定量蛋白组学

定量蛋白组学：应用SILAC〔稳定同位素标记法〕争论和厚朴酚治疗肝癌细胞HepG2定量蛋白组学：应用SILAC(稳定同位素标记法)争论和厚朴酚治疗肝癌细胞HepG2和厚朴酚是植物厚朴中主要的活性成分之一ClsHl80，其构造式见Fig．2．1。有争论认为赐予厚朴酚对背部皮下移植及右厚朴酚对细胞增殖、诱导细胞凋亡的影响时觉察，添加100üM厚朴酚凋亡伴有caspasc活性增加，从而提示是caspas~依靠性途径。上述结著显示细胞毒性作用。浓度为loopg／mL时显著抑制HT-1080趋3．36％和3l％n[14-17]。国HL260细胞和白血病JurkatT觉察caspase-3caspase-2抑制剂减弱，另外觉察胞浆细胞色素C[18]RKO细胞的凋亡SVK血管肉瘤细胞也表现出诱导细胞凋亡的作用。2023年的一项争论觉察：BcI-XL的下调，线粒体细胞色素C的释放和caspase-3的活化都参与了和厚朴酚在人的鳞癌细胞CH27中引起的凋亡过程。我们知道肝纤维化治疗的目标就是期望能够逆转纤维化，并且通过诱导细胞凋亡选择性地去除活化了的星形细胞。Park]厚朴酚能够诱导鼠活化的星形细胞凋亡Battl~等的争论也证明对于B细胞性慢性亡Hib~sAmiMolt-4B细胞用和厚朴酚进展治疗可以产生生长抑制和诱导细胞凋亡变。Fig.2.1而发生的转变[1]。通过了解这些功能活动变化的过程，或许可以提醒[2过去，主要承受二维差异凝胶电泳(DIGE)技术分析蛋白质的差异表达。近年来进展起来的一种稳定同位素标记(Stable~sotopeLabeling)质谱分析技术，因其使用稳定同位素标记，使得质谱检[3-7]。2H1C、15N1O)的试剂标记与被分析肽段一样的肽段作为其内标物，被分析肽段则与正常的同种试剂(即其中全部元素的含量皆为自然丰度)结定。目前，各种不同的稳定同位素应用范围极广[8。1999cygi等建立了同位素亲和标签(isotope-codedaffinitylag，ICAT)技术，为进展定量蛋白质组学供给了一个宽阔的空间，ICAT试剂由3局部组成，既特异结合肽段中半胱氨酸残基(biotin剂分为28个氘原子，D8)8DO8个氘原子与8个氢原子分别标记的ICAT质量正好相差80a。ICAT技术在定量蛋白组学半胱氨酸的蛋白质；其次，ICAT500Da)在整个MS中性72个多肽相差8、含有216时与氧化很难区分，对定量和鉴定都带来难度；第四，一般ICAT定量的误差在200以内，但假设样品成分简单，定量误差会增大，并往往需要手工检查结果：第五，这种方法要获得完整的信息，最重要的是标记必需是特异效率是时间依靠性的，很少能到达80％以上。现在国外有很多报道另外一种定量蛋白组学的方法 n耵：SILAC(stableisotopelabe~ingbyaminoacidsincellculture)。码子。此方法有很多优点：第一，SILAC不像ICAT有化学标记的参与；其次，SILAC省去了亲和纯化这一简单的工作；第三，SILAC适用SILAC操作比较便利，并且相比照较廉价。Fig.2.2SILAICAT国内外对和厚朴酚争论比较多做了大量的争论，SILAC技术与质谱结合是一个很好的定量蛋白方法。本文用和厚朴酚作用于亮氨酸一d3HepG213-aetine蛋白为标准(由于13-actine是高度保守蛋白，不会被药物调控)，通过定量蛋白组学方法，确定出和厚朴酚调控的蛋白，根据蛋白功能及相关作用，找出和厚朴酚作用于癌细胞的作用机理。试验材料2-2-1人肝癌细胞株HepG2由本试验室供给。试剂和材料Sigma公司胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶(Tyrisin)：均购自美国GibieoBRL蛋白酶抑制剂(ProteaseInhibitorCocktailforusewithmammalioncallandtissueextracts)．购自Sigma-Aldrichmarker)：购MBIFerment,as公司。十二烷基硫酸钠(SDS)、丙烯酰胺(Acrylamide)、甘氨酸(Glycine)、19250(Coomassiebrilliantblue(3250)、DTT(二硫苏糖醇)：均购自美国Bio-Rad培育基用抗生素：青霉素、链霉素为国产注射用药。其他试剂均为进口或国产分析纯产品。试验仪器和设备AllegraTM25RCnatrifugBECKMANCOULTE超低温冰箱：MDF-792，SAra”O(-80”c)。恒温培育箱：CChlncubator，SANYO。