第三章蛋白质研究技术

第三章蛋白质研究技术

第一节蛋白质的分离纯化第二节蛋白质的鉴定第三节蛋白质的检测第四节蛋白质的结构分析本文档共77页；当前第1页；编辑于星期三\10点26分第一节蛋白质的分离与纯化

一、蛋白质分离纯化的基本原则二、蛋白质分离纯化的方法本文档共77页；当前第2页；编辑于星期三\10点26分

蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化概图本文档共77页；当前第3页；编辑于星期三\10点26分一、蛋白质分离纯化的基本原则

1、选择丰度高、便于提取的材料（磷酸单脂酶,肝、胰、脾丰富，但选几乎不含磷酸二脂酶的前列腺）2、了解目的蛋白质的稳定性（肝素材料的冷冻和干燥）3、探索有效的抽提和浓缩方法

(包括细胞破碎，抽提系统，浓缩：沉淀、吸附、超滤、透析、冻干等)4、建立一套层析组合方法和检测方法

（如吸附、离子交换、亲和层析、凝胶过滤；纯化评价）5、包装、贮存方法（生产日期、批次、含量或效价）本文档共77页；当前第4页；编辑于星期三\10点26分二、蛋白质分离纯化的方法粗提：1.盐析:固体加入法：饱和溶液加入法:2.有机溶剂沉淀:3.结晶（10-50mg/ml）

4.等电点沉淀精提：1.离心（centrifugation）2.电泳（electrophoresis）

3.层析（chromatography）注：S1:原饱和度；S2：预期饱和度；S3：加入液饱和度。V：欲加入体积（ml）；V0：原液体积本文档共77页；当前第5页；编辑于星期三\10点26分1.离心（centrifugation）

原理：悬液中的各种粒子（细胞，细胞器及大分子）有不同质量（mass）或密度（density），故在离心场中有不同沉降速率。

蛋白质分子量差别很大，密度差别很小（不超过15%）。蛋白质的平均密度是1.37g/cm3。结合蛋白密度差异较大。沉降系数（sedimentationconstant）：颗粒在单位离心力场中粒子移动的速度（S）。本文档共77页；当前第6页；编辑于星期三\10点26分离心（centrifugation）

①.差速离心（differentialcentrifugation）②.速率区带离心（rate-zonalcentrifugation）本文档共77页；当前第7页；编辑于星期三\10点26分①.差速离心（differentialcentrifugation）

利用不同物质沉降速率的差异，通过离心速度差异分离不同质量颗粒的离心技术。

从组织匀浆中将可溶性的蛋白质与不溶性成分分开。离心后，蛋白质留在上清液（Supernatant）中，其他成分形成沉淀（Pellet）本文档共77页；当前第8页；编辑于星期三\10点26分细胞成份的差速离心分离离心力

时间本文档共77页；当前第9页；编辑于星期三\10点26分②.速率区带离心（rate-zonalcentrifugation）

也称平衡密度梯度离心，根据颗粒在介质中的沉降速度差异分离目标颗粒的方法。蔗糖、甘油或氯化铯形成密度梯度；超速离心机（≈40,000r/min）离心后，分离物分布在相应的密度区带内；本文档共77页；当前第10页；编辑于星期三\10点26分

注意：控制时间：太短，不能充分分离；太长，分离物沉淀到离心管底部。不能精确测定分子量，因为蛋白质的形状差异影响沉降率；一次分离多种不同类型聚合物或颗粒的最有效方法

