第六讲基因工程

第六讲基因工程1第一页，共四十八页，编辑于2023年，星期五二、基因工程中常见的工具酶将目的基因片断从细胞内提取，需要基因的剪刀——限制性内切酶。将目的基因与运载体DNA连接，需要基因的针线——DNA连接酶。3.合成第二条cDNA链或用于标记DNA——大肠杆菌DNA聚合酶第二页，共四十八页，编辑于2023年，星期五限制性内切酶分布：主要在微生物中。特点：特异性，即识别特定核苷酸序列，切割特定切点。结果：产生黏性未端（碱基互补配对）。举例：大肠杆菌的一种限制酶能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的切割点上将DNA分子切断。目前已发现的限制酶有200多种。第三页，共四十八页，编辑于2023年，星期五限制性内切酶作用过程点击播放第四页，共四十八页，编辑于2023年，星期五DNA连接酶连接酶的作用：DNA连接酶是将碱基互补配对的两个黏性末端连接起来，封闭DNA链上的缺口，使之成为一个完整的DNA分子

连接的部位：可以催化DNA链上的5-PO4与3-OH生成磷酸二脂键。可用于将目的基因与载体的DNA连接起来。

第五页，共四十八页，编辑于2023年，星期五DNA连接酶的作用过程点击播放第六页，共四十八页，编辑于2023年，星期五基因工程载体作用：将外源基因送入受体细胞。条件：能在宿主细胞内复制并稳定地保存。具有多个限制酶切点。具有某些标记基因种类：质粒、噬菌体和动植物病毒。

要让一个从甲生物细胞内取出来的基因在乙生物体内进行表达，首先得将这个基因送到乙生物的细胞内去。载体是能将目的基因片段送入宿主细胞的工具，在基因工程中可与包含目的基因的外源DNA片段连接构成重组体，并将重组体导入宿主细胞。

第七页，共四十八页，编辑于2023年，星期五基因工程中常用的载体细菌或酵母的质粒：环状双链小分子DNA，适于做小片断基因的载体。

最常用细菌质粒：大肠杆菌质粒pBR322λ噬菌体：线状双链DNA，适于做大片断基因的载体,是最常用的噬菌体。第八页，共四十八页，编辑于2023年，星期五质粒的特点质粒是细菌、真菌及少数其他生物细胞中自然存在于细胞染色体外能自主复制的DNA分子，大部分为小型环状双链DNA。

细胞染色体外能自主复制的小型环状DNA分子；质粒是基因工程中最常用的运载体；最常用的质粒是大肠杆菌的质粒；存在于许多细菌及酵母菌等生物中；质粒的存在对宿主细胞无影响；质粒的复制只能在宿主细胞内完成。基因工程中常用的受体细胞为细菌及动植物细胞等。

第九页，共四十八页，编辑于2023年，星期五三、基因操作的基本步骤目的基因的寻找、获得

构造重组DNA分子

将目的基因导入受体（通过转化或转染）并进行扩增（复制表达和遗传）对受体细胞进行筛选和鉴定，筛出含有重组DNA的细胞通过发酵、细胞培养等手段最终获得所需要的产物，并进行分离纯化，或者获得所需要的遗传性状。

第十页，共四十八页，编辑于2023年，星期五典型基因工程过程示意图①从细胞中分离出DNA①②③④⑤⑥②限制酶截取DNA片断③分离大肠杆菌中的质粒④DNA重组⑤用重组质粒转化大肠杆菌⑥培养大肠杆菌克隆大量基因第十一页，共四十八页，编辑于2023年，星期五1、提取目的基因将需要的基因从供体生物的细胞内提取出来。取出DNA用限制酶切断DNA

目前被较广泛提取使用的目的基因有：苏云金杆菌抗虫基因、人胰岛素基因、人干扰素基因、种子贮藏蛋白基因、植物抗病基因等。第十二页，共四十八页，编辑于2023年，星期五将总DNA提取分离，然后用限制性内切酶将总DNA切开成为许多小的片段，将这些基因组片段分别克隆在载体上，便构成该生物的基因文库。一般用与目的基因部分序列互补并标记了放射性同位素的一小段单链DNA作为探针对克隆的基因文库进行杂交，互补结合需要的基因片段，根据放射性同位素在胶片上感光的原理，可以找到目的基因。这个办法通常称为印迹法。

