免疫组化的原理与操作

免疫组织化学Immunohistochemistry本文档共39页；当前第1页；编辑于星期二\9点55分概念：免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)是利用抗原抗体反应和组织化学呈色反应来检测组织和细胞中某种化学成分的一门技术,是传统的免疫学和组织化学相结合而发展起来的一门新兴学科，也叫原位免疫学（Insituimmunology）。特点或优点：（1）特异性强、灵敏度高；（2）可定性、定位、定量观察；（3）将形态学改变与功能和代谢变化结合起来；免疫组化概述本文档共39页；当前第2页；编辑于星期二\9点55分IHC不仅具有传统形态学（包括LM和EM水平）能对组织和细胞进行仔细、客观观察的优点（特别是经苏木精或伊红复染后），而且还克服了传统免疫学反应只能定性和定量（离体、液相），而不能定位的缺点。IHC则可在原位和固相对染色结果进行观察。目前IHC的定位可精确到亚微结构水平。

随着IHC技术的发展和图象分析技术的发展，IHC已进入多标记（双标记）和定量研究的阶段，使IHC在生物学和医学各领域的应用日益广泛，不仅用于研究，也用于诊断。IHC与核酸分子杂交相结合形成的原位杂交技术（insituhybridization，ISH）既特异性强、灵敏，又具定位、可视的特点。本文档共39页；当前第3页；编辑于星期二\9点55分——IHC技术源于免疫荧光术（immunofluorescence,IF），从1941年~1950年Coons等用了10年首创了

荧光素标记抗体技术——检测肺组织内的肺炎双

球菌，六、七十年代IF在科研中占据着主导地位——1968年中根一穗（Nakane）等创建了酶标抗体技

术（immunoperoxidase，IPO）——铁蛋白标记Ab技术;

——1974年Stemberger改良上述技术，建立辣根过氧

化物酶－抗体过氧化物酶（PAP）技术，使免疫

细胞化学得到广泛应用；一、IHC的发展简史本文档共39页；当前第4页；编辑于星期二\9点55分——80年代Hsu等建立了ABC法之后，免疫金—银染色法、半抗原标记法、免疫电镜技术相继问世。——90年代分子杂交技术、原位杂交技术、免疫细胞化学分类方法迅速发展；——2000年各种免疫组化技术更加成熟，使免疫组化技术成为当今生物医学中形态、功能代谢综合研究的一项有力工具。其应用范围深达医学各个学科，是目前生命科学工作者应该掌握的基本技术之一；——国内起步晚，从70s开始。本文档共39页；当前第5页；编辑于星期二\9点55分（一）方法学1.从传统的抗原、抗体反应（免疫反应）→亲和反应。新的亲和物质对有：生物素与卵白素（biotin&avidin)，葡萄球菌A蛋白（SPA）与IgG，凝集素与受体，激素与受体。这些亲和对亲和力强，且可与多种标记物（荧光素、酶、同位素、胶体金、铁蛋白等）结合，由此产生了亲和组织化学（affinityhistochemistry），这些方法特异性、敏感性、稳定性高，更方便、适于某些特殊观察（如EM）。2.从单一显示某种物质（单标记）→显示多种物质（双标记）。3.从LM→EM（超微结构）：免疫电镜、胶体金法、金银法。4.从定性→定量，图象分析（IA）、流式细胞术（FCM）。5.IHC与ISH相结合，可在不同水平检测DNA、mRNA、protein。6.原位PCR+IHC可在组织原位通过扩增检测微量目的DNA。7.趋于标准化、自动化。二、IHC的现状和发展前景本文档共39页；当前第6页；编辑于星期二\9点55分（二）技术分类

1.根据染色方式分成：①贴片染色②漂浮染色2.根据Ag-Ab结合方式分成：①直接法②间接法③多层法

3.按标记物的性质分成：①免疫荧光技术（免疫荧光法）②免疫酶技术（酶标抗体法、桥法、PAD法、ABC法）③免疫金属技术（免疫铁蛋白法、免疫金染色

法、蛋白A金法）本文档共39页；当前第7页；编辑于星期二\9点55分（三）标记物1.必要性：组织细胞内Ag-Ab结合反应一般是不可

见的，若在镜下检测，则必须具有可视性标记物。

2.常用标记物①荧光素：最常用的是异硫一氰酸荧光素（Fluoresceinisothiocyanate，FITC）---荧光显微镜下呈绿色荧光;四乙基罗达明（rho—damineRB200）---荧光显微镜下发橙红色荧光②酶：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶。③生物素：（Biotin）④铁蛋白金等：主要应用于免疫电镜。⑤其他：如同位素（因涉及污染和防护难一般不用）本文档共39页；当前第8页；编辑于星期二\9点55分（四）IHC的应用1.

