分子标记辅助选择实验方法

分子标记筛选实验DNA提取的实验仪器与耗材准备：水浴锅，高速冷冻离心机，小型离心机，预冷的异丙醇，1.5ml的灭菌eppondorf管，50ml的灭菌离心管，70%的酒精，5M的KAc混合液，研钵，液氮，SDS抽取液，1MTri-HCl(pH8.0)，0.5MEDTA(pH8.0)，TE(pH8.0)(相关试剂配法见《分子克隆》，金冬雁等，1996)DNA小量提取法(SDS小量提取法)F2群体DNA采用SDS小量提取法，步骤如下：取新鲜水稻样本叶片2cm左右于1.5eppondorf管中，加入液氮，用电钻磨碎。每管磨碎的水稻叶片中加入700ul已预热至650C的SDS抽取液，迅速搅匀后置于65oC水浴30min。加入200ul预冷的5MKAc混合液，颠倒充分混匀，冰浴30min后，于4oC10000转离心4min，吸取上层液到另一准备好的1.5mleppondorf管中。加入等体积预冷的异丙醇，置于-200C30min后，4°C10000转离心4min。弃上清，加入70%乙醇清洗，上下颠倒混匀，小型离心机快速离心弃上清，倒扣晾十(注：晾十不宜太久，反止DNA难溶)。将晾十的DNA溶于100ulTE溶液中，4°C保存备用。DNA大量提取法(SDS大量提取法)亲本DNA和突变体DNA池、正常株DNA池采取SDS大量提取法，步骤如下：取每个水稻新鲜样本叶片羹，放入10ml离心管，加入液氮，用电钻磨碎。加入5ml已预热至65oC的SDS抽取液，迅速搅匀后置于65oC水浴20min。水浴20min后加入1ml5MKAc混合液，上下颠倒充分混匀，冰浴20min，冰浴期间要将离心管上下颠倒数次。加入等体积的氯仿，室温下以3000(10000rmp)的速度离心3min，吸取上清于另一准备好的50ml离心管中。加入等体积的异丙醇，轻轻摇晃，可以看见DNA絮状沉淀。用玻棒挑出DNA絮状物，用75%乙醇清洗两次，将乙醇到掉，晾十。将晾十的DNA溶于500ulTE溶液中，4°C保存备用。PCR扩增体系与反应条件3.1PCR反应体系终浓度Primerpair(4uM)2ul0.4uM10Xbuffer2ul1XbufferMg2(25mM)2ul2.5uMdNTPs(10mM)0.3ul133ulTaq酶(4u/ul)0.25ul1U/20ulDNA(20ng/ul)2ul1.5ng/ulSterilewater11.45ul总体积20ul3.2PCR反应程序94°C,4min94°C,45s55C（因具体引物而定）,45s'卜（32个循环）72,45s72C,10min—4C,保存聚丙烯酰胺凝胶电泳实验仪器与试剂：小型电泳槽及配套大小玻璃板，夹条、梳子、黑色的长夹子（full-lengthclamps）、灌胶底座（precitioncasterbase）、注射器及导管等部件。l6%丙烯酰胺，TEMED,10%过硫酸铵溶液，loadingbuffer（上样缓冲液），10XTBEbuffer（相关试剂配法见《分子克隆》，金冬雁等，1996））4.1制胶（6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶）将玻璃板洗净水平放置晾十后，再用含有酒精的纸巾将玻璃表面擦拭干净，晾十。小玻板水平放置，将两个夹条整齐地放于玻板两边，大玻板对应放上；然后夹上胶条，最好玻璃的边缘用琼脂糖胶封边，防止灌胶的时候漏胶，等琼脂糖胶十后，随后直接装上电泳仪上，将整个装置水平放置（用水平仪没定）。准备凝胶，按以下比例进行配置：每块板取6ml6%丙烯酰胺和24ml1XTBE，加入20ulTEMED和200ul10%过硫酸铵溶液（最好现配现用），在干净的小烧杯混匀。灌胶：用玻璃棒引流灌入胶液，当胶面前沿到达顶端即可停止灌胶。插梳子：将梳子的平端插入胶室约0.5cm即可。（注意观察是否有漏胶，要及时补胶）凝胶约1小时：若需过夜，用保鲜膜封住玻板的上端，或直接往电泳槽中加1XTBE缓冲液准备跑电泳。4.2电泳往电泳槽灌入约500ml的1XTBE，使缓冲液淹没小板玻璃，随后小心拔掉梳子，用注射器轻轻冲冼各加样孔。期间注意旋紧电泳槽螺丝，防止漏液。接通电极，开始预电泳，一般为恒压200V,10分钟。其间准备样品：5ulPCR产物+5ul上样缓冲液（loadingbuffer）o预电泳结束后，关闭电源，开始点样。点样之前再次冲冼加样孔，每个加样孔可加5ul的样品。电泳时，一般用200V。如发现散热太大，需用电风扇吹风散热。停止电泳：一般情况下，当漠酚蓝即将跑出胶的底部时，即可关闭电源开关，停止电泳。卸胶板时，首先将槽中的缓冲液通过放水孔（drainport）。小心卸下玻璃板。记住样本的起始点样孔。取出胶板后，先卸去橡胶长夹条，再轻轻地撬开大、小玻板，将凝胶进行后续的固定一银染一显色。4.3银染固定液，0.1M硫代梳酸钠，显影液的配制（使用前5小时配制），染色液的配制（使用前10分钟配制）（相关试剂配法见《分子克隆》，金冬雁等，1996）固定：用刀子轻轻地撬开玻璃板，将凝胶放入盛有100ml新配制的冰醋酸溶液（每100ml10%的乙醇加500Ml冰醋酸为一块板用量）的固定盒中，在摇床上轻摇5分钟。（固定液可保留）银染：放入20%硝酸银溶液银染液（1ml20%的硝酸银/100m