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文档简介

第3章基因突变与损伤DNA的修复

本文档共70页;当前第1页;编辑于星期二\12点35分基因突变的类型和符号常用的几个突变株突变发生的机理(自发突变,诱发突变)保证遗传稳定的机制(损伤DNA的修复)本文档共70页;当前第2页;编辑于星期二\12点35分第一节基因突变的类型和符号一、基因的符号

nodA(nodule结瘤基因A);nifA(nitrogenfixation固氮基因A);

trpA,trpB(tryptophan色氨酸);

trpA23,trpA46

(同一基因的不同突变位点);本文档共70页;当前第3页;编辑于星期二\12点35分leu-,strr;(营养缺陷,抗性)lacZ-

;(表型符号为正体LacZ);Δ(lac,pro);(缺失)trpA::Tn5

;(插入)E.coliJM109;

E.coliDH5α;

(菌株)E.coliJM109Δ(lac,proAB)trpA::Tn5

本文档共70页;当前第4页;编辑于星期二\12点35分二、基因突变的类型按照突变体表型特征不同分类:1、形态突变型,例如本文档共70页;当前第5页;编辑于星期二\12点35分2、营养缺陷型Ade-

3、抗性突变型Strr

4、致死突变型

5、条件致死突变型

6、产量突变型本文档共70页;当前第6页;编辑于星期二\12点35分按照突变所引起的遗传信息的改变分类:1、错义突变同一位置上的氨基酸改变

GAA(E)→AAA(K)

2、同义突变同一位置上的氨基酸不变

GAA(E)→GAG(E)3、无义突变碱基突变后形成终止密码子

GAA(E)→UAA(stop)本文档共70页;当前第7页;编辑于星期二\12点35分本文档共70页;当前第8页;编辑于星期二\12点35分1、碱基置换转换PyPy

PuPu

颠换PyPu转换比颠换更常见按照遗传物质的结构改变分类:本文档共70页;当前第9页;编辑于星期二\12点35分2、移码突变(编码区)ATCGAATTCGGGTATTTAATCGAATTCGGGTATTTACGAATCCGAATTCGGGTATTTAATCCGGAATTCGGGTATTTAATCCGAGAATTCGGGTATTTA本文档共70页;当前第10页;编辑于星期二\12点35分3、DNA片段插入和缺失

DNA大片段的缺失或重复,在放线菌中缺失范围从几个基因到几十个基因。本文档共70页;当前第11页;编辑于星期二\12点35分第二节常用的几个突变株营养缺陷突变株温度敏感突变株抗性突变株本文档共70页;当前第12页;编辑于星期二\12点35分例:供体E.coli(HfrStrs)受体E.coli(F-Thr-Leu-Thi-Strr)在含有链霉素和硫胺素的基本培养基只能分离到苏氨酸和亮氨酸的重组子本文档共70页;当前第13页;编辑于星期二\12点35分第三节突变发生的机理

(自发突变,诱发突变)

本文档共70页;当前第14页;编辑于星期二\12点35分1、自发突变

·碱基异构式引起DNA复制过程的错误

a)碱基异构式

C(氨基)C(亚氨基)

A(氨基)A(亚氨基)

G(酮式)G(烯醇式)

G(酮式)

G(烯醇式)

T(酮式)

T(烯醇式-2’)orT(烯醇式-4’)

1,65,6本文档共70页;当前第15页;编辑于星期二\12点35分本文档共70页;当前第16页;编辑于星期二\12点35分OH本文档共70页;当前第17页;编辑于星期二\12点35分本文档共70页;当前第18页;编辑于星期二\12点35分b)碱基异构式引起DNA复制的错配

本文档共70页;当前第19页;编辑于星期二\12点35分A(a)

T(k)

G(k)C(a)

正确配对

错误配对

G(k)T(e)

A(a)

C(i)

A(i)

C(a)

G(e)

T(k)

