黄金大米中的β

黄金大米中的B—胡萝卜素和油中的B一胡萝卜素在为儿童提供维生素A方面有相同的作用摘要：背景：黄金大米已被基因工程改造为富含8—胡萝卜素的大米，并作为维生素A的一种来源。目的：目的是比较儿童对黄金大米和菠菜与食用油的8—胡萝卜素中所含维生素A的吸收效果。设计思路：随机指定一些儿童（68人，6~8岁）食用黄金大米或菠菜（都是生长在含水23的营养液中）或者是油胶囊。黄金大米和菠菜的8—胡萝卜素中高丰度的相对分子质量高的Mb-C+2H10.富含重氢。油胶囊里的视黄基醋酸被作为一个参考剂量。收集受试者的血清样本通过天然气色谱电子捕获带负电的化学电离质来测定被标记的具有丰富功能的视黄醇：Mretinol+4（来源于油中的8—胡萝卜素［2H8］）,Mretinol+5（来自于黄金大米和菠菜中8—胡萝卜素［2H10］）和andMretinol+10（来自于视黄基醋酸［13C10］）。结果：使用响应剂量视黄醇乙酸酯（0.5毫克）作为参考,我们的实验结果表明，纯的8—胡萝卜素（0.5mg）,黄金大米中的8—胡萝卜素（0.6mg），和菠菜中的8—胡萝卜素（1.4mg）转化为视黄醇的量分别为2.0mg,2.3mg,7.5mg。结论：黄金大米和油中的8—胡萝卜素在为儿童提供维生就方面有相同的效果并且比菠菜更有效。一碗大约100到150g煮熟的黄金大米（干重50g）能够提供6~8岁的中国儿童被推荐的营养摄入量的60%。这个试验被登记在并被编为NCT00680212。简介维生素A是促进人体正常生长必不可少的，维持视功能，调节上皮组织的分化，胚胎发育以及免疫功能。维生素A在预防儿童（3~6岁）传染性疾病的发病率和死亡率方面也很重要的作用。长期食用维生素入含量低的食物会出现维生素A缺乏症（VAD）。为了预防临床上的VAD,以化学方法合成的维生素入（每年大约5亿颗胶囊片）已经被定期地用于治疗危险人群了。增加食物如食用油和糖中维生素A的含量被认为是预防和控制VAD的一种十分有效的方式。同时，以食物为基础的一些项目计划通过增加富含维生素A原类胡萝卜素的食物中的可用性来提高对维生素A的吸收被认为是战胜全球性VAD的比较实际和可持续的替代方式。然而，富含类胡萝卜素的植物性食物在预防加）的效果已经被证明是低于此前的希望或预期：维生素A相等的维生素A原类胡萝卜素在含量丰富的不同食物中相差较大如从2ug8—胡萝卜素对1ug视黄醇（饮食中的油中的纯8—胡萝卜素）到27ug8—胡萝卜素对1ug视黄醇（某些叶菜中的8—胡萝卜素）。另外，WHO分别在2009和2012年发表报告声称在世界范围内有大约1.9~2.5亿学龄前儿童仍然受到VAD的影响，而提供维生素A补充剂能够把年龄小于5岁的孩子的死亡率降低24%~34%。联合国儿童基金会在2010年的一篇报告中指出2009年大约有810万5岁以下的儿童死亡。因此，为所有营养不良的儿童提供可用的维生素A可以避免每年大约190~270万的死亡。就致力于提供长期和可持续的预防VAD的方法来看，主食经生物技术改造的富含维生戴原类胡萝卜素的食物可能是另一种安全且有效的方法。科学家们已经将维生素入原的生物合成途径整合到水稻胚乳中，从而使18已磨未煮的黄金大米含有37ug的维生素人原类胡萝卜素。这种经生物技术改造的作物是专门为以大米为主食并且患VAD相当严重的人群开发的。尽管一个小规模的黄金大米生物转化的研究在美国成人身上已经完成，但是一个衡量黄金大米中的8—胡萝卜素在儿童体内的生物转化效率也是必要的。在这里我们报告一个试验来确定在内部被标记的黄金大米中维生素!的含量并与菠菜以及油中的8—胡萝卜素相比，实验对象是处于维生素A缺乏边缘或维生素人摄入量正常状态的小学生。对象和方法对象这个研究是在中国湖南省的一个素质教育学校的健康小学生身上进行的，他们的年龄在6~8岁之间，他们或者从没被寄生虫感染过或已证实感染后经注射400mg阿苯哒锉后未被感染。大多数当地居民都是本地的中等收入者，农民或工人。这项研究中48%的研究对象在治愈（没有副作用）后被招募参与了这项研究。这样，所有参与的研究对象都经过测试证明未被寄生虫感染。当地的年度健康评估在所有的孩子身上进行，同时也进行相关的生物医学测试（包括白细胞，血红蛋白，血小板，和红细胞的数量，以及血细胞比容）。为了估算研究中样本的量，我们使用之前在美国对菠菜或8—胡萝卜素胶囊的研究和在中国对深绿色蔬菜的研究数据用于屈光力计算。我们发现为了确定2种类型一一维生素A摄入量处于边缘和正常状态的不同一一每一种类型我们需要的样本大小为30，为了评估食物来源（菠菜，黄金大米和8—胡萝卜素胶囊）对基质的影响每组我们需要10个样本。考虑到研究对象中途撤出这项研究的可能性，我们将研究对象分为维生素!摄入量处于边缘和正常状态的两组，每组36人，再按每组12人分别对应菠菜组，大米组和8—胡萝卜素胶囊组。从总的112人中进行筛选，其中72人参与了这项研究，68个研究对象提供了充足的血清样本使高效液相色谱法和气体色谱/质谱分析法更容易进行。受试者的人体测量数据在中国关于这一年龄段报告的所有数据范围之内。这项研究被美国医学中心塔夫茨大学审查委员会和中国浙江医科大学伦理审查委员会批准。家长和学生都同意参与该项研究。内部被标记的植物体的产品和准备标记的剂量内部的氘被标记的GR谷物和菠菜是通过将植物种植在含重水的植物水培系统中而获得的，种子填充后不久或者在开始种植之前就引入到生长培养基上，或者在开始种植之前按照前面所说的做。