多用于分离细胞器，ＤＮＡ本文档共77页；当前第11页；编辑于星期三\10点26分2.电泳（electrophoresis）

带电颗粒在电场中的移动速度的差异,从而将其分离。由电荷–质量比决定。按支持物:移动界面电泳,聚焦电泳,区带电泳（凝胶、线丝）等按电泳装置:水平平板,垂直平板,圆盘,双向电泳,毛细管电泳，脉冲电泳。本文档共77页；当前第12页；编辑于星期三\10点26分①SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-polyacrylamidegelelectrophoresis，SDS）②等电聚焦（isoelectricfocusing，IEF）③双向电泳（two-dimensionalgelelectrophoresis）④脉冲电泳（pulsed-fieldgelelectrophoresis）常用的电泳方法本文档共77页；当前第13页；编辑于星期三\10点26分①.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-polyacrylamidegelelectrophoresis，PAGE）凝胶丙烯酰胺（acrylamide），甲叉双丙烯酰胺（methylenebisacrylamide）聚合而成；T%=(a:单体g;b:双体g;m:溶液体积)凝胶孔径：选择丙烯酰胺浓度，甲叉双丙烯酰胺胶联剂的浓度；C%=(a:b=19:1)凝胶有分子筛效应。a+bm100%ba+b100%acrbis本文档共77页；当前第14页；编辑于星期三\10点26分SDSSDS（sodiumdodecylsulfate）阴离子洗涤剂，几乎能破坏天然蛋白质中所有的非共价键，使亚基解聚(巯基乙醇)，使多肽链呈伸展状态，消除了蛋白质构形对迁移率（migrationrate）的影响；SDS以1:2的比例与肽链中的氨基酸残基结合，使变性蛋白质带上大量的净负电荷，而且电荷量与蛋白质分子量（即肽链长度）成正比。所以分子量成为决定蛋白质迁移率的唯一因素。本文档共77页；当前第15页；编辑于星期三\10点26分SDSSDS分离的蛋白质可以用Coomassieblue染色，也可银染（silverstain）SDS能分离分子量差异小于10%的蛋白质用于蛋白质纯化和分子量近似值测定本文档共77页；当前第16页；编辑于星期三\10点26分②.等电聚焦（isoelectricfocusing,IEF）在凝胶上加入一种两性电解质（ampholyte），电泳时会形成连续的pH梯度电泳后，各种蛋白质停留在与其等电点（pI）相同的位置IEF能分离pI值仅相差0.01的蛋白质（即一个净电单位）等电聚焦本文档共77页；当前第17页；编辑于星期三\10点26分电泳过程中不连续电泳的三种效应：浓缩效应，分子筛效应电荷效应本文档共77页；当前第18页；编辑于星期三\10点26分③.双向电泳（two-dimensional

gelelectrophoresis）分离分子量差异很小的蛋白质

双向电泳=IEF+SDS

第一向：根据电荷差异用IEF分离第二向：根据分子量差异用SDS分离本文档共77页；当前第19页；编辑于星期三\10点26分双向电泳（two-dimensionalgelelectrophoresis）IEFSDS本文档共77页；当前第20页；编辑于星期三\10点26分双向电泳（two-dimensionalgelelectrophoresis）

蛋白质可用染色法（银染、考马斯蓝

）或放射自显影进行检测；斑点挖取做质谱鉴定。本文档共77页；当前第21页；编辑于星期三\10点26分④.脉冲电泳（pulsed-fieldgelelectrophoresis）用于分离大片段DNA（20kb-10Mb）在电场中，大片段DNA以伸展的方式进行移动断电后，DNA分子卷曲成不规则形状。DNA从伸展到卷曲所需要的时间与其长度成正比然后改变电泳方向90°或180°再次通电如此反复进行，逐步把不同大小的DNA分开本文档共77页；当前第22页；编辑于星期三\10点26分3.层析（chromatography）原理：溶液中的分子能与固体表面进行结合及解离，但由于蛋白质在分子量、带电性和结合特异性方面的差异，导致与固体表面结合与解离的难易程度不一样，所以流动的速度也不一样。

固定相的性质决定被分离蛋白的分离效率流动相固定相本文档共77页；当前第23页；编辑于星期三\10点26分凝胶类型及型号与蛋白质分子量葡聚糖与多孔琼脂糖珠共价交联（吸水量是型号1/10）琼脂糖凝胶丙烯葡聚糖凝胶本文档共77页；当前第24页；编辑于星期三\10点26分层析（chromatography）①.凝胶过滤层析（gelfiltrationchromatography）②.离子交换层析（ion-exchangechromatography）③.亲和层析（affinitychromatography）本文档共77页；当前第25页；编辑于星期三\10点26分

①.凝胶过滤层析（gelfiltration

chromatography）

分离分子量有差异的蛋白质；多孔小珠由聚丙烯酰胺（polyacrylamide）、葡聚糖（dextran）或琼脂糖（agarose）组成；葡聚糖颗粒大分子

小分子本文档共77页；当前第26页；编辑于星期三\10点26分凝胶过滤层析小分子进入颗粒凝胶内部，而大分子被排阻在外，因此小分子在层析柱中流动速度慢，从而把混合物按不同分子量分开可根据洗脱体积（elutionvolume）估计蛋白质分子量，分子量大洗脱体积小。本文档共77页；当前第27页；编辑于星期三\10点26分基本原理凝胶上柱后，颗粒外的外水体积（Vo），颗粒内体积称内水体积（Vi），颗粒中胶的体积（Vg），因而，总的柱床体积（Vt），Vt=Vo+Vi+Vg，Vg可忽略。Vt=Vo+Vi。当进行洗脱时，某一溶质的洗脱体积（Ve）就取决于Vo，Vi和在两相中的分配系数（kd）Ve=Vo+kd·Vi

