CLA对2型糖尿病大鼠肝脏线粒体呼吸链酶活性及氧化应激的影响

CLA对2型糖尿病大鼠肝脏线粒体呼吸链酶活性及氧化应激的影响

作者：徐文，海春旭，杨晨，李嘉琳，王鹏

【关键词】实验二型糖尿病

Effectofconjugatedlinoleicacidsonhepaticoxidativestressandhepaticmitochondrialrespiratorychainenzymeactivitiesintype2diabeticrats

【Abstract】AIM:Toobservetheeffectofconjugatedlinoleicacidsonhepaticoxidativestressandenzymeactivitiesofhepaticmitochondrialrespiratorychainintype2diabetic(DM2)rats.METHODS:Sixtyratswererandomlydividedinto3groups:controlgroup,diabetic(DM)groupandconjugatedlinoleicacids(CLA)treatmentgroup.DM2ratmodelwasinducedbyfeedsofhighersugar,fatandcholesterolwiththeinjectionofstreptozotocin.Bloodglucosewasdeterminedbyabloodglucosetestinginstrumentandseruminsulinbyaradioimmunologicalmethod.Thecontentsofmalondialdehyde(MDA),reducedglutathioneandtheactivityofsuperoxidedismutase(SOD)andcatalase(CAT)inhepatictissuesweretestedbybiochemicalmethods.TheenzymeactivitiesofhepaticmitochondrialrespiratorychainweremeasuredbyClarkoxygenelectrode.RESULTS:Comparedwiththoseincontrolgroup,thebloodglucose,seruminsulinandMDAinliverincreasedsignificantly()andGSHcontent,activitiesofSOD,andCATaswellasmitochondrialrespiratorychainenzymesinthehepatictissuesdecreasedremarkably()intheDMgroup.InCLAtreatmentgroup,theindexesaboveamelioratedtodifferentdegreeandthesechangeswereinadosedependentmanner.CONCLUSION:CLAamelioratestheenergymetabolismimpairmentofDMliverbysuppressingtheoxidativestressandimprovingtheactivityofenzymesinmitochondrialrespiratorychain,andCLAhaseffectiveprotectionfromtheoxidativeinjuryinducedbyDM.

【Keywords】conjugatedlinoleicacids;type2diabetes;respiratorychainenzymes；oxidativestress

【摘要】目的：观察共轭亚油酸(CLA)对2型糖尿病(DM2)大鼠肝脏线粒体呼吸链酶活性及肝内氧化应激的影响.方法：将60只SD大鼠随机分为阴性对照组，DM组和CLA治疗组.高糖、高脂及高胆固醇饲料诱导胰岛抵抗联合ip链脲佐菌素建立大鼠DM2模型.血糖仪检测血糖浓度，放免法检测血清胰岛素水平，生化法测定肝组织丙二醛(MDA)、还原型谷胱甘肽含量及超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性，Clark氧电极法观察大鼠肝脏线粒体呼吸链酶活性.结果：成功诱导大鼠DM2模型，与对照组比，DM组大鼠血糖浓度、血清胰岛素水平、肝脏MDA含量明显升高()，同时肝脏线粒体呼吸链酶活性以及抗氧化酶活性(SOD，CAT)及GSH显着降低()，与DM组相比，CLA治疗组大鼠以上各项指标均有改善，并存在一定的剂量效应关系.结论：CLA通过抑制氧化应激增强大鼠肝脏线粒体呼吸链酶活性改善了DM大鼠肝脏的能量代谢障碍，对DM引起的氧化损伤有保护作用.

【关键词】共轭亚油酸；实验二型糖尿病；呼吸酶；氧化应激

0引言

共轭亚油酸是天然存在具有共轭不饱和双键的脂肪酸，具有抑制肿瘤的形成、调节脂肪代谢、抗动脉粥样硬化、改善免疫功能、降低胆固醇、促进生长等多种生物活性.提高胰岛素对骨骼肌的作用［1］.2型糖尿病是一种以氧化应激为特征的病变，其线粒体氧化磷酸化能力受到损害，只有正常人的55％［2］.CLA对DM2线粒体呼吸酶活性影响研究尚未见报道.我们使用高糖、高脂及高胆固醇饲料诱导胰岛抵抗联合ip链脲菌素建立大鼠DM2模型，观察CLA对DM2大鼠肝脏线粒体呼吸链酶活性及氧化应激的影响，探讨CLA在预防和治疗DM方面可能存在的机制和应用前景.