本文档共70页;当前第20页;编辑于星期二\12点35分A(a)

T(k)

C(i)

A(a)

C(i)

C(a)G(k)例如:环出效应转座子本文档共70页;当前第21页;编辑于星期二\12点35分环出效应本文档共70页;当前第22页;编辑于星期二\12点35分2、诱发突变

2-1物理诱变a)电离辐射诱变;

Co60(χ)(γ)ray

Cs137(χ)(γ)ray

H3(α)ray

P32,,S35(β)ray

卫星搭载诱变;

高真空,强辐射,微重力

(χ)(γ)ray穿透性

(外照射处理)

(α)(β)ray非穿透性

(内标记处理)

dNTP电荷及结构改变

本文档共70页;当前第23页;编辑于星期二\12点35分电离辐射引起DNA损伤的机理本文档共70页;当前第24页;编辑于星期二\12点35分b)非电离辐射—UltraVioletlight(U.V)---pyrimidinedimer(TTdimer)isgeneratedbycovalentlinks

betweenadjacentTT

∧本文档共70页;当前第25页;编辑于星期二\12点35分2-2生物技术定点诱变

本文档共70页;当前第26页;编辑于星期二\12点35分PCR原理解链退火延伸本文档共70页;当前第27页;编辑于星期二\12点35分基因的定点诱变

oligo-dNt介导的定点诱变

合成与目标基因某区段互补并含突变位点的oligo-dNt

本文档共70页;当前第28页;编辑于星期二\12点35分突变oligo-dNt引物介导的PCR诱变目标基因克隆到质粒中分为两管

每管加入2个特定引物一个与基因内某一区段互补(2,4)一个含突变碱基并与欲突变位点互补(1,3)

PCR产物混合变性、复性转化E.coli本文档共70页;当前第29页;编辑于星期二\12点35分PfuDNApolymerasefromPyrococusfuriosus(火球菌属)

具有3’→5’exonuclease活性,校正复制时碱基的错配复制高保真,聚合长度

两引物5’端连接其中引物1中含欲突变的碱基

Pfu-PCR直接诱变法本文档共70页;当前第30页;编辑于星期二\12点35分引物2合成的新生链不会使引物1靶序列发生替代

未被引物2扩增的DNA,含有未突变的酶切位点,经酶解后成线状,转化E.coli不能稳定存在

改进型引物的PCR诱变

目标基因克隆到M13载体提取单链DNA为模板

设计两引物分别与模板不同区段互补

引物1与目标基因互补,含一突变碱基,并5’端磷酸化

引物2含一酶切位点,并造成酶切位点突变

12本文档共70页;当前第31页;编辑于星期二\12点35分两通用引物(commonP1&commonP2)

设计两突变引物(mut.P1&mut.P2)

第一次两种PCR产物混合,变性,复性

其中一对双链分子不能进行第二次PCR

另一对双链分子的PCR产物为诱变基因

引物重叠延伸的PCR诱变

cP1

mP1mP2cP2本文档共70页;当前第32页;编辑于星期二\12点35分基于PCR的随机诱变目标基因克隆于含两酶切位点(REA,B)的质粒载体REA,B酶切克隆子,exonucleaseIII酶解目标基因3’断口的单链Klenow片段dNTP一种碱基类似物(诱变剂)在聚合DNA过程中随机造成诱变本文档共70页;当前第33页;编辑于星期二\12点35分

DNAshuffling技术的基因诱变Mutants.