本文档共77页；当前第28页；编辑于星期三\10点26分①当kd=0时,Ve=Vo，溶质全从Vo出来，无分配。②当kd=1时,Ve=Vo+Vi,溶质全进筛子，各物质尽管有分配，但各物质不能分开。③当0<kd<1时,Ve=Vo+kd·Vi各溶质具不同分配，以得到分离。若已知某一物质的kd，可据上式计算它的洗脱体积（Ve）也可用溶质洗脱峰处的洗脱体积来测量。用此法来分离介质是以下述三种形式来描述的：本文档共77页；当前第29页；编辑于星期三\10点26分②.离子交换层析（ion-exchange

chromatography,IEC）分离所带电荷不同的物质，离子交换的支持物称为离子交换剂。

离子交换剂分三部分：高分子聚合物基质、电荷基团和平衡离子

离子交换剂包括：离子交换树脂（anionexchangeresin）和离子交换纤维素（cationexchangeresin）,如DEAE-cellulose和CM-cellulose。

不同的蛋白质与交换剂有不同的亲和力，因而可用不同盐浓浓度或pH值的buffer洗脱洗脱示意图结合洗脱曲线本文档共77页；当前第30页；编辑于星期三\10点26分离子交换层析（ion-exchangechromatography）本文档共77页；当前第31页；编辑于星期三\10点26分③.亲和层析（affinitychromatography）亲和层析：利用分子与其配体间特殊的、可逆性的亲和作用而进行分离的一种层析技术。配体：抑制剂、活化剂、辅酶（辅基）、底物及类似物、抗体、受体等（如外源凝集素、金属离子等）；上柱结合：与配体特异结合的蛋白质被滞留在层析柱中，其他(杂质)成分流出；洗脱：加入过量的配体、配体类似物或改变洗脱液浓度（或pH）使结合的蛋白质被顶替下来。本文档共77页；当前第32页；编辑于星期三\10点26分杂质溶液偶联亲和层析的基本要素本文档共77页；当前第33页；编辑于星期三\10点26分亲和层析本文档共77页；当前第34页；编辑于星期三\10点26分金属螯合层析法（MCAE）固定相本文档共77页；当前第35页；编辑于星期三\10点26分4.膜蛋白的分离方法

膜蛋白：指与生物膜镶嵌、结合或附着的一系列蛋白质。2004年蛋白质数据库的3D提交物已超过22,000个，但几乎都为可溶性蛋白，只有不到1%是膜上发现的蛋白质。膜蛋白是一种难以分离和纯化的蛋白质。蛋白质从质膜中分离时，暴露出来的疏水区相互作用，引起蛋白质聚集、沉淀.去污剂（detergents）是一种两亲分子，能嵌入到磷脂双层（phospholipidbilayers）中，破坏质膜。其疏水部分与烃基结合，亲水部分与水结合，因此可使脂质和蛋白质增溶（Solubilization）.本文档共77页；当前第36页；编辑于星期三\10点26分几种去污剂去污剂包括两类：非离子型（nonionicdetergents）如TritonX-100、辛基葡萄糖离子型（ionicdetergents）如脱氧胆酸钠、十二烷基硫酸纳本文档共77页；当前第37页；编辑于星期三\10点26分低浓度时，去污剂以游离形式存在于溶液中。随着浓度的增加，它们聚合在一起，形成微团（micelles）.微团很小、圆球状聚集物。其亲水部分向外，疏水部分向内。

临界微团浓度（criticalmicelleconcentration，CMC）：去污剂开始形成微团时的浓度，为去污剂的特征常数本文档共77页；当前第38页；编辑于星期三\10点26分离子型去污剂:除了能与膜蛋白的疏水区结合外，还能结合水溶性蛋白质的疏水核心。由于它们带电，所以能够破坏蛋白质中的盐键和氢键,使蛋白质变性。非离子型去污剂:比离子型温和，不同浓度有不同作用方式高浓度（>CMC）时，与磷脂、膜蛋白一起形成微团.