高压灭菌锅：LaboAutoelave，SANYO。SANYO。倒置显微镜：CK2，Olympus。一般光学显微镜：CH-2，Olympus。pHDELTA320pHmeter，METTLERTOLEDO。电子天平：PL2023，AB265-S，METTLERTOLEDO。。脱色摇床：WD．9405B，北京市六一仪器厂。质谱仪：Waters-Q-TOF。试验方法：试验流程图：Fig.2.3Fig.2.3试验流程图试剂配置细胞培育所需溶液的配制〔1〕细胞培育基：DMEM培育其按产品说明，常规过滤除菌后，参加抗生素：青霉素100U／ml，链霉素100U／ml，4“C细胞保种液：DMSO(FBSl：920℃保存。0．25％胰酶消化液：0．25g胰酶溶解于100ml同时还可参加EDTA存。SDS-WesternblotTris25mmolLTrisbase192mmoFLSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳5％积层胶(2m1)：蒸馏水1．4ml，30％丙烯酰胺溶液O．33ml，1.0mol／LTris(pH6．8)0．25ml，10％SDSO．02ml，10％过硫酸铵O．02ml，TEMED0．002ml。SDS12％分别胶(7．5m1)：蒸馏水2．45ml，30％丙烯酰胺溶液3m1，1．5moFLTris(1pH8．8)1．95ml，10％SDS0．075ml，10％过硫酸铵0．075ml，TEIVIED0．003ml。(439mmoFL48mmoLTrisbase003％SDS(电泳级)，20％甲醇。(PBS)：137mmoFLNaCl，2．7mmoFLKCI，10mmoI／LNa2HP04，2m1110FLKH2P04，蒸馏水配制，用HCl调整溶液的pH7．4，保存于室温。PBST：含O．05％Tween20PBS。2~SDS100mmoFLTris·CI(PH6.8)，200mmoFL二硫苏糖醇(DTT)，40／oSDS(电泳级)，O．2％溴酚蓝，20％甘油。封闭液：5g脱脂牛奶溶解于100mlPBST儿强s·C1~pH9．5)，置于密闭容器室温保存。BCIP：50mgBCIP溶解于lml蒸馏水中，避光保存于4℃。(11)NBT：75mgNBT溶解于70％DMF(二甲基甲酰胺)lml光保存于4℃。生色底物混合液：75mg／mlNBT80gl，50mg／mlBCIP60ǖl20ml30考马斯亮蓝染液：45ml45ml10ml0．25gG250(14)0．02％Na2S203：20mgNa2S203溶解于100ml去离子水中，颖配制。去离子水后，再参加100ül40％甲醛混匀即可，最好颖配制。HepG2从液氮罐中快速取出装有HepG2的冻存管，让HepG2能快速通过对细胞有损害的．50“C～0“C马上将冻存管放置于37℃恒温水浴箱中，摇动冻存管，使其20-60sec在超净工作台中翻开冻存管，将细胞悬液用巴氏吸管吸出到无菌的离心管中，参加2mlDMEM2023g，3min。2ml培育基重悬细胞，将细胞悬液接种到250ml的玻璃培育瓶中，参加颖DMEM培育基15ml37℃C02孵箱中培育。培育24h，待大局部细胞贴壁后，更换颖的培育基连续培养。细胞计数制备细胞悬液：倾去培育基，用0．25％胰酶消化液消化并／ml。用吸管吸取少量细胞悬液，滴在计数室边缘的斜面上，让细液注入量不要过多或过少，计数室内不应有气泡产生。(10×物镜)，计数4个大格中的细胞数。如细胞压在格线上时，则数上不数下不数右。(44)104HepG2取一瓶HepG2细胞，倒置显微镜下观看，如细胞已长成致密单层，即可进展细胞传代。l～2ml0．25％胰酶消化液，转动培育瓶，使其浸润整个细胞层，置室温下消化3～5min。倒置显微镜下观看细胞，当细胞由长梭形收缩变为圆形，细胞之间消灭间隙，并且可见有细胞漂移到培育液中时，可以终止现针孔大小空隙时，即可终止消化。参加2～3ml培育基于培育瓶中终止消化，吸取瓶中培育液混匀，将细胞悬液吸取到无菌离心管中，室温，2023g，离心3min。(4)弃上清．参加4ml2×106／mt)，lml接种到1250ml15ml3712C02孵箱中培育。4～51倒去细胞培育液于废液缸中，参加l～2ml0．25％胰酶消化液进展消化，制备成细胞悬液。2023，离心3mi弃上清，加2ml5×106／m1)。再将细胞悬液分装到两个消毒的冻存管中，每个lml，盖紧管盖，并做好标记o先将冻存管置于4℃冰箱4h，然后移入液氮罐的气相液氮中放置lh(-196℃)中冻存(这样能获得较高的复苏率)。