对人体DNA进行重组的工具

对人体DNA进行重组的工具一、DNA重组技术的基本工具基因工程培育抗虫棉的简要过程：在以上过程中关键步骤或难点是什么？普通棉花(无抗虫特性)苏云金芽孢杆菌提取抗虫基因通过运载体导入转基因棉花含抗虫基因转基因棉花产生伴胞晶体转基因棉花有抗虫特性一、DNA重组技术的基本工具（一）限制性核酸内切酶——“分子手术刀”①来源：主要从原核生物中分离纯化出来。②种类：已从近300种微生物中分离出4000种限制酶。③作用：1.能识别双链DNA的某种特定核苷酸序列2.使每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。磷酸二酯键：磷酸二酯键：EcoRI限制酶的切割：中轴线黏性末端黏性末端在G与A之间切割

大肠杆菌的一种限制酶(EcoRⅠ)只能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。CCCGGGGGGCCC中轴线SmaI限制酶的切割：CCCGGGGGGCCC平末端平末端只能识别CCCGGG序列，并在C和G之间切开。“分子手术刀”——限制性核酸内切酶“分子手术刀”——限制性核酸内切酶(二)“分子缝合针”——DNA连接酶具有特异性。一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并且能在特定的切点上切割DNA分子，④作用特点：大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成少数的识别序列由4、5或8个核苷酸组成⑤限制酶的识别序列：（一）限制性核酸内切酶——“分子手术刀”寻根问底你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是是什么吗？

原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性(平)末端？要切两个切口，产生四个黏性(平)末端。如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？

会产生相同的黏性(平)末端，然后让两者的黏性(平)末端黏合起来，就似乎可以合成重组的DNA分子了。思考?（二）“分子缝合针”——DNA连接酶①作用:②作用原理：催化磷酸二酯键形成

把切下来的DNA片段拼接成新的DNA，即将脱氧核糖和磷酸连接起来.③类型：类型E·coliDNA连接酶T4DNA连接酶来源功能大肠杆菌T4噬菌体恢复磷酸二酯键只能连接黏性末端能连接黏性末端和平末端(效率较低)相同点差别（二）“分子缝合针”——DNA连接酶DNA聚合酶DNA连接酶区别1区别2相同点寻根问底DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗?为什么?1)只能将单个核苷酸连接到已有的核酸片段上，形成磷酸二酯键形成磷酸二酯键1)在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键2)以一条DNA链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键连接成一条互补的DNA链2)将DNA双链上的两个缺口同时连接起来，不需要模板有切割位点(供外源DNA片段(基因)插入)能自我复制——有遗传标记基因(供重组DNA的鉴定/选择)载体DNA必需是安全的(不会对受体细胞有害，或不能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去)载体DNA分子大小应适合(以便提取和在体外进行操作，太大就不便操作)(三)基因进入受体细胞的载体

——“分子运输车”的必要条件：将外源基因送入受体细胞。(三)基因进入受体细胞的载体

——“分子运输车”①载体的作用：质粒λ噬菌体的衍生物动植物病毒等②载体的种类：质粒：

裸露的、结构简单的、独立于细菌拟核DNA之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。(三)基因进入受体细胞的载体