低浓度（<CMC）时，虽然不形成微团，但仍能与大部分膜蛋白的疏水区结合，起增溶作用.本文档共77页；当前第39页；编辑于星期三\10点26分大部分膜周边蛋白（peripheralprotein）是可溶性。它们借离子键或其他弱键与特定的膜蛋白结合，因此可用高浓度的盐或能与二价阳离子（如Ca2+）结合的试剂进行分离。开发既保持膜蛋白的天然结构，又高产和高纯度纯化方法是人们的期待。（Novagen新开发TM-PEK:ProteoExtract膜蛋白抽提试剂盒）本文档共77页；当前第40页；编辑于星期三\10点26分第二节蛋白质的鉴定

一、分子量测定二、等电点测定三、末端氨基酸残基测定四、蛋白质分子中的糖链五、蛋白质分子中的脂

本文档共77页；当前第41页；编辑于星期三\10点26分一、分子量测定

１.渗透压（osmoticpressure）２.沉降平衡（sedimentationequilibrium）３.凝胶过滤层析（gelfitrationchromatography）４.SDS５.激光解吸电离飞行时间质谱（LDI-TOF-MS）本文档共77页；当前第42页；编辑于星期三\10点26分1.渗透压（osmoticpressure）同时测定几个不同浓度的渗透压，以π/c对c作图并外推到蛋白质浓度为零,得截距,从而求出M。为避免pH值的影响,在溶解度允许的范围内,尽量采用等电点或接近等电点的缓冲液，并增加溶液中无机盐的浓度。可以测分子量在1－10万范围的蛋白质。实验装置简单，准确度高。但不能区别溶液中蛋白质分子是否均一。本文档共77页；当前第43页；编辑于星期三\10点26分2.沉降平衡（sedimentationequilibrium）用较低的速度离心（8,000-20,000r/min）离心开始后，颗粒发生沉降，造成浓度梯度，同时产生扩散作用。扩散力与离心力作用方向相反，相互平衡公式：本文档共77页；当前第44页；编辑于星期三\10点26分3.凝胶过滤层析（gelfitrationchromatography）公式：logM=K1-K2Ve

Ve：洗脱体积先测出几种标准蛋白质的Ve

，以它们的logM对Ve作图得一直线，再测出待测样品的Ve，即可从图中确定蛋白质的分子量.样品可以是不纯的。只要它具有专一的生物活性（或标准样），借助活性找出洗脱峰位置，确定它的洗脱体积就能测定它的分子量.本文档共77页；当前第45页；编辑于星期三\10点26分4.SDS公式：logM=K1-K2µR

以几种标准单体蛋白质分子量的logM对其µR值作图，根据待测样品的µR，从标准曲线上查出它的分子量。本文档共77页；当前第46页；编辑于星期三\10点26分SDS用以分析蛋白质的分子量本文档共77页；当前第47页；编辑于星期三\10点26分5.激光解吸电离飞行时间质谱（laser

desorptionionization-timeofflight-mass

spectrometry,LDI-TOF-MS）高纯度蛋白质与有机酸混合，在靶金属表面干燥.激光射线使蛋白质离子化，离子经加速后，飞入自由漂移区，最后到达检测器。飞行时间与分子量成反比，与电量成正比。可测定10-15-2×105的蛋白质，误差仅为0.0001。本文档共77页；当前第48页；编辑于星期三\10点26分二、等电点测定溶解度法等电聚焦（IEF）

IEF原理IEF测pI本文档共77页；当前第49页；编辑于星期三\10点26分三、末端氨基酸残基测定用于未知蛋白质一级结构研究和基因工程表达产物的末端分析N-terminus氨基酸残基测定C-terminus氨基酸残基测定本文档共77页；当前第50页；编辑于星期三\10点26分

N-terminus氨基酸残基测定化学法二硝基氟苯法（Sangerreaction）

（DNFB+肽→DNP-肽）丹磺酰氯法（DNS-Cl）异硫氰酸苯酯法（Edman降解法）（氨基末端→苯乙内酰硫脲衍生物）酶法氨肽酶法（aminopeptidase）氨基酸层析图谱本文档共77页；当前第51页；编辑于星期三\10点26分C-terminus氨基酸残基测定

化学法

肼解法（hydrazinolysis）无水肼100℃处理，释放C端aa

酶法羧肽酶法（carboxypeptidase）选择合适的酶浓度及反应时间,得单个C端aa

本文档共77页；当前第52页；编辑于星期三\10点26分四、蛋白质分子中的糖链血球凝集反应（植物凝结素）糖蛋白电泳（甲苯胺兰、R山兰、schiff试剂）糖组分分析（薄层层析、液相色谱、红外分析）本文档共77页；当前第53页；编辑于星期三\10点26分五、蛋白质分子中的脂