HepG2用刮取的方法收集生殖期与维持期的Hep02用PBS或者生理盐水清洗2～3次，留适量液体于瓶内，然后用特制的细胞刮棒朝一个方向刮取细胞并用生理盐水将残留于瓶内的细胞洗下。将细胞悬液转移到离心管，4℃，2023g，离心3min。-80“C备用。MTT黄色的噻唑兰，简称MTT，可透过细胞膜进入细胞内，活细胞线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性MTT复原犯难溶于水的蓝紫色的针状Formazzn(DMSO)溶解，用酶联免疫检测仪在490mim．波特长测定其光吸取值，可间接反映细胞数量。试验步骤：收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，分于96孔板，每孔180ü1，3000—1000037℃、5％C026—24参加不同和厚朴酚量，培育12—36小时。留神吸去上清80ü1颖DMEM20ulMTF溶液(5mg／m1，0.5％MTT)，连续培育4h。然后吸掉上清，每孔参加150u1二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min490呦处测量各孔的吸光值。MTTMTT、二甲基亚砜)，每组设定3复孔。计算抑制率=[(比照一空白)一(给药一空白)]／(比照一空白)X100％。流式细胞检测细胞凋亡及周期用适量的和厚朴酚治疗Hep02细胞，在适当的时间收集细胞检测。(1)将细胞悬液和访瓶内的细胞1-2x106收集到离心管中。(2)用PBS(PH=7．2)300g离心5清夜。(3)将细胞放置于2-3ml冷70％乙醇中，混匀，保存于4℃。(4)上机检测。细胞裂解与样品制备n町选用RIPA裂解体系，使用前4“C预冷。取出收集好的HepG2细胞，按8mg／ml的浓度参加RIPA裂解液，同时参加蛋白酶抑制剂(PMSF)20(t07个细胞总蛋白≈1．0mg)125mRIPA裂解液，cocktail)2m。裂解体系冰上放置30～40min。6次，每次10~20sec，中间间隔10-20sec，低温(4℃)下进展。裂解混合物于4℃，15,000r／min，离心15min，认真吸取上清液于另一1..5mI离心管(El”管)中，冰上放置。参加与上清液等体积的2xSDS凝胶加样缓冲液，沸水中煮样3～5min，即可进展SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，或者-80℃保存备用。(1Bio-Rad配制好12％lcm)。用微量移液器留神地在丙烯酰胺溶液上掩盖一层去离子水或饱和正丁醇。将凝胶垂直放置于室温下。min)，倾去掩盖层液体，用去离子水洗涤凝胶顶部2～3次以除去未聚合的丙烯酰胺，尽可能捧去凝胶上的液体，再用滤纸吸净残留液体。配制好5％的积层胶溶液，在已聚合的分别胶上直接灌注积层胶，马上在积层胶溶液中插入干净的梳子，留神避开混入气泡，将凝胶垂直放置于室温下。电泳装置上，上、下槽各参加Tris-甘氨酸电泳缓冲液。加样与电泳将制备好的样品按每个加样槽20山的量进展加样，留神缓慢、均匀地将样品加到加样槽中，不行过快及用力过大槽中溢出。将电泳装置与电源相接，80V电泳15min后，溴酚蓝前沿进入分别胶，再把电压提高到120V，连续电泳直至溴酚蓝到达分别胶2h)，关闭电源。卸下玻璃板，用拨胶片撬开玻璃板，在凝胶下部切去一角以标注凝胶的方位。1DSDS．(SDS(1)SDS凝胶制好后，开头加样。加样挨次依次为：蛋白质分子量标准品，正常比照免疫沉淀样品，卵巢癌患者免疫沉淀样品；加样量均为20gl。其余全部不用的样品孔中加上等体积的lxSDS凝胶加样缓冲液。5山，在做银染时取1ul，剩余的体积由lxSDS开头电泳，80V电泳15min后，提高电压到120V，连续电泳2h)。凝胶考马斯亮蓝染色(G250染液中，放在平缓摇动的摇床上，室温，染色过夜。其次天将凝胶浸泡在去离子水中脱色，染液回收备用。室温4～8h或者脱色过夜，其间要更换去离子水3～4次。脱色净。扫描己染色的凝胶，保存结果，并分析比较正常比照免疫沉处理与分析。质谱鉴定和生物信息学分析膏白条带的切取和保存用去离子水漂洗胶2次，并用色谱纯甲醇和去离子水冲洗1．5ml(EP使用无菌手术刀片，沿着差异条带的边缘，留神认真准确地将蛋白条带切割下来，放入EP在EP管中将蛋白条带切成约lmm3子水漂洗2EP-80℃保存。留意事项：尽量避开皮肤和头发的角蛋白污染，在操作过程中应戴一次性的PE不要将胶长时间存放于乙酸溶液中。EPWesternblotcaseinBSA2．3．11．