——“分子运输车”质粒：能复制并带着插入的目的基因一起复制有切割位点有标记基因的存在，可用含氨苄青霉素的培养基鉴别。(三)基因进入受体细胞的载体

——“分子运输车”1）不属于质粒被选为基因载体的理由是（）

A、能复制

B、有多个限制酶切点

C、具有标记基因

D、它是环状DNAD练习2）有关基因工程的叙述中，正确的是（）

A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列

B、质粒是基因工程中唯一的载体

C、载体必须具备的条件之一是：具有多个限制酶切点，以便与目的基因连接

D、DNA连接酶使黏性末端的碱基之间形成氢键C练习

已知标记基因有抗四环素基因和抗氨苄青霉素的基因，现探讨某细菌的质粒中有无标记基因或标记基因是什么？请设计实验、预期实验结果，并得出相应的实验结论。对照组：不添加抗生素实验组1：添加一定浓度的四环素实验组2：添加一定浓度的氨苄青霉素实验组3：添加一定浓度的四环素和氨苄青霉素练习对照组实验组1实验组2实验组3结论预期一＋＋＋＋预期二＋＋－－预期三＋－＋－预期四＋－－－对照组：不添加抗生素实验组1：添加一定浓度的四环素实验组2：添加一定浓度的氨苄青霉素实验组3：添加一定浓度的四环素和氨苄青霉素既含有抗四环素基因也含有抗氨苄青霉素基因只含有抗四环素基因只含有抗氨苄青霉素基因既不含有抗四环素基因也不含有抗氨苄青霉素基因思考与探究P72、为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？

通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。3、天然的DNA分子可以直接用做基因工程载体吗？为什么？提示：基因工程中作为载体使用的DNA分子很多都是质粒（plasmid），即独立于细菌拟核处染色体DNA之外的一种可以自我复制、双链闭环的裸露的DNA分子。是否任何质粒都可以作为基因工程载体使用呢？不是，作为基因工程使用的载体必需满足以下条件：思考与探究P71）载体DNA必需有一个或多个限制酶的切割位点，以便目的基因可以插入到载体上去。这些供目的基因插入的限制酶的切点所处的位置，还必须是在质粒本身需要的基因片段之外，这样才不至于因目的基因的插入而失活。2）载体DNA必需具备自我复制的能力，或整合到受体染色体DNA上随染色体DNA的复制而同步复制。3）载体DNA必需带有标记基因，以便重组后进行重组子的筛选。4）载体DNA必需是安全的，不会对受体细胞有害，或不能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去。5）载体DNA分子大小应适合，以便提取和在体外进行操作，太大就不便操作。实际上自然存在的质粒DNA分子并不完全具备上述条件，都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。4、DNA连接酶有连接单链DNA的本领吗？

迄今为止，所发现的DNA连接酶都不具有连接单链DNA的能力，至于原因，现在还不清楚，也许将来会发现可以连接单链DNA的酶。思考与探究P7什么是内含子和外显子？原核细胞基因的编码区是连续的，真核细胞基因的编码区是间隔的、不连续的.真核生物基因的结构特点是：“编码区是间隔的、不连续的。”也就是说：能够编码蛋白质的序列被不能编码蛋白质的序列分隔开来，成为一种断裂的形式。其中，能够编码蛋白质的序列叫外显子，不能编码蛋白质的序列叫内含子。真核基因包括编码区和非编码区，编码区又分为外显子和内含子,内含子不翻译蛋白质。知识拓展什么是内含子和外显子？

在遗传学上通常将能编码蛋白质的基因称为结构基因。真核生物的结构基因是断裂的基因。一个断裂基因能够含有若干段编码序列，这些可以编码的序列称为外显子。在两个外显子之间被一段不编码的间隔序列隔开，这些间隔序列称为内含子。内含子（Interveningregion）是一个基因中非编码DNA片断，它分开相邻的外显子。更精确的定义是：内含子是阻断基因线性表达的序列。DNA上的内含子会被转录到前体RNA中，但RNA上的内含子会在RNA离开细胞核进行转译前被剪除。在成熟mRNA被保留下来的基因部分被称为外显子。真核生物的基因含有外显子和内含子，是前者区别原核生物的特征之一。知识拓展（补充知识）基因的结构1、原核细胞的基因结构非编码区非编码区编码区编码区上游编码区下游与RNA聚合酶结合位点启动子终止子①RNA聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。②转录开始后，RNA聚合酶沿DNA分子移动，并以DNA分子的一条链为模板合成RNA。③转录完毕后，RNA链释放出来，紧接着RNA聚合酶也从DNA模板链上脱落下来。原核细胞的基因结构能转录相应的信使RNA，能编码蛋白质编码区非编码区①不能转录为信使RNA，不能编码蛋白质