只要是形态科学均可采用:包括病理学、神经科学、生物学、病原微生物的检测（病毒、细菌、寄生虫等）、皮肤病学、器官移植等。2.

可用于多种材料：A.各种组织（冰冻组织、formalin固定组织、石蜡包埋组织兼可）；B.各种细胞(穿刺、体液、涂片、血细胞、培养细胞等）。3.

用于诊断：肿瘤病理学等（大中医院）。4.

用于科研：临床和基础医学，尤其是形态学专业研究生常用IHC，或IHC+分生技术；最近几年，分子生物学研究异常活跃，但最终还要归到形态上来，用免疫组织化学方法对所研究的大分子进行定位，进而深入研究其功能。本文档共39页；当前第9页；编辑于星期二\9点55分（一）标本的收集与处理

IHC染色成功与否及其质量如何，除染色方法本身外，对材料的处理也至关重要，它包括：取材、固定、脱水、包埋、切片等。目的：保存好Ag的数量及活性、保持组织细胞的良好形态结构。材料的来源：人体及实验动物；细胞和组织；新鲜的及固定的。1、组织标本的取材与储存来源：活检取材、手术切除、实验动物组织等。要求：要快、要小（1×1×0.4cm），避免挤压。处理：冰冻→即用或保存；固定→即用或保存。三、样品的准备、处理本文档共39页；当前第10页；编辑于星期二\9点55分

2、细胞标本的取材与储存来源：血细胞、穿刺细胞、体液细胞等。处理：细胞多时直接涂片、干燥、固定、染色；细胞少需离心沉淀、涂片、干燥、固定、染色；对于体外培养细胞：贴壁生长细胞（内皮C、纤维C、神经C等）在培养皿底置载玻片；悬浮生长细胞需离心沉淀，再涂片、固定，即用或冰冻保存。

本文档共39页；当前第11页；编辑于星期二\9点55分

（二）固定（fixation）

1、固定的含义

固定是指以某种化学物质使蛋白质、酶类（变性）、脂质、糖类等物质保持在组织细胞原位，避免Ag溶解、扩散、丢失；保持组织细胞的正常形态结构。

根据Ag对固定剂的耐受性，可将其分为：不稳定Ag（如细胞表面Ag，不耐甲醛，宜用丙酮）、半稳定Ag及稳定Ag，后二者多为蛋白、肽类、酶类物质。固定有时间性，太短达不到固定目的，太长交联过度，封闭Ag。

本文档共39页；当前第12页；编辑于星期二\9点55分

2、常用固定剂及其用途1.10%的formalin（4%的甲醛formaldehyde）：以pH7.4的PBS配制，优点：穿透力强、固定快、组织收缩小；适于固定蛋白、肽类、酶、糖。IHC常用4%多聚甲醛polyformaldehyde灌注固定及后固定，时间4~6h。2.2.5%的戊二醛，同上。也可用2%戊二醛与2%多聚甲醛混合液固定，尤对超微结构保存好。醛类固定剂的缺点是易封闭抗原，必要时需抗原修复。3.70%的酒精（乙醇），优点：固定蛋白好，缺点：组织收缩严重；时间：2h。4.70%丙酮，优点：渗透快；缺点：对形态保存不好；用于对冰冻切片和细胞涂片的固定；时间：10min。5.混合固定液：Bouin液：40%PF250ml、冰醋酸50ml、饱和苦味酸250ml；还有PLP固定液，较适合免疫组化。6.四氧化锇（OsO4锇酸）：常用PBS配制1%锇酸溶液后固定1h，用于免疫组化及电镜观察。有强烈刺激，需在通风橱内操作。本文档共39页；当前第13页；编辑于星期二\9点55分（三）组织的脱水、浸蜡、包埋和切片

前三步只用于石蜡切片，冰冻切片和振动切片不需此步骤。切片可分为：石蜡切片：脱水、透明、浸蜡、包埋、切片5~7μm；冰冻切片：浸糖，20%~30%蔗糖4oC过夜，减少冰晶；OCT包埋；液氮速冻，减轻组织破坏。病理切片要薄，5~7μm；脑片通常