2(massspectrometry，MS)lm)置于EP100mmol/L碳酸氢氨：乙腈(1：1)的溶液，37℃振摇30min。重复此步骤直到完全脱色，之后倾出液体，加50ul乙腈并使胶脱水l0-15min。假设胶块没Speed~Vac中完全枯燥(低温状态，15min)。在50mmoFL包含测序级胰酶的碳酸氢氨溶液中再水化。酶的储存液是在25ug的胰酶中加250u10.1(15ul)被储存在4℃下。活性酶溶液的制备是每份15ul加100ul的50mmol/L碳酸氢氨溶液，终浓度是13ng/ul。参加约20ul的胰酶溶液于胶块中(充分再水化后的胶块)并放置在4℃下再水化45-60min，移走过量的胰酶溶液加入少量的50mmol/L(10-20ul)使胶块在酶解过程中保持浸润，37℃孵育1h，然后室温下过夜。颖配制10mg／锄的甜氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA1ul基质和样品混合液于靶上，让靶自然枯燥，最终将靶装入质谱仪。(337nm,3nspulsewidth,3Hzrepetitionrate)，离子延迟提取100ns，Gridvoltage68％，真空度为4e-008，质谱信号的单次扫描累加150次，842.512211.1046作为内部标准校正。RT.PCR收集Hel~2细胞，离心沉淀细胞，每5-10x106个细胞参加1mlTrizol将上述细胞的Trizol裂解液转入到EP管中，在室温下放置5在上述EP管中，依据lmlTrizol0．2ml氯仿的量参加氯仿，盖上EP管盖子，在手中用力振荡15秒，在室温下放置2-3分钟后，120230g(415取上层水相置于的EP管中，依据lmlTrizol0．5ml异丙醇的量参加异丙醇，在室温下放置10分钟，120230g(412)离心10分钟。lmlTrizol加lml75％~7500g(4℃)离心5让沉淀的RNARnase-freewaterRNA引辅的配爿与扩征将所合成的目的基因和GAPDH上下游引物(1OD)用0.1％DEPC水溶解。依据各个引物分子量的不同，计算加0.1％DEPC水的量。(3)目的基因和GAPDH上下游引物所加的0.1％DEPC水量分别为:488ul，431ul20pmol/ul。RT—PCR(25u1)：无酶:14.4ul；AMVBuff5ul：dNTP：0.5ul：目的基因上游引物：0.75ul：目的基因下游引物：0.75ul：GAPDH0.75uGAPDH0.75uMgS04TflDNAPoly0.5ul；RNA0.8ul；将上述各成分混匀并掩盖石蜡油20p1，标注号码后放入基因扩增仪内。58℃60s，68℃2min共4068℃延长7min。扩增产物进展电泳或一20℃冻存。RT-PCR取6蛆RT-PCR产物与l眦上样缓冲液混合后上样于孙琼脂糖0.8ulLadd0.5XTBE75my2／3后，紫外灯下观察，扫描、拍照并进展图像分析。图像分析处理系统进展辉度扫描Q心DH校正作相对量分析，数值以两者之积分吸光度的比值表示。Westenblot2.3.1311DSDS-(SDS聚丙膏触凝胶电泳)(1)SDS凝胶制好后，开头加样。加样挨次依次为：蛋白质分子量标准品，正常比照免疫沉淀样品，卵巢癌患者免疫沉淀样品：加样量均为20mIxSDS凝胶加样缓冲液。5m，在做银染时取lul，剩余的体积由1×SDS开头电泳，80V电泳15min，提高电压到120V，连续电泳直至溴酚蓝到达分别胶底部(约需要2h)。蛋白质从凝胶转移至固相支持体剪取与凝胶一样大小的硝酸纤维素膜和6层滤纸，将膜与滤PVDF膜，则要将PⅥ)F膜在甲醇中按转膜电极板阴极至阳极方向，按类似“三明治”的放法，分别整齐叠放三层滤纸、凝胶、硝酸纤维素膜和三层滤纸，并用软铅笔在膜的一角作好标记，认真去除残留在各层间的气泡。冰浴中，100V，60min。两曩纤维曩瞑的封闭、抗体的孵育及显色转膜完毕后，逐一掀去各层，把凝胶转移至盛有考马斯亮蓝角以免铅笔标记被抹去。用PBS10~15mi5(w/v)脱脂奶粉的PBST封闭液中，室温振摇1h。PBsT漂洗膜3次，每次5~10min。将膜按对应的10个泳道切成10个条带，每个条带依次放入清，其余9道分别参加不同的9个卵巢癌患者血清。每道血清按1：500稀释即4山血清与2mll％(w，v)脱脂奶粉的PBST，室温水平振荡，至少孵育2h4℃过夜。PBST漂洗膜3次，每次5~10min。用含1％〔w/v〕脱脂奶粉的PBST稀释的二抗(1:30000鼠抗IgG，APlh。(2ulPBST漂洗膜35～10min。