工作量很大（1）直接从生物体中提取总DNA，构建基因文库，从中调用目的基因。（如果不知道目的基因的核酸顺序）第十三页，共四十八页，编辑于2023年，星期五印迹法内切酶切开DNA电泳印迹转移放射性探针杂交胶片显影第十四页，共四十八页，编辑于2023年，星期五印迹法的主要步骤：

（1）基因文库－DNA用限制性内切酶处理。

（2）DNA片断混合物通过电泳分离。

（3）电泳后，通过印迹技术转到酯酰纤维薄膜上，以便操作。

（4）用已知小片断DNA作为探针，互补结合需要找的基因片断。

（5）探针DNA片断已用放射性元素标记，使胶片感光后可看出。第十五页，共四十八页，编辑于2023年，星期五

印迹法的关键是“分子杂交”，利用碱基配对的原则，用一段小的已知的DNA片断去寻找大的未知的基因片断。

探针DNA片断从何而来？

根据目的蛋白的氨基酸序列，只要其中N端15－20个氨基酸序列，按三联密码转为40-60核苷酸序列，人工合成，即为探针DNA片断。第十六页，共四十八页，编辑于2023年，星期五（2）逆转录合成法（如果所需要的DNA片段很小）以RNA为模版，逆转录合成互补的DNA片段。先将细胞核内的基因组转录为RNA，以信使RNA（mRNA）为模板，在逆转录酶的作用下根据碱基互补原则人工合成一段与之互补的DNA片段，再以此单链DNA为模版，人工合成另外一条互补的DNA子链，从而获得所需的目的基因。mRNA→单链DNA→

双链DNA（cDNA）

DNA合成仪第十七页，共四十八页，编辑于2023年，星期五（3）聚合酶链式反应（PCR）（如目的基因的核酸顺序已知）聚合酶链式反应（PCR）是近年来开发出来的基因工程新技术，它的最大优点是把目的基因的寻找和扩增，放在一个步骤里完成。反应在特制的PCR仪中进行，需要DNA模版、引物、TaqDNA聚合酶、四种脱氧核苷酸。

PCR扩增仪第十八页，共四十八页，编辑于2023年，星期五基因克隆是指通过重组基因操作，把目的基因连接到载体上，在宿主细胞中增值，从而产生遗传物质和状态的转移和重新组合。

克隆——生物分子，细胞,生物个体的无性繁殖与复制过程都称为克隆。PCR反应分三步完成：

第一步——变性（DNA解链），在95℃高温下，使作为模版的双链DNA片断因变性而解链成单链DNA。第二步——退火（引物与单链DNA结合），将温度降至55℃下，部分引物DNA与模版的单链DNA的特定互补部位相互配对结合。

第三步——延伸（分别合成互补链），将温度回升到72℃下，由DNA高温聚合酶催化，以目的基因为模版，使合成的新链延伸，形成互补的DNA双链，获得所需要的目的基因。

第十九页，共四十八页，编辑于2023年，星期五2、构造重组DNA分子

以质粒作载体为例用与提取目的基因相同的限制酶切割质粒使之出现一个切口，将目的基因插入切口处，让目的基因的黏性末端与切口上的黏性末端互补配对后，在连接酶的作用下连接形成一个环形的重组DNA分子。提取质粒并用限制酶切割用连接酶将目的基因和质粒连接第二十页，共四十八页，编辑于2023年，星期五目的基因与质粒的连接第二十一页，共四十八页，编辑于2023年，星期五3、将目的基因导入受体细胞并扩增基因工程中常用的受体细胞有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌和动植物细胞等。转化是指外源DNA分子或片段被细菌细胞吸收，并整合进细胞染色体的遗传现象，若受体细胞是动/植物细胞，通常称为转染。导入受体细胞常用的方法是借鉴细菌或者病毒侵染细胞的途径。通常还要对一些受体细胞进行增大通透性的处理。（氯化钙或高压电脉冲打孔）目的基因可以随着受体细胞进行快速的繁殖，在很短的时间内获得大量的基因。将目的基因导入受体细胞将受体细胞进行扩增第二十二页，共四十八页，编辑于2023年，星期五4、目的基因的检测（1）克隆基因的凝胶电泳检测