苏丹黑预染、电泳本文档共77页；当前第54页；编辑于星期三\10点26分第三节蛋白质的检测一、抗体检测二、WesternBlotting三、放射性同位素标记法

本文档共77页；当前第55页；编辑于星期三\10点26分一、抗体检测

多抗（polyclonalantibodies,通常以抗血清的形式存在）是指不同种类抗体的混合物，能识别抗原分子中的多个抗原决定簇（epitopes）。单抗（monoclonalantibodies）指的是同种抗体，识别抗原分子中的特定抗原决定簇。单抗由一定数量的相同细胞产生。这些细胞来源于同一杂交瘤细胞（hybridoma;脾:瘤细胞融合）。抗体可以检测表面只相差一个残基的蛋白质。借助特殊的分析试剂可对蛋白质进行精确定量或定位（免疫细胞化学、染色质免疫共沉淀、WesternBlot

）。本文档共77页；当前第56页；编辑于星期三\10点26分抗体检测两级抗体：一抗和二抗。一抗特异的与抗原结合，二抗除了与一抗结合外，还带有检测标记。检测标记：如荧光、放射性、化学发光、显色基团及酶（如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶，催化无色物质生成有色物质）。ELISA-enzyme-linkedimmunosorbentassay本文档共77页；当前第57页；编辑于星期三\10点26分ELISA本文档共77页；当前第58页；编辑于星期三\10点26分ELISA结果本文档共77页；当前第59页；编辑于星期三\10点26分二、WesternBlotting灵敏度高，用于检测极微量的蛋白质（Findaneedleinahastack.大海捞针）

与SDS、antibody、enzyme联合使用本文档共77页；当前第60页；编辑于星期三\10点26分WesternBlotting本文档共77页；当前第61页；编辑于星期三\10点26分三、放射性同位素标记法

放射性同位素的掺入不影响分子的性质。选择合适的同位素：根据实验目的和放射性同位素的特征（如半衰期、放射产生的能量及能否进入细胞等）进行选择。放射自显影：用感光材料进行感光，如X光胶片，液体乳胶。然后肉眼或显微镜观察，可半定量。定量测定：用计数器（counter），如盖革计数器（Geigercounter）、液闪计数器（scintillationcounter）。分析生物大分子在细胞内的定位及运动。本文档共77页；当前第62页；编辑于星期三\10点26分第四节蛋白质的结构分析一、蛋白质一级结构的测定二、已知序列肽链的人工合成三、蛋白质构象的确定本文档共77页；当前第63页；编辑于星期三\10点26分一、蛋白质一级结构的测定

－Edmam降解法（PTH法）

N末端氨基与苯异硫氰酸酯(PITC)在弱碱性条件下,形成相应的苯氨基硫甲酰衍生物，后者在硝基甲烷中与酸作用发生环化，生成相应的苯乙内酰硫脲(PTH)－AA,而从肽链上降解,产物可用气-液色谱法进行分离鉴定。

本文档共77页；当前第64页；编辑于星期三\10点26分HPLC分析氨基酸本文档共77页；当前第65页；编辑于星期三\10点26分二、已知序列肽链的人工合成人工合成肽：结构分析、抗体制备、活性肽功能、新蛋白研究。

抗体制备：在动物体内，10-15个残基的小肽能刺激机体产生抗体。从而对蛋白质进行分离、检测及细胞内定位。

新蛋白研究：分析末端AA,反推核苷酸,合成引物,PCR获得基因或ORF,BLAST分析,同源性比对;蛋白质特征及功能分析。本文档共77页；当前第66页；编辑于星期三\10点26分tBOC:叔丁氧羰基，保护氨基酸氨基端.CF3COOH:三氟乙酸，去保护DCC:二环己基碳二亚胺，缩合剂HF:氢氟酸，把肽链从聚苯乙烯小株上断裂下来挂接去保护缩合去保护断裂肽链人工合成本文档共77页；当前第67页；编辑于星期三\10点26分三、蛋白质构象的确定1.X射线结晶（X-RayCrystallography）2.冷冻电镜术（CryoelectronMicroscopy）3.核磁共振（Nuclearmagneticresonance,NMR）本文档共77页；当前第68页；编辑于星期三\