往槽子中参加BCIP/NBT制，30min10～20min，认真观看显色。当蛋白条带的颜色到达要求后，用PBS洗膜3～5min，再用滤纸吸干膜上液体，照相保存试验结果。挑出免疫印迹条带差异较大的硝酸纤维素膜条带应的血清做免疫沉淀。结果和厚朴酚对HepG2细胞增殖的影响和厚朴酚体外外抑制HepG2作用时间呈正比。如Fig.3所示，我们用5、10、15、20ug/ml的和厚朴酚作用HepG25、8、12、24、72小时，观看和厚朴酚对HepG2llepG2具有很强的抑制作用，从Fig.2.310ug/m1的和厚朴酚在24小时作用下，HepG2Fig-2.4104接种于9637℃C02510、15、20ug/mlHepG25、8、12、72和厚朴酚对HepG2细胞周期的影响HepG25、10、15ug/ml浓度和厚朴酚作用24小时，流S期有下降Fig.增加。这些结果进一步说明和厚朴酚引起HepG22.1HepG2不同浓度和厚朴酚作用细胞24小时后，收集细胞，用70%无水本，求其平均值。Fig.2.5HepG2不同浓度和厚朴酚作用细胞24小时后，收集细胞，用70%无水乙DMSO；(A)比照组；(B)2.5(C)5u咖l(D)10ug/ml用稳定同位素标记HepG2细胞d3SiremaDMEM的亮氨酸，用同位素标记的培育基传代细胞。收集传代的细胞50kD左右的条带(β-actine)提取Fig.5第七代时，通过质谱Mode-TOF检测，细胞标记到94.3％：细胞传代到第十代时，细胞完全被同位素标记。HepG2细胞 M 同位素标记的细胞Fig.2.6收集正常H印G2细胞与同位素标记细胞RIPA白，上10％SDS聚丙烯酰胺凝胶，先用80V电泳15rain压到120V，G250染色至过夜，然后脱色，经成像扫描仪扫描成像Fig.2.7A:同位素标记HepG2细胸第七代提取蛋白的β-actine质谱鉴定；b:同位素标记HepG2β-actine2．4．4分别收集一满方瓶HepG2细胞和一瓶经l0ug/ml浓度和厚朴酚作用24小时的同位素标记的HepG2RIPA裂解方法提取蛋白。承受DCY=0.104+0.052xHepG2细胞提取蛋白浓度：A=3.46mg／ml：10ug／ml浓度和厚朴酚作用24小时的同位素标记的HepG2细胞提取蛋白浓度：B=4.35mg／mlA与B按l:l浓度混合上一维电泳，切取Il-actineESI-MS-MS检测。从Fig.7中可以看出：A与B1.lFig.2.8β-actine条带质谱图正常HepG2细胞和经10ug/ml浓度和厚朴酚作用24小时的同位素标记的HepG2细胞提取取蛋白按1:1Mascot“://www/matrixscience“://www/matrixscience网站上进展结果查询的β-actine条带。总蛋白鉴定将正常H印G210ug／ml用24小时的同位素标记的HepG2细胞提取的蛋白按1:l维凝胶电泳(如Fig.2.9)将胶条切割成假设干小条带，胰酶提取肽段。将提取的肽段用乙腈和O．1％的三氟乙酸溶解，用ESI-MS-MS验证蛋白。Fig.2.9HepG21:1正常HepG2细胞和经10ug/ug/ml浓度和厚朴酚作用24小时的同位素标记的HepG2细胞分别提取蛋白后,上10%SDS用120V电泳15min后，提高电压到250V，结业续电泳直至溴酚蓝到达分别胶底部，用G250染色至过夜，然后脱色，经成像扫描仪扫描成像获得的混合物肽片段质量数据通过Mascot搜寻引擎进展检索，在“://matrixscience/“://matrixscienceFig.2.1白质。Fig.2.10应用Mascota，Mascot搜寻主页。登陆“://matrixscience/“matrixscience网站，进入MascotSearchPeptideMassFingerprint，点击进入。b，PMF搜寻主页。进入PeptideMassFingerprint检索网页后，选择NCBInrcarbamidomethylOxidatioM〕和Pyro-glN-term；最大允许肽质量误差为0.1Da，每个肽允许有1个不完全裂解位点。C，检索结果。得d具体相符肽段及氨基酸序列。被和厚朴酚调控蛋白的鉴定β-actine-d3峰强度比较，计算出定量蛋白的误差范围为+-4。对于其他蛋白，同样依据质谱鉴定的肽段，将-d3峰强度比较，平均每个质谱鉴定出的肽段HepG2细胞蛋白中共鉴别了290Fig.2.11白的调控度。2．4．7将全部质谱鉴定的蛋白从swisspot数据库中，打出相应的蛋白功能HepG2细胞所引起凋亡相关的蛋白〔如下表。2.1蛋白名称