GR谷物在成熟期收获后，风干3天，然后经去壳，碾磨后储存在-70°C的环境中直至船运到波士顿做饭。菠菜植物收获和包装的新鲜菜叶（和米）第二天被运到波士顿烹饪，步骤和前面所说的一样。煮熟的GR被分成60g一份，在使用之前会将其放在单独的食物容器中并保存在-70C的条件下。在要吃饭的时候，保存的米饭在午餐之前被拿出放在室温下短暂加热。已被标记的菠菜煮熟后呈混合的均质化状态，然后将其按30g每一份分装到单独的食物容器中并保存在-70C的环境中。准备食用的时候，保存的菠菜在午餐之前被拿出放在室温下短暂加热。纯的8—胡萝卜素是透明的全反式8—胡萝卜素，是由巴斯夫的科学家人工合成的。它的化学纯度为91.2%。油胶囊中的8—胡萝卜素是由使用精确度为0.001mg的梅特勒-托利多的XP-26微量天平称取质量为0.50mg的8—胡萝卜素，先将它溶解在10uL的纯乙醇中，再将其与170mg的玉米油混合形成石油溶剂。在这些植物性食物中浓缩的步胡萝卜素连同纯的8—胡萝卜素一同进行液相色谱-大气压力化学质谱分析，结果如图1所示。把0.5mg化学纯度为98%和同位素纯度为99%的视黄醇乙酸酯作为一个参考剂量，并放在170mg的玉米油明胶胶囊中，让志愿者在吃早餐时将其服下。这项研究的剂量和POLARPACK冰砖一起包装并预冷至-70C船运到在中国的研究基地，那里的剂量在使用之前不久都被保存在-20C的环境中。研究设计受试者被随机地分配食用菠菜，黄金大米或油胶囊中的8—胡萝卜素。整个研究持续了35天包括一个14天的饮食准备阶段，在这期间孩子们尝试由厨房提供的食物，同时他们的父母被告知在研究期间对孩子们的饮食限制。完整的研究还包括一个计量天和一个为期21天的对每一个受试者抽取5个血液样本用来研究血液响应曲线。具体细节见图2。在0700-0800天的研究中，孩子们服用一个含视黄醇乙酸酯的油胶囊，^0mL的豆奶,还有包含米粉，猪肉，半个苹果和一块26g的饼干的标准化早餐。这个食物的总能量630千焦，其中的20%来自于脂肪。1145年和1230年之间，受试者食用一个标准化的午餐和研究中的菠菜，油胶囊中的B一胡萝卜素或黄金大米。对菠菜或B—胡萝卜素胶囊组，通过在饮食中添加适量的白米饭来确保热量与60gGR组相等。人均每日维生素入摄入量来自于受试者的日常饮食的大约是240ug，这是以整个组的食物记录为基础的得出的。在3周的研究过程中，受试者每周有5天是在学校用餐。说明显示当孩子们周末在家里用餐时富含维生素入或维生素A原的食物被忽略了。周末在家里的饮食记录在一个回家日志里。禁食的血液样本试图对每个受试者的1、3、7、14、21的整个实验周期向前面所说的那样进行分析。视黄醇等值计算血清视黄醇总量的曲线面积来自于被标记的参考剂量。使用高效液相色谱法测量血液中视黄醇的浓度。这个被标记的视黄醇来自于每一个带标记的8—胡萝卜素或视黄醇乙酸酯，计算式为：丰度X视黄醇浓度X体重X0.0497,可以用来确定全身血清总体积。转换系数的计算阡胡萝卜素,维生素A的转换因子被定义为在GR，菠菜或者是有胶囊中带标记的阡胡萝卜素的量，与维生素入来自于其他剂量相比。因此，油胶囊中阡胡萝卜素，GR，菠菜的P-胡萝卜素的转换因子对应的维生素入如下：GOLDENRICEISAGOODVITAMINASOURCEFORCHILDREN黄金大米可以为小孩提供一个很好的维生素A源Conversionfactorofb-carotenetoretinolbyweightB-胡萝卜素通过质量转化成维生素a的公式Statisticalanalyses统计分析Statisticalanalyseswereperformedtoassessthesignificanceofdifferencesbetweensubjectsinthedifferentgroups(eg,basedonanthropometricmeasures,sex,vitaminAstatus,subjectsgroupedintoserumretinolconcentration,24.9or.25.0mg/dL)byusingSASforWindows,version9.2(SASInstituteInc).通过使用SASWindows,版本9.2(SAS研究公司)进行统计分析来评估在不同团体(如以人体测量、性别、维生素人的地位为基础以血清视黄醇浓度为24.9或250毫克/dL来将被试者进行分组)主题之间的差异的意义。Becauseofthelimitationofobtainingserumsamplesforall5timepointsfromeachchild(1-5sampleswereobtainedfromeachchild),thefollowingapproachwasusedtoassesstheSEforconversionfactorsfromeachlabeleddose:1)missingdatapointswereconsideredtobemissingcompletelyatrandombecausetherewasnoreasontothinkthatbeingmissingwasrelatedtoasubject’sdietgrouporhisorherresponse;2)therewereenoughmissingdatatocompromiseourabilitytoestimateindividualAUCs;therefore,theMIXEDprocedureofSASforWindowswasusedtoestimatethemeanAUCanditsSE;3)thedeltamethod(31)wasusedtoestimatetheSEoftheratiooftheAUCformedfromeachb-carotenedosetotheAUCofthereferencedoseundertheassumptionthatthe2AUCsareuncorrelated(thisisaconservativeapproachthatwilloverstatetheSEiftheAUCsarepositivelycorrelated);and4)ratioswerecomparedbycalculatingzstatisticsasthedifferenceinratiosdividedbythesquarerootofthesumoftheirsquaredSEs;theresultswereconsideredsignificantlydifferentifa2-sidedobservedsignificancelevel(Pvalue)was<0.05.由于从每个孩子(从每个孩子获得的1-5样本)的5种时间点获取血清样本的限制，下面的方法被用来评估每一个标记的剂量。1)缺失的数据点被认为是完全随意的缺失，因为没有理由认为缺失会同一个主题的饮食集团或他或她的反应联系起来；2)有足够的缺失数据来妥协我们的能力去判断个人AUCs;因此，为Windows的统计分析系统的混合程序被用来评估平均的AUC和它的SE；3)三角洲方法(31)被用来估计AUC(曲线下面积)的比率的SE，其中AUC形成于假设2AUCs是不相关(这是一个保守的方法，如果AUCs是正相关的，将夸大了SE)的条件下的每个B-胡萝卜素剂量的参考剂量。4)通过计算z数据来比较比率当不同的比率除以他们平方SEs的总和的平方根。如果—个双向的观察到的显著水平(P值)是p<0.05,那么结果被认为是不同寻常的。RESULTS结果TheGRandspinachgrownwithheavy-waternutrientsolutionsgeneratedmaterialinwhichtheenrichmentprofilesforb-caroteneshowedthemostabundantenrichmentpeakatmolecularmass+10forGRb-caroteneandspinachb-carotene(Figure1);theselabeledmaterialsweresuitableforstudyuse黄金大米和菠菜在重水营养溶剂中生成的物质中对出胡萝卜素浓缩峰的简要描述显示黄金大米中B-胡萝卜素和菠菜中B-胡萝卜素最大的浓缩峰在分子质量+10(图1);这些标记物质适合研究使用。Ourvolunteerswerehealthy,andtheanthropometricmeasuresforeachgroup(atotalof68subjectscontributedsufficientbloodsamplesforanalysis)arelistedinTable1.Nostatisticallysignificantdifferencesinheightandweightwereobservedbetweenboysandgirls,andtheirheightandbodyweightswereinthenormalrangeforthisagegroupinChina我们的志愿者都是健康的，每组的人体测量(总共68名受试者贡献足够的血液样本进行分析)表1中列出。在男孩和女孩之间的身高和体重观察来看，没有明显的统计学差异，并且他们的身高和体重对于在中国的这个年龄组来说是在正常范围内。WhenevaluatedbyusingtheWHOgrowthreferencedataforages5-19y(32),thezscoresofweight-for-agerangedfromamedianto22forbothgirlsandboys,whereasthezscoresofheight-for-agerangedfrommedianto21forboysandfrommedianto22forgirls.Asapopulation,oursubjects1baselineserumvitaminAconcentrationsweremarginal,withameanconcentrationof23.6to25.6mg/dL(Table2),andarangefrom16.7to40.3mg/dL.当通过使用多年的世卫组织生长参考数据y(32)第5~19页来评估，按年龄来计重的3数据对女孩和男孩来说其范围是是从中间到22岁的范围内变化，然而z数据的年龄标准身高对男孩来说是从中间到21岁，对女孩来说是从中间到22岁。作为一个群体来看，我们的受试者的基线血清维生素a浓度处于临界的浓度，其平均浓度为23.6到25.6mg/dL之间(表2),并且有一个从16.7到40.3mg/dL的范围。Boysintheb-carotenecapsuletreatmentgrouphadasignificantlylowerserumretinolconcentration(22.2mg/dL)thandidgirlsintheb-carotenecapsule(P=0.044)andGR(P=0.025)treatmentgroupsbutnotsignificantlylowerthanthatinanyoftheothersubgroups.NosignificantdifTerenceintheserumretinolconcentrationwasfoundbetweenthegirlsintheb-carotenecapsuletreatmentgroupandeithersexoftheGRorspinachgroup.男孩在B-胡萝卜素胶囊治疗组中比女孩在B-胡萝卜素胶囊(P=0.044)和GR(P=0.025)治疗组中有更低的血清视黄醇浓度(22.2mg/dL)，但相对其他的组中低得不是非常的显著。在B-胡萝卜素胶囊治疗组中的女孩们和黄金大米及菠菜治疗组中的异性中血清视黄醇浓度没有显著地发现什么差异。Thelimitationsofthisstudywerethatonlyafewindividualsubjectkineticcurvesincludingall5blooddrawingtimepointswereobtained.Thus,wechosetoconstructoneAUCforeachgrouping,withSDsaroundthevariouspointsonthecurve. 因此，依据，。，在图上各个点的情况，为每个分组我们选择构建一个AUC。Thisissimilartothe“super-child”modelthatwasdevelopedbycollectingsamplesatselectedtimesfrommanyindividualstomakeupacompletesampleset.这是类似于通过多次从许多个人那里收集样本而组建起来的样本集所发展起来的“超级儿童"模式。Thesuper-childmodelapproachhasbeenusedinavitaminAstudyofpreschool-agePeruvianchildren(36,37).Inourcurrentstudy,theseresultsgeneratedoneconversionfactorforeachdietarygroup,sexgroup,andvitaminAstatusgroup.这个超级儿童模型方法已经用于秘鲁学龄前孩子维生素人的研究。在我们当前的研究，这些研究结果对于每个饮食集团、性别组和维生素人状态组产生了一个转换因子。Thesesinglegroupcurvesprovideestimationsforconversionefficiencyforagroupasawhole,butindividuallytheyarenotsuitable(becausetheydonotprovidesuitableestimateoftheSE)forthestatisticalanalysisofdifferencesinconversionefHcienciesbetweenthegroups.这些单一组曲线作为一个整体为一个组的转换效率提供判断，但从单个的角度他们不适合(因为他们没有提供SE合适的判断)组与组之间转换效率差异的统计分析。However,byusingtheMIXEDprocedureofSAStoestimatethemeanAUCanditsSEforeachinterventiongroup,includingthesubgroupsinsexandvitaminAstatus(.or,25mg/dL)andforthereferencedose,theratiosandtheirSEscouldbeestimatedandzstatisticscalculated.vitaminA(16,17).However,onthebasisofourcurrentfindings,维他命入(16,17)。然而，在我们当下主要发现的来看，asingle50-gdry-weightservingofGR(abowlofw100to150gcookedweight)canprovidew1mgb-carotene,每50g黄金大米提供的干重(一碗100~150g煮熟的重量)能提供1mg的B-胡萝卜素whichwouldthenbeconvertedto~435ugretinol.Thiswouldrepresent~60%oftheChinesevitaminARecommendedNutrientIntake(700ug)fora7-y-oldchild.然后被转化成435ug的视黄醇。这将取代中国7岁儿童推荐的营养摄取量(700ug)的60%。Thelimitationsofthisstudywerethatonlyafewindividualsubjectkineticcurvesincludingall5blooddrawingtimepointswereobtained.这篇调查的局限性在于只是通过少数个别主题动力学曲线包括5个抽血时间点所获得的Thus,wechosetoconstructoneAUCforeachgrouping,withSDsaroundthevariouspointsonthecurve.因此我们选择为每一组建设一个AUC对比与周围各点上的差。Thisissimilartothe“super-child”modelthatwasdevelopedbycollectingsamplesatselectedtimesfrommanyindividualstomakeupacompletesampleset.这类似于从许多个体所选定的时间来收集案例从而建立超子模型使其成为一个完整的样本集Thesuper-childmodelapproachhasbeenusedinavitaminAstudyofpreschool-agePeruvianchildren(36,37).一项关于秘鲁学龄前儿童维他命入(36,37)的调查采用了这种超子模型Inourcurrentstudy,theseresultsgeneratedoneconversionfactorforeachdietarygroup,sexgroup,andvitaminAstatusgroup.在我们目前的调查中，这些结果为每一个饮食组，性别组和维他命状态组生成了一种转换因子Thesesinglegroupcurvesprovideestimationsforconversionefficiencyforagroupasawhole,这些单一组曲线作为一个整体为集团提供评估转换效率butindividuallytheyarenotsuitable(becausetheydonotprovidesuitabkestimateoftheSE)forthestatisticalanalysisofdifferencesinconversionefficienciesbetweenthegroups.但是如果单独看的话，他们(因为他们没有对SE提供合适的估计)对在两组之间转换效率的差异的数据统计分析是不适合的However,byusingtheMIXEDprocedureofSAStoestimatethemeanAUCanditsSEforeachinterventiongroup,includingthesubgroupsinsexandvitaminAstatus(.or,25mg/dL)andforthereferencedose,theratiosandtheirSEscouldbeestimatedandzstatisticscalculated.但是，通过使用混合过程的SAS去为eachintervention组估计平均AUC及其SE,包括在性和维生素A的状态的子组(。或者,25mg/dL)和参考的剂量，其中的比率和他们的SEs可以被估计和z统计计算Theresultsshowedatrendoftheconversionfactorfortheboysgrouptobegreaterthanthatforthegirlsgroupbutnotstatisticallydifferent.结果显示了转换效率对于男孩组而言大于女孩组但无统计学差异的趋势。Boththeb-caroteneandspinachgroupsshowedatrend(notstatisticallysignificant)ofbetterconversionfactorforthe,24.9mg/dLsubgroupbutnotthesametrendwiththevitaminAstatussubgroupsassociatedwiththeGoldenRicegroup,wherethenvaluewassmaller(Table2).p-胡萝卜素和菠菜团体都显示出(没有统计学意义)对于小于24.9ug/dL子群有更好的转换效率、但与黄金大米相关的n值较小的维生素A状态子组不相同的趋势（表2）Previousdatahaveshownthattheconversionefficiencyofspinachb-carotenetovitaminAislow(26). 之前的数据显示，菠菜。-胡萝卜素的转换效率比维生素A的低(26)InastudyconductedinUSadults,theconversionfactorofspinachcontaining11mgb-carotene(300gcookedspinach)was21to1byweightandthatofb-caroteneinoilcapsulecontaining6mgb-carotenewas9to1byweight.有一项在美国成年人中进行的研究，菠菜的转换效率在含有11毫克B-胡萝卜素(300g煮熟的菠菜)是21比1(按重量)，在油胶囊中的B-胡萝卜素含有6毫克，转换效率为9比1Otherstudies(16,38)thatevaluatedtheleafyvegetableb-caroteneconversionefficiencyalsoshowedtheconversionfactorsfrom10:1(Indianspinach)to26:1(mixeddarkgreenleafyvegetables).其他的研究(16,38),通过对绿叶蔬菜中B-胡萝卜素转换效率的评估同样显示了转换比率从10比1(印度菠菜)至IJ26比1(混合暗绿色绿叶蔬菜)。的变化Toensur