突变株（backmutant或reversemutant）或抗性突变株特别是抗药性突变株的方法来加以确定。（二）突变率第18页，讲稿共28页，2023年5月2日，星期三若干细菌某一性状的自发突变率菌名 突变性状 突变率E.coli 抗T1噬菌体 3×10–8E.coli 抗T3噬菌体 1×10–7

E.coli 不发酵乳糖 1×10–10E.coli 抗紫外线 1×10–5Staphylococcusaureus 抗青霉素 1×10–7S.aureus 抗链霉素 1×10–9

Salmonellatyphi 抗25g/L链霉素 1×10–6

Bacillusmegaterium 抗异烟肼 5×10–5

第19页，讲稿共28页，2023年5月2日，星期三（三）突变的特点适用于整个生物界，以细菌的抗药性为例。不对应性：突变的性状与突变原因之间无直接的对应关系。自发性：突变可以在没有人为诱变因素处理下自发地产生。稀有性：突变率低且稳定。独立性：各种突变独立发生，不会互相影响。可诱发性：诱变剂可提高突变率。稳定性：变异性状稳定可遗传。可逆性：从原始的野生型基因到变异株的突变称为正向突 变（forwardmutation），从突变株回到野生型的 过程则称为回复突变或回变（backmutation或 reversemutation）。第20页，讲稿共28页，2023年5月2日，星期三（四）基因突变的自发性和不对应性的证明在各种基因突变中，抗性突变最为常见。但在过去相当长时间内对这种抗性产生的原因争论十分激烈。一种观点认为，突变是通过适应而发生的，即各种抗性是由其环境（指其中所含的抵抗对象）诱发出来的，突变的原因和突变的性状间是相对应的，并认为这就是“定向变异”，也有人称它为“驯化”或“驯养”。另一种看法则认为，基因突变是自发的，且与环境是不相对的。由于其中有自发突变、诱发突变、诱变剂与选择条件等多种因素错综在一起，所以难以探究问题的实质。从1943年起，经过几个严密而巧妙的实验设计，主要攻克了检出在接触抗性因子前已产生的自发突变株的难题，终于解决了这场纷争。第21页，讲稿共28页，2023年5月2日，星期三变量试验又称波动试验或彷徨试验。1943年，S.E.Luria和M.Delbrück根据统计学原理，设计了左方的实验。1.变量试验fluctuationtest第22页，讲稿共28页，2023年5月2日，星期三2.涂布试验原理与变量试验相同，方法更为简便，且可计算突变率。第23页，讲稿共28页，2023年5月2日，星期三涂布试验中突变率的计算初始接种量：5×104

个/皿培养5小时，繁殖了12.3代，每个微菌落约含5100个细菌这时，每个平皿上的细胞数为：5100×5×104≈2.6×108个/皿在6个平板上，比接种时增加的细胞数为：

6×（2.6×108

5×104）=15.6×108在未涂布的平板上共发现28个突变，故突变率=28/15.6×108=1.8×108第24页，讲稿共28页，2023年5月2日，星期三3.平板影印培养试验（rep