定量调控 功能蛋白肽Gi1801893Mass:146306 Sc0re:58 2 下调MarkerforlivercelllineagesQueriesmatched:7Leucine-richPPR-motifcontainingprotein

47.0%

repredented bythe cellline.Gi17706485Mass：80246Score:541下调MitochondrionQueriesmatched:2TNFreceptor-associatedprotein129.1%playandimportantroleintheinductionofapoptosis[H0mosapiens]Gi14759080Mass:73670 Score:931下调MitochondrialQueriesmatched:360.8%InvolvedintheoxidationofSuccinatedehydrogenasecomples,subunitA,flavoproteinsuccinateprecursor[Homosapiens]gi1226021Mass:67394 Scre:663下调ImportantintheregulationQueriesmatched:343.0%ofcellgrowthanddivisionGrowthregulatednuclear68proteinGil307066Mass:55885 Score:67 1 上调InvolvedintheregulationofQueriesmatched:213.3%cellgrowthInosine-5-monophosphatedehydrogenase(EC1.1.1205)Gi131645 Mass:36202 Score:7889上调Cythoplasm important roleQueriesmatched:69Glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase〔12〕23.0%in regulanting the switchbetweendifferentpathwaysforenergyproductionGi15031857Mass:36950 Score:2615下调Cytoplasm,Queriesmatched:1528.7%Playsakeyrole intumorIactatedehydrogenaseA[Homosapiens]maintenanceGi156967119Mass:36631 Sc0re:3996上调MitochondrionQueriesmatched:17(8)20.8%Regulating mitochondrialChainB,SteructureOfHumanAnnexinA2respiration activity and inInThePresenceOfCalciumIonsagingGi11245769Mass:51917 Score:59Queriesmatched:4Fattyacidsynthase:FAS[H0mosapiens]Gi162088088 Mass:86325 Score:103Queriesmatched:7TransferringreceptorvariantGi1119360Mass:92696 Score:109