将克隆了目的基因的重组质粒从受体细胞中分离出来，选择合适的限制性内切酶对其进行酶解，采用凝胶电泳法检测酶解片段。

凝胶电泳法是用于分离、纯化、鉴定DNA片段的常用方法，DNA片段上的磷酸基团都带有负电荷，当不同长度的DNA片段装入琼脂糖凝胶一端后，DNA分子便向阳极运动，不同长度的DNA片段就会表现出的不同迁移速率，可根据DNA分子大小来使其分离，通过分子质量标准参照物和示踪染料与样品一起电泳而得到检测。

第二十三页，共四十八页，编辑于2023年，星期五

（2）Southern杂交对于外源目的基因在转基因生物中的情况检测好可采用放射性同位素标记的核酸杂交法进行检测，也称为该法是利用毛细管作用使在凝胶电泳中分离的DNA片段转移并结合在合适的滤膜上，然后通过与已用同位素标记的单链DNA探针的杂交作用以检测这些被转移的DNA片段。第二十四页，共四十八页，编辑于2023年，星期五（3）核苷酸测序法（自动检测分析）。

已知目的基因的核苷酸序列可利用序列测定进行鉴定。该方法是一种使用荧光染料的无放射性标记的DNA测序法。它使用4种不同颜色的荧光染料分别标记4种不同的碱基，并在一个凝胶电泳的泳道中进行电泳，然后通过激光作用诱发荧光，达到检测碱基的目的。激光检测器招收集到的信息传到电脑，计算机会自动显示或打印出碱基顺序。一块凝胶36个泳道可测36×450约16200个碱基。后来又发明了一种用毛细管电泳代替凝胶电泳的方法，可大大加快电泳的速度分辨率，并可实现自动灌胶和自动进样。第二十五页，共四十八页，编辑于2023年，星期五四、基因工程的应用

基因工程技术已经在医学、工业、农业等各个领域得到了广泛的应用。

1、微生物基因工程（1）在制药方面

生产新的抗生素，提高产量基因工程被用于大量生产过去难以得到或几乎不可能得到的蛋白质－肽类药物。第二十六页，共四十八页，编辑于2023年，星期五重组人胰岛素1982年世界第1个转基因产品1000磅牛胰10克胰岛素200升发酵液10克胰岛素将与产人胰岛素有关的两个基因片段（人工合成的）转入大肠杆菌重组干扰素1200升人血1升发酵液（重组大肠杆菌）2－3万美元/病人200－300美元/病人第二十七页，共四十八页，编辑于2023年，星期五（2）生产生物小分子

生产维生素C替代合成法。

提高氨基酸产量（将某些基因转入高产菌中）

（3）生产生物多聚体

生产黄原胶、生物合成橡胶、生产生物可降解塑料第二十八页，共四十八页，编辑于2023年，星期五（4）在生物农药上的应用

通过基因改造大规模生产微生物杀虫剂、生物除草剂。

（5）在环境工程中应用

美国GE公司构造成功具有巨大烃类分解能力的基因工程菌，并获专利，用于清除石油污染。第二十九页，共四十八页，编辑于2023年，星期五（6）转基因植物

抗病虫基因、抗除草剂基因、抗旱基因、抗病基因、抗寒基因、某些动物蛋白基因。

目前世界上大规模种植的转基因作物有：

水稻、大豆、马铃薯、玉米、番茄、烟草、棉花、油菜、甜菜、向日葵、豌豆、辣椒、苜蓿、苹果、梨、兰花、玫瑰、康乃馨

在植物转基因中多采用农杆菌作为目的基因受体，再利用重组农杆菌感染植物细胞进行转化，将目的基因整合到植物基因中。第三十页，共四十八页，编辑于2023年，星期五（7）转基因动物