30~50μm厚。振动切片：不需做任何包埋，固定后的组织可直接用振动切片机做各种厚度的切片，并在染色后可进一步制作电镜标本观察。

本文档共39页；当前第14页；编辑于星期二\9点55分（四）防脱片剂

（1）

蛋白甘油，蛋清与甘油1：1搅拌、过滤、防腐；（2）1%的铬矾明胶涂片；（3）0.1%的多聚赖氨酸涂片，晾干备用。配制时用塑料瓶而不能用玻璃瓶；

（4）

购买商品化的进口硅化玻片；

（5）APES（氨丙基三乙氧基硅烷），1：50丙酮稀释，浸片20~30秒，晾干备用；贴片时要一步到位。本文档共39页；当前第15页；编辑于星期二\9点55分（五）抗原修复

近年兴起的新技术。目的：暴露被交联封闭的Ag。主要适用于经长期formalin固定的标本、石蜡包埋标本；也可用于冰冻切片。常用的方法有：（1）

微波加热切片煮沸10~20min，室温自然冷却，所用溶液有：①饱和NaCL溶液；②10mMpH6.0的枸橼酸钠缓冲液；③4M的尿素等；④pH8.0TBS;（2）高压锅处理将切片放入10mM、pH6.0的枸橼酸钠缓冲液容器中，置锅内加盖喷气3~10min，自然冷却。（3）酶消化处理：常用0.1%的胰蛋白酶（含0.1%CaCL2，pH7.8）37。C10min。或0.4%胃蛋白酶37。C30min;本文档共39页；当前第16页；编辑于星期二\9点55分

（一）基本染色方法

荧光素标记抗体：FITC、直接法TRITC等标记抗体法酶标记抗体：HRP、AP等

荧光素标记抗体间接法

酶标记抗体（三步法）

非标记抗体法：酶桥法、PAP法、APAAP法;

亲和组化法：ABC法、LAB法、LsAB法、BRAB法;

双重标记：阻断法（酸洗Ⅰ抗）、非阻断法（连续染）四、免疫组织化学技术本文档共39页；当前第17页；编辑于星期二\9点55分1．直接法

荧光素直接标记特异性抗体（一抗）上，标记抗体与抗原结合（在切片上）荧光显微镜下观察→检测抗原。

优点：简单，时间短，

特异性强。

缺点：灵敏度低，所

需抗体量大

（不经济）。

应用：基本不用了！！本文档共39页；当前第18页；编辑于星期二\9点55分2．间接法

荧光素标记在二抗上（二抗：抗产生一抗动物的IgG抗体）。※显色后镜检特点：1、敏感性较直接法高3-4倍，但特异性较低；2、不必标记每种一抗，只需标记某一种动物的二抗；3、一抗可高度稀释，节省一抗，且可用PBS代替一抗做空白对照。本文档共39页；当前第19页；编辑于星期二\9点55分3．非标记Ab桥法：

“桥法”是酶标记抗体的改进，经过三次抗体，其二抗为未标记桥抗体。（1）单桥法本文档共39页；当前第20页；编辑于星期二\9点55分(2)双桥法

在三抗之后，将二抗和三抗再重复一次，可增大染色强度。★特别提示：注意动物种属关系

特点：敏感性高，但酶浓度不好掌握；与组织非特异性结合的酶不易洗去，背景染色重。本文档共39页；当前第21页；编辑于星期二\9点55分4．过氧化物酶—抗过氧化物酶法（Peroxidaseanti-peroxidasemethod，简称PAP法）

是桥法的改良，用第二抗体作“桥梁”，先与第一抗体结合，再与PAP复合物联结，形成抗原—抗体—抗IgG抗体—PAP复合物，最后用底物显色剂显色。特点：灵敏度高，比间接荧光法敏感20倍，比间接酶标记抗体法敏感100倍本文档共39页；当前第22页；编辑于星期二\9点55分

5．亲和素-生物素-过氧化物酶复合物法（avidin-biotin-peroxidasecomplextechnique，简称ABC法）。

关键的程序步骤为3步：

Ag+Ab1+（Ab2-B）+AB★C

复合物（Ab2-B

为生物素标记的第二抗体）（B★为生物素标记的过氧化物酶）

AB★C复合物是avidin与酶联biotin在使用前30min配置，混匀。1个avidin分子结合了3个biotin分子，剩下1个结合点与2抗的生物素结合，avidin起桥联作用。本文档共39页；当前第23页；编辑于星期二\9点55分（1）ABC复合物的制备：（2）ABC法反应原理：特点：ABC法敏感性更高，比PAP法敏感20~40倍，背景也更清晰。本文档共39页；当前第24页；编辑于星期二\9点55分ABC法示意图本文档共39页；当前第25页；编辑于星期二\9点55分染色结果观察（BrdU）本文档共39页；当前第26页；编辑于星期二\9点55分