1 下调Cell membrane interface34.4% incoming signals to thereorganizationof the actincytoskeletonatthepaaxmamembrane promote neuriteoutgrowth5 下调Cellmembrane41.7%4 下调EndoplasmicreticulumQueriesmatched:11Endoplasminprecursor(Heatskockprotein90 kDabetamember1)(94kDagluose-regulatedprotein)(GRP94)(gp96homolog)(Tumorrejectionantigen1)

24.2%

MolecularchaperonethatFunctionsintheprocessingAnd transport of proteinsGi11082886Mass:75694Score:80 1 下调Transmits its message toQueriesmatced:8Tumor necrosis factor type 1 associatedproteinTRAP-1-human

31.4%

signaltransductionpathaysGi121264428 Mass:73920 Score:318 5 下调MitochondrionQueriesmatched:11Stress-70protein,mitochondrialprecursor(75Kdaglucosr-regulatedprotein)(GRP75)(Pertide-bindingprotein74)(PBP74)(Mortalin)(MOT)

23.6%

ImplicatedinthecontrolofcellproliferationandcellularagingMayalsoactasachaperoneGi15031875Mass:65153 Score:104Queriesmatched:7LaminA/Cisoform2[Homosapiens]

3 下调Innernuclearmembrane17.3%Gi124660110Mass:60976Score:723下调mitochondrialQueriesmatched:8(5)29.1%ATPsynthase,H+transporting,mitochondrialF1complex,alphasubunit,precursorGi1181400Mass:53656 Score:2055下调HelpstolinkthecontractileQueriesmatched:10Cytokeratin853.3%apparatus to dystrophin atthe costameres of striatedmuscleGi132189394Mass:56525 Score:95714下调Queriesmatched:45(16)42.6%ATPsynthase,H+transportingm,mitochondrialF1complex,brtasubunitprecursor[Homosapiens]Gi155959290Mass:22741Score:1033下调RegulatesphospholipaseA2Queriesmatched:325.9%activityAnnexinA1[Homosapiens]Gi118645167Mass:38780 Score:114

下调Basement

membraneQueriesmatched:5AnnexinA2[Homosapiens]

51.4%

Calcium-regulatedmembrane-bindingproteinQi11718024Mass:25002 Score:114

下调Cytoplasm/

CytoplasmicQueriesmatched:6

33.4%

vesicle

regulation ofPeroxiredoxin-6(EC5)(AntioxidantProtein2)(1-Cysperoxiredoxin)(1-Cysprx)(Acidiccalcium-independentphospholiaseA2)(EC3.1.1-)(aGo;32455266Mass:21918 Score:76

phospholipidturnover20 下调CytoplasmQueriesmatched:7Peroxieredoxin-2(EC5)(Thioredoxin

42.4%

Participateinthesignalingcascadesof growthfactorsperoxidase 1)

(Thioredoxin-dependent

and tumor necrosisperoxide

reductase

1)(Thio1-specific

factor-alaphaantioxidantprotein)(TSA)(PRPPCR在上述所选取的与细胞凋记相关的蛋白中，我们选择RasGTPase-activating-likeproteinIQGAP1(p195)与94kDaglucose-regulatedprotein(GRP94)进展PCR进展验证。首先我们设计他们的引物，RasGTPase-activating-likeproteinIQGAP1〔p195〕的引物为：IQGAP1-F：CCCAGAACAAGTCAAACCAAGIQGAP1-R：GTTTGCTTGCCTCTCCTGTC94kDaglucose-regulatedprotein(GRP94)z上物为：HSP90B-1-