转基因动物主要用于生产器官移植的研究，生产对人类有价值的产品，使动物具有某些可遗传的抗性对付某些疾病与不良环境，目前出于对安全性考虑，禁止将转基因动物进入食品。

目前将人的某些基因转入动物，生产某些蛋白类药物已经广泛实施。一般动物转基因多采用受精卵注射法，将目的基因直接注射入动物的受精卵中，有一部分生产出的动物细胞内含有这些目的基因。还有胚胎干细胞法，将目的基因转化胚胎干细胞，再进行胚发育，一旦成为生殖细胞，可获得稳定的遗传。第三十一页，共四十八页，编辑于2023年，星期五转基因食品

随着转基因作物的普及，目前世界已经有很多食品中含有转基因成分，如食用油、土豆泥、番茄酱、豆制品，海关检测表明60%的进口食品中含有转基因成分。

转基因食品的安全性

目前世界上尚未发现转基因食品对人类健康的危害，但是安全性仍然需要长期监测。

各国制定了相关法规，中国《农业转基因生物安全管理条例》、《农业转基因生物标志管理办法》（包括大豆、玉米、油菜、番茄及其加工产品）第三十二页，共四十八页，编辑于2023年，星期五五、基因和人类基因组计划(HGP)人类基因组计划产生的背景人类基因组计划意义图谱绘制仅是第一步基因研究是把双刃剑第三十三页，共四十八页，编辑于2023年，星期五二、人类基因组计划产生的背景

现代自然科学的发展使人类成为地球上的主宰，但人类对自身的认识和保护却不尽如人意。全球约有20%-50%的人每天备受各种慢性疾病的折磨；我国11%的人患有高血压；4.2%人有不同程度的残疾；2.5%的人智力低下；肿瘤、心血管疾病等主要死因已成为驱除不掉的幽灵；艾滋病、疯牛病等新的传染病使人们对未知灾难又有了新的恐惧。人类对人体自身的奥秘知之甚少，有鉴于此，研究人类基因组，揭示人类基因的奥秘，认识人类的遗传信息并进而了解人类各种疾病与基因的相互关系，从而达到从根本上预防人类疾病发生以及有效根治疾病。第三十四页，共四十八页，编辑于2023年，星期五何为基因组计划？

如果把人类基因组比喻为一本有10亿单词的百科全书,这本书可分为23章，每章为一个染色体。而每一个染色体上又包含数千个被称为基因的“故事”。这些故事由一系列3字母单词组成，其中每个单词是4个基本化学即字母即：G，C，A，T这4种碱基的任意排列组合。人类基因组计划正是要读出这30亿个碱基，也就是测出人体所有染色体30亿碱基对的排列顺序。第三十五页，共四十八页，编辑于2023年，星期五

最早提出HGP这一设想的是美国生物学家、诺贝尔奖得主Dulbecco。他在1986年3月7日出版的Science杂志上发表了一篇题为“肿瘤研究的一个转折点：人类基因组的全序列分析”的短文，提出包括癌症在内的人类疾病的发生都与基因直接或间接有关，呼吁科学家们联合起来，从整体上研究人类的基因组，分析基因序列。这一倡议争论了两年，美国国会于1990年批准了这一项目，计划耗资30亿美元，15年完成。第三十六页，共四十八页，编辑于2023年，星期五人类基因组计划任务与意义

人类基因组计划的主要任务是：找出人体的约10万个基因，确定30亿个碱基对的排列顺序，进行数据分析，认识人类的遗传信息。其意义在于揭示人类基因的奥秘，并进而了解人类各种疾病与基因的相互关系，从而达到从根本上预防人类疾病发生以及有效根治疾病，生命现象将在分子水平得到解释。

1990年，国际人类基因组计划正式启动，美、日、德、法、英等国参与，1999年，中国也加入了，负责1%的工作。2000年6月26日，人类有史以来第一个基因组草图终于完成了。