Digestionligation

transformationselection本文档共70页;当前第34页;编辑于星期二\12点35分2-3化学诱变a)干扰碱基合成的化学诱变剂6-Mercaltopurine5-AminoUracil5-氨基尿嘧啶(5-AU)和6-氮嘌呤(6-NP)本文档共70页;当前第35页;编辑于星期二\12点35分b)碱基类似物导致的碱基错配(5-BrU)BrBr本文档共70页;当前第36页;编辑于星期二\12点35分5-BrU(k)

5-BrU(e)ReplicationBrU(k)BrU(e)ATGC复制错误A/TG/C掺入错误G/C

A/T本文档共70页;当前第37页;编辑于星期二\12点35分A(a)T(k)5-BrU(k)G(k)5-BrU(e)C(a)mispairingmispairingT(k)A(a)5-BrU(k)G(k)C(e)5-BrU(e)A(a)G(k)G(k)A(a)复制错误掺入错误5-BrU(k)5-BrU(e)本文档共70页;当前第38页;编辑于星期二\12点35分5-BrU(k)

5-BrU(e)ReplicationBrU(k)BrU(e)GC复制错误A/T

G/C掺入错误G/C

A/TInDNABrU(k)>BrU(e)(normal)(isoform)BrU(k)

BrU(e)难易AGGATCCT>本文档共70页;当前第39页;编辑于星期二\12点35分HNO2(NitrousacidNA)

ACGHypoxanghineCUracilAXanthineCdeamination

HNO2

碱基修饰引起的化学突变本文档共70页;当前第40页;编辑于星期二\12点35分羟胺的致突变作用NH2OH(HydroxylamineHA羟胺)C(羟化)A(a)OHNH羟化胞嘧啶

GCAT本文档共70页;当前第41页;编辑于星期二\12点35分d)烷化剂EMS(Ethylmethanesulfanate)CH3—S—O--CH2CH3OOMMSCH3—S—O--CH3OOSM(SulfurMustardsgas硫芥子气)HSCH2CH2ClCH2CH2Cl本文档共70页;当前第42页;编辑于星期二\12点35分甲基化本文档共70页;当前第43页;编辑于星期二\12点35分诱变效应;使碱基多处发生烷化,导致DNA结构变异敏感位点H2NOOOCTN3,C4-NN3,C4-OAGN1,N3,C6-N,N7,C8N1,C2-N,N3,C6-O,N7,C8H2NONHH本文档共70页;当前第44页;编辑于星期二\12点35分

Apurination(de-pu)脱嘌呤作用CH3CH2GMPCH3CH2-OC6-O-烷基嘌呤=TC4-O-烷基胸腺嘧啶=GG

GCH2CH2—S--CH2CH2H烷化碱基电离异构式错配多功能烷化剂DNA分子交联畸变GXTO7-烷基鸟嘌呤本文档共70页;当前第45页;编辑于星期二\12点35分e)嵌合剂和移码突变AO(AcridineOrange)扁平分子EB(EthidiumBromide)-ATTTTTCG--TAAAAAGC--ATTTCG--TAAAGC-TAOT-ATEBTTTTCG--TA分子插入异相退火AOEB-ATTTCG--TAAAGC--ATX’TTTTCG--TAXAAAAGC-----AAAAA-----AAAAATTTTT------TTTTT----AAAAA--TTTTT--AAAAA--TTTTT-RE---AAAAA------TTTTT------AAAAAA------TTTTTT---+重组XAAAAGC-TA本文档共70页;当前第46页;编辑于星期二\12点35分第四节保证遗传稳定的机制(损伤DNA的修复)本文档共70页;当前第47页;编辑于星期二\12点35分复制过程中的错配修复DNA的损伤修复基因的回复突变密码的简并致死突变多倍体……复制过程中的错配修复机制(ξ=10-11)DNAmismatch+-----A------------C---DNApol(ξ=10-8)经第二次校正ξ=10-11MRSMismatchRepairSystem注:polI具有3'--5'的核酸外切酶活性(瞬时,广义上的校对和修复功能)本文档共70页;当前第48页;编辑于星期二\12点35分1、DNA的复制修复

1-1MismatchrepairsystemDNApolymeraseligaseMCE(mismatchcorrectenzyme)3subunitsmutH,L,Sdamgenem6A甲基化酶Scanning新生链中错配碱基识别新生链中非m6A的GATC序列酶切含错配碱基的新生DNA区段本文档共70页;当前第49页;编辑于星期二\12点35分MCEscanningDNA中的GATC(palindromicseq.)