6、酶标亲和素-生物素技术（labelledavidin-biotintechnique，简称LAB法）。即用辣根过氧化物酶直接标记avidin，用biotin标记2抗。关键步骤为3步：

Ag+Ab1+（Ab2-B）+A★

（A★为HRP标记的卵白素）

A★与2抗的生物素结合，avidin起桥联作用。如将该法中的卵白素（avidin）变换成链霉卵白素(streptavidin)，LAB法即成LsAB法，或称SP法。据认为LAB法比ABC法敏感2~4倍，而LsAB法因链霉卵白素不与组织细胞中内源性生物素结合而特异性更高。现在SP法已趋于取代ABC法而广为应用。本文档共39页；当前第27页；编辑于星期二\9点55分生物素化Ⅱ抗AB复合物酶标链卵白素AvidinBiotinPeroxidaseⅠ抗组织抗原ABC法（3步完成）LsAB（SP）法（3步完成）本文档共39页；当前第28页；编辑于星期二\9点55分链霉卵白素酶生物素底物抗原SP法示意图本文档共39页；当前第29页；编辑于星期二\9点55分（二）免疫组化染色步骤（以ABC法为例）

1)、切片常规脱蜡至水：二甲苯虽然可以反复使用，但次数不宜多。乙醇的浓度是从高到低，与脱水时相反。

2)、灭活内源性酶：博士德推荐应用3%的双氧水，但实际操作中，使用30%双氧水和纯甲醇按1:9的溶剂比混合较为理想。

3)、抗原修复：暴露被交联封闭的Ag。

4)、正常山羊血清封闭：封闭时应该注意室温与时间的相对关系。室温低，时间就要长一些，反之亦然。另外，保持反应池湿润是重要的一环，否则，前功尽弃。后面的步骤也是如此。

5)、一抗反应：一抗的稀释度、孵育时间和温度与染色强度与背景有直接关系。一般说来，阳性染色强度不够时，可提高一抗浓度和延长孵育时间；背景过高时则相反。

孵育时间与温度：抗原抗体充分反应是得到可靠结果的关键。因此，控制温度与时间也是一个严肃的问题。由于室温控制较为困难，建议4℃冰箱过夜（≥18h）。本文档共39页；当前第30页；编辑于星期二\9点55分6)、二抗（生物素化IgG）反应：建议湿盒内37OC1h，另外仪器显示温度37℃，但实际只有23℃，自然结果难以令人满意。

7)、SABC染色（37℃）：这是博士德的人性化之处，直接就可以用。

8)、DAB显色镜下控时：DAB浓度应该比推荐的要低一些，这样可以便于控制反应时间以及在合适的时候中止反应。同时注意，使用后残余的DAB应妥善处理，而不是随便倒入下水道，因为它有致癌性。

9)、苏木素轻度复染：不建议使用。尽管复染后标本层次分明，但实际情况是，这样有时也会掩盖阳性结果，从而使前功尽弃。

10)、脱水透明：脱水乙醇的浓度由低到高，有一个较准确判断脱水成功与否的办法是：观察透明后盛二甲苯容器的壁，若发现白色雾状现象，则说明脱水不成功，应再次脱水。透明时间不要太长，1分钟左右就可以了。

11)、封片：封片时，中性树脂量宜少，同时注意不要产生气泡。本文档共39页；当前第31页；编辑于星期二\9点55分（三）免疫组化染色基本技术及注意事项1．实验计划根据课题的内容选用动物，选用配套的Ab。如Ab-I鼠抗人的抗体，与其他种属间无交叉，则不能用其他动物，而且Ab-Ⅱ必须是羊抗鼠，若PAP法Ab-Ⅲ必须来源于鼠，否则不能连接成复合物②若要比较染色深浅在对照组与实验组间的差异，在贴片方面最好贴于同一张载片上，否则无可比性。③选用的试剂可靠，货源充足，随时可取。本文档共39页；当前第32页；编辑于星期二\9点55分2．Ab稀释度（如系购买的药盒有工作液和原液）（1）工作液：无须稀释（2）原液：应参照其提供的工作液浓度进行预试验原液的保存（-20℃）冻存——应选最佳稀度冻存。③若工作浓度大于1∶500则要先将原液稀释十倍，而后分装10μl/瓶→冻存（-20℃）于冰箱备用。（3）Ab浓度的选择

Ab浓度不可太高或太低，因为Ag-Ab结合需在一定浓度范围内进行，若一方过剩则形成复合物小且少；极过剩时已形成的复合物亦会解体而呈现假阴性。