第三十七页，共四十八页，编辑于2023年，星期五●有史以来最大的科学成就●人类生命科学的里程碑,生命科学的“登月计划”，其意义不亚于人类登上月球的“阿波罗计划”。26日公布的工作草图中包含人体90%以上碱基对的位置信息，这足以帮助科学家掌握人类生命密码的主要框架结构。第三十八页，共四十八页，编辑于2023年，星期五基因革命，未来让人们看到具体的成果人类基因组研究所所长柯林斯认为，图谱的最大用途是可以用于医疗诊断。今后医生可以把病灶告诉有遗传倾向的人，让他们设法避开日后发病的危险。美国国家人类基因组研究所对未来25年做了预测：

2-3年内绘制出覆盖率为100%的序列图，同时制订有关法律；2002-2010年，对癌症、糖尿病等疾病将出现相关基因的检测试验，对血友病将出现临床基因治疗方法；2015年，将研究出适应个人基因组合的治疗方法，可治疗包括癌症在内的很多疾病；2025年，医生将有能力修复基因缺陷，某些如贫血之类的先天性疾病从此将成为历史。到2050年,许多病症将会在症发前就被消灭。第三十九页，共四十八页，编辑于2023年，星期五

人类还有5000多种遗传病以及与遗传密切相关的各种病患要赖于基因治疗。这其中包括最常见的肿瘤、糖尿病、贫血、高血压、精神病等。基因组计划给了我们一个光明的未来：弄清人类各种疾病的根源，破解生命的所有奥秘。将来，修改或替换致病基因应该不是梦想。许多疾病将从地球上消失。眼前的例子是，色盲基因前不久已经被找到。人类可以根据“基因图”调整自己的生活方式，使自己处于最佳的生命环境中，延长寿命。

科学家把人的基因组中执掌胖瘦的基因也找出来了。未来胖子减肥和瘦子增胖都将是很容易的事情。第四十页，共四十八页，编辑于2023年，星期五工作草图是国际合作的结果

6个国家16个中心上千名科学家参加。其中，美国占54%，英国占33%，日本占7%，法国占2.8%，德国占2.2%，中国占1%。每个国家所占份额同该国生物产业水平成正比。人类基因组计划精神，即百慕大原则：所有的实验室或中心都应该把长度在1000个以上碱基对片段在24小时内递交给公共数据库。全球的科学家、产业界等可完全免费享用。第四十一页，共四十八页，编辑于2023年，星期五中国科学家做了什么？

1999年5月，中国加入这一研究计划，负责测定3号染色体上三千万个碱基对，中国因此成为参与这一研究计划的唯一发展中国家。中国科学家仅用半年时间就完成所承担的任务。

中国现在的测序能力排名第四，在美、英、日之后，在德、法之前。华大基因研究中心的测序能力在参与人类基因组计划的全世界16个实验室中，排名第七。中国今年五月份从美国引进了三十多台世界上最先进的基因测序仪。第四十二页，共四十八页，编辑于2023年，星期五是否参与“计划”的讨论持续了十年两种意见：△大多数科学家主张把有限的基金投入到基因组的下游工程——生物基因开发上。这是建立在上游工程——基因测序当选据公开、成果共享的基础上。如果所有的基因图谱都向外国买，中国买不起。21世纪两大支柱产业——信息产业的核心技术已被外国掌握，我们只能以市场以代价换技术。在21世纪，我们的健康需要人类基因组计划，我们的医药工业需要它，我们的农业、畜牧业都需要它。第四十三页，共四十八页，编辑于2023年，星期五△对虾病毒事例90年代中期我国对虾受病毒侵害,造成惨重损失。为了对付这种病毒，需要对病毒的基因组进行测定。然而当时中国没有这种能力做，只好委托外国公司做。这个工作量只相当于这次1%的1%，只需花30万元，而让别人来做花掉180万元不说，还要出让1/3的知识产权。1998年8月，中科院遗传所的“人类基因中心”挂牌，次年2月，中心决心搞基因组测序，创造加入国际人类基因组计划的条件。第四十四页，共四十八页，编辑于2023年，星期五※基因保护

比尔.盖茨说，第二个“比尔.盖茨”将出现在基因领域，为此他看好这一新领域，向