为m6A甲基化敏感位点平均每2kb左右有一GATCseq.3’-------C----------CTAG----------CTAG----5’

5’-----------T----------GATC----------GATC----3’

3’-------------------------------------------------------

5’少梯度多(m6A)新生链本文档共70页;当前第50页;编辑于星期二\12点35分MCEscanningendonucleasePolymeraseligaseGATCGATCCTAGCTAGTCGATCGATCCTAGCTAGTGATCGATCCTAGCTAGTA本文档共70页;当前第51页;编辑于星期二\12点35分1-2(尿嘧啶-)N-糖苷酶系统---TAGC------ATCG------TAGC------ATG---U---TAGC---ung-aseGTUAU---TAGC------ATG---Apurinase(内切酶)---TAGC------ADNApolligaseTCG---本文档共70页;当前第52页;编辑于星期二\12点35分本文档共70页;当前第53页;编辑于星期二\12点35分光复活酶471aa2、DNA的损伤修复2-1光复活----TT--------AA--------TT--------AA--------TT--------AA--------TT--------AA----可见光激活本文档共70页;当前第54页;编辑于星期二\12点35分2-2切除修复BeforeReplicationError-freeUvrA,B,CgeneEndonucleasesExonucleaseDNApolLigase切除修复步骤:识别DNA链中的损伤部位损伤部分被切离修复本文档共70页;当前第55页;编辑于星期二\12点35分本文档共70页;当前第56页;编辑于星期二\12点35分本文档共70页;当前第57页;编辑于星期二\12点35分动画本文档共70页;当前第58页;编辑于星期二\12点35分E.coli

存活%U.V计量w.t.uvrA+recA+recA+

uvra-recA-

uvrA-recA.gene

以某种方式参与DNA损伤修复2-3重组修复本文档共70页;当前第59页;编辑于星期二\12点35分

重组修复

(strandtransferrepair)Afterreplicationrepair

RecA,DNApolymeraeligasegenesbeneeded本文档共70页;当前第60页;编辑于星期二\12点35分2-4

SOS修复JeanWeagleE.coliE.coliE.coliλ8010100mut.100%50%10%

E.coli中噬菌体损伤的DNA被修复AU.V.诱导了E.coli

的SOS修复(A&B)SOS修复高频率的突变(Error-prone)ABC本文档共70页;当前第61页;编辑于星期二\12点35分DNAdamaged300XsignalRecAcleavesLexA

SOSUmnCmutation---Beforeinducing.LexA-p

Rec-A,UmuC…11genesNeg.repression---U.V.damageDNASignal(S.S.DNAtailor5NtS.S.DNA)一般lexA基因产物是阻遏蛋白LexA蛋白抑制自身基因的表达LexA蛋白阻遏SOS基因的表达RecA高效表达LexA过表达,但多数被RecA降解SOS基因表达机制本文档共70页;当前第62页;编辑于星期二\12点35分本文档共70页;当前第63页;编辑于星期二\12点35分RecA-P;三种功能●DNA重组活性●与S.S.DNA结合活性●少数蛋白的proteinase活性当DNA正常复制时(无复制受阻,无DNA损伤,无TTdimer)

RecA-p不表现proteinase活性本文档共70页;当前第64页;编辑于星期二\12点35分当DNA复制受阻/DNAdamaged能量大量消耗细胞内原少量表达的RecA-p与S.S,DNA结合激活RecA-p的proteinase活性修复损伤LexA-p降解RecA-p高效表达300timesupSOSopen本文档共70页;当前第65页;编辑于星期二\12点35分当DNA复制度过难关后SOSrepair是一种error-prone极强的修复机制是进化中形成的“竭尽全力,治病救人”的措施(正常状态下,SOS是关闭

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