1材料和方法

材料

雄性二级SD大鼠60只，体质量g，由第四军医大学实验动物中心提供.共轭亚油酸(顺9位、反11位CLA，%；反10位、顺12位CLA，%；C18:1,%；C18:0，%)，由青岛澳海生物有限公司提供.硫代巴比妥酸、丙二醛标准品系Merk公司产品；磷钨酸、牛血清白蛋白由Boehringer公司分装；盐酸羟胺由天津化学试剂一厂生产；NBT、苯二醛OPT(Ophenaldehyde)购自华美公司；GSH标准、TritonX100由上海化学试剂有限公司提供；链脲菌素购自Sigma公司；胰岛素放免试剂盒；血糖仪；UV3000双波长双光束分光光度计；722型光栅分光光度计；CPS1A超声粉碎仪；GL20A全自动高速冷冻离心机；SP2溶氧测定仪；SHZ881台式水浴恒温震荡器.

方法

将动物随机分为阴性对照组、DM组、CLA治疗组，其中CLA治疗组又分为3个不同剂量组.阴性对照组给予普食，DM组、CLA治疗组给予高糖高脂饮食(普通饲料加200g/kg蔗糖、100g/kg猪油、50g/kg胆固醇)，喂养4wk后将大鼠空腹8h后自尾静脉取血，测空腹血糖(fastingbloodglucose,FBG)，血清胰岛素水平(seruminsulinlevel,SIL)，计算胰岛素敏感性指数［ISI=In(1/FBG×SIL)］确定产生胰岛抵抗，一次性30mg/kg链脲菌素(STZ)ip，1wk后测禁食血糖，以禁食血糖≥16mmol/L伴胰岛素抵抗为标准判定DM2大鼠模型成功［3］.成模后对CLA治疗组每日固定时间以，和g/kgCLA灌胃,阴性对照组和DM组给予相同剂量的生理盐水灌胃，共4wk.第9周末处死大鼠，取血分离血清，取肝脏一部分用生理盐水制成200g/L的组织匀浆、1000r/min离心10min，取上清测定MDA，GSH含量和SOD，CAT的活性以及总蛋白的含量，一部分肝组织用来分离提取线粒体，测定线粒体呼吸链酶活性.造模期间在大鼠空腹8h后自尾静脉取血，测定血糖浓度及血清胰岛素含量，计算ISI.MDA测定采用八木国夫荧光法;GSH测定采用荧光法;SOD测定采用改良的盐酸羟胺法;CAT活性测定用改良比色法;线粒体呼吸链酶活性测定用Clark氧电极法［4］.按Kesavulu等［5］方法分离线粒体.Lowrys法测定线粒体悬液蛋白量，并根据肝组织质量计算出每克肝组织的线粒体含量.分别测定3个氧化酶活性：①NADH氧化酶(NADHOX)：10mmol/L磷酸钾缓冲液，pH，2mmol/LNADH；②琥珀酸氧化酶(SUCOX)：80mmol/L磷酸钾缓冲液，pH，5mmol/L琥珀酸，5μmol/L鱼藤酮；③细胞色素氧化酶(CYTOX)：10mmol/L磷酸钾缓冲液，pH，5mmol/L抗坏血酸，mmol/L四甲基对苯二胺，5μmol/L抗霉素A.

统计学处理：结果采用x±s表示，统计软件SPSS，Tab1数据采用重复测量设计的方差分析，其余数据用OnewayANOVA进行分析，表示有显着性差异.

2结果

DM模型组大鼠经高糖高脂饮食1mo后血糖较对照组有不同程度的升高，血胰岛素较对照组则有显着升高.计算ISI，发现有胰岛素敏感性降低，说明高糖高脂饮食已成功诱导出胰岛素抵抗.注射STZ后1wk，各DM组血糖明显上升()到DM标准，而血胰岛素则下降至与Ａ组相当水平(Ｐ)，计算ISI，胰岛素抵抗继续存在(Ｐ)，表明成功诱导了大鼠DM2模型.实验6，9wk末，单纯DM组血糖仍保持在较高水平，而各组间血胰岛素差异则无统计学意义，经CLA治疗后血糖降低，g/kgCLA治疗4wk及g/kgCLA治疗1wk降低血糖更好(Ｐ)，有剂量效应趋势(Tab1).表1CLA治疗后空腹血糖、胰岛素和胰岛素敏感指数

肝组织MDA,GSH水平及SOD,CAT活性CLA治疗4wk后DM大鼠肝组织中MDA含量与对照组相比显着升高，GSH，SOD，CAT的水平与对照组相比显着降低，经CLA治疗后上述指标均有不同程度的改善，随着CLA剂量增加，肝脏组织中MDA含量降低更显着，使GSH，SOD和CAT的水平明显升高，有剂量效应趋势(Tab2).表2CLA治疗4wkDM大鼠肝组织MDA,GSH及SOD,CAT的活性

肝组织线粒体呼吸链酶活性CLA治疗4wk后DM大鼠肝组织线粒体呼吸链酶NADHOX，SUCOX及CYTOX活性显着降低(Ｐ，Ｐ)，CLA治疗后提高，其中g/kgCLA治疗组对NADHOX，CYTOX活性有显着提高(Ｐ)，对SUCOX的活性没有明显改变，g/kgCLA治疗组对NADHOX，CYTOX活性有显着提高(Ｐ)，对SUCOX的活性也没有明显改变，g/kgCLA治疗组对NADHOX，CYTOX活性有显着提高(Ｐ)，对SUCOX的活性也有明显提高(Ｐ)，有剂量效应趋势.值得注意的是g/kgCLA治疗组使NADHOX，SUCOX和CYTOX活性基本恢复到正常对照组的水平(Tab3).表3CLA治疗4wk后DM大鼠肝组织线粒体呼吸链酶活性

3讨论

近年研究［5,6］发现DM动物及人体出现明显的氧化损伤和自由基介导的过氧化作用，生物大分子氧化损伤产物增加，抗氧化酶系修复损伤的缓冲能力降低.因此我们观察CLA对DM2大鼠氧化应激水平和肝组织线粒体呼吸酶的活性的影响，旨在探讨DM2发病的分子机制确定研究靶位.本实验证实CLA确有降低血糖的作用，显示出剂量效应趋势.肝组织线粒体MDA,GSH水平及SOD,CAT活性变化，可以反映CLA是否通过对抗自由基而发挥其治疗作用.本实验表明DM大鼠肝组织中MDA含量与对照组相比显着升高，GSH，SOD和CAT的水平与对照组相比显着降低，说明DM大鼠处在严重的氧化应激状态，经不同剂量CLA治疗后对上述指标均有不同程度的改善，随着CLA剂量的增加，能更加显着降低肝脏组织中MDA的含量，使GSH，SOD和CAT的水平明显升高.DM大鼠肝组织线粒体呼吸链酶NADHOX，SUCOX，CYTOX的活性与对照相比显着降低(Ｐ，Ｐ)，经CLA治疗后得到提高，具有剂量效应趋势.值得注意的是g/kgCLA治疗组使NADHOX，SUCOX和CYTOX活性基本恢复到正常对照组的水平.表明DM对线粒体呼吸酶NADHOX和CYTOX活性的影响尤为重要.因此CLA有可能通过抑制DM产生的氧化应激对线粒体的损伤作用，增强大鼠肝脏线粒体呼吸链酶活性，改善了DM大鼠肝脏的能量代谢障碍，从而有效降低血糖，对DM引起的氧化损伤起到保护作用.

【参考文献】

［1］RyderJW，PortocarreroCP，SongXM，etal.Isomerspecificantidiabeticpropertiesofconjugatedlinoleicacidimprovedglucosetolerance,skeletalmuscleinsulinaction,andUCP2geneexpression［J］.Diabetes,2001;50(5):1149-1157.

［2］TurkoIV,MuradF.Quantitativeproteinprofilinginheartmitochondriafromdiabeticrats［J］.BiolChem,2003;278(37):35844-35849.

［3］郭啸华,刘志红,李恒,等.实验性2型糖尿病大鼠模型的建立［J］.肾脏病与透析肾移植杂志,2000;9(4):351