犬瘟热诊断技术的研究进展-课程论文湖南农业大学

湖南农业大学课程论文学院：动物医学院班级：专硕动医班姓名：吕轩学号：SZ20150643课程论文题目：犬瘟热诊断技术的研究进展评阅成绩：评阅意见：成绩评定教师签名：日期：2015年12月17日犬瘟热诊断技术的研究进展学生：吕轩动物医学院摘要:近年来,犬瘟热已严重危害了犬及毛皮动物养殖业的健康发展,快速、准确的诊断技术对于犬瘟热的预防显得尤为重要。现阶段犬瘟热诊断技术的研究主要有病毒分离培养与镜检观察、酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫组化、免疫胶体金、核酸杂交、巢式RT-PCR、实时荧光定量RT-PCR、双重PCR、基因芯片、液相芯片、环介导等温扩增等。获得能产生典型细胞病变的易感细胞株是成功进行犬瘟热病毒分离培养与镜检观察的关键。作者就犬瘟热诊断技术的研究进展作一综述,为有效预防和控制犬瘟热的流行和暴发提供简便、高效的检测技术。关键词:犬瘟热;诊断技术;研究进展犬瘟热由犬瘟热病毒(caninedistempervirus,CDV)感染所致,该病呈世界性分布,对宠物犬和经济毛皮动物(貂、狐、貉)等危害严重,死亡率可达80%~90%,1997年的《中华人民共和国动物防疫法》将其列为三类动物疫病。近年来,人们对犬瘟热病的研究虽取得很大进展,但由于该病在感染后多继发细菌性、病毒性感染,早期诊断困难,且动物一旦发病死亡率高。因此,做好预防及建立早期快速而准确的检测方法,对控制犬瘟热的流行意义重大。作者就目前国内外对犬瘟热诊断技术的研究进展进行综述,以期为该病的防控及快速诊断技术研究提供参考。1病原及流行特点
CDV为副黏病毒科、麻疹病毒属成员,是有囊膜的单股负链RNA病毒,囊膜上的附着蛋白(at-收稿日期:2014-12-29
基金项目:吉林省重点科技攻关项目(20130206039NY)
作者简介:苏凤艳(1973-),女,吉林集安人,博士,研究方向:经济动物疾病防治,E-mail:sufy110@163.com
*通信作者:王全凯(1958-),男,吉林松原人,博士,教授,博士生导师,研究方向:经济动物疾病防治,E-mail163.com5期苏凤艳等:犬瘟热诊断技术的研究进展1319tachmentproteinorhemagglutininprotein,H)和融合蛋白(fusionprotein,F)在病毒吸附和侵入宿主细胞过程中起着重要作用。在CDV免疫学研究中,因H和F蛋白具有许多病毒中和性抗原表位,可诱导机体产生中和抗体,常作为合成疫苗和基因工程亚单位疫苗的研究对象[1-2]。一般常用非洲绿猴肾细胞系(Vero)和犬肾细胞系(MDCK)进行CDV的分离培养、增殖、病变观察、疾病的诊断及疫苗的开发等研究[3-5]。目前大多数毛皮动物养殖国均有该病的流行,已成为危害毛皮动物的三大主要传染病(犬瘟热、病毒性肠炎、阿留申)之一。一般冬春季多发,幼畜最易感,典型病例表现为体温升高且呈双相热型。但随着养殖业的发展,大范围易感动物的运输导致CDV的发病规律不再具有季节性、周期性和地域性。2病毒分离培养与镜检观察
CDV的成功分离是进行病原学诊断的基础,也是确诊该病最可靠的方法,但分离率往往较低,这是由于用于CDV分离的细胞一般不表达CDV受体[6-7]。国内外试验结果表明,稳定表达CDV信号淋巴激活分子(SLAM)受体的细胞株,能有效分离CDV,并且不受传代次数限制,产生比传代细胞更明显的细胞病变(CPE)。因此,为了提高CDV的分离率,需对分离CDV的常规细胞进行改造。创建稳定表达CDV-SLAM受体细胞株的一般方法为:采用分子克隆技术扩增SLAM基因,构建SLAM真核重组表达质粒,并将其转染于拟改造细胞,经G418压力筛选、单细胞克隆化、免疫荧光试验、RT-PCR、Westernbloting等筛选出稳定表达SLAM的阳性细胞。将CDV接种于阳性细胞和亲本细胞观察CPE情况,判定阳性细胞的敏感度。依据上述方法,NaKano等[8]成功建立稳定表达SLAM的犬肾细胞和猫肾细胞,为犬瘟热病毒学和血清学分析奠定基础。赵建军等[9]建立的Vero-rSLAM细胞系接种CDV样品36~48h即可产生典型CDV致细胞融合病变,分离的CDV保持较强毒力。朱颖等[10]建立了能稳定表达CDV细胞受体SLAM的BHK-21/SLAM细胞系,感染CDV12h即出现CPE,且明显提高了病毒的增殖力,该试验为CDV的分离、生物学特性研究及疫苗生产等提供了敏感的细胞系。依据CDV粒子形态特点对分离培养的病毒采用电镜观察可直观地对病毒类型做出初步诊断。3免疫学检测技术
3.1酶联免疫吸附试验(ELISA)该法是在细菌性、病毒性疾病检测中应用最广泛的技术[11-13],在CDV的检测中常用夹心ELISA法检测CDV抗原,间接ELISA法检测CDV抗体。夹心ELISA法是以已知抗体(抗CDV)包被载体,然后将含有CDV抗原的待检标本加入,共同孵育后,抗原结合于包被抗体上,再加入酶标抗体(酶标抗CDV抗体),酶标抗体连接到抗原上,最后加入底物溶液,根据颜色反应来判定CDV抗原含量。间接ELISA法是以特异性CDV抗原与固相载体联结,形成固相CDV抗原,加入受检样品,样品中的特异CDV抗体与固相CDV抗原结合,形成固相抗原抗体复合物,加入酶标抗CDV抗体,固相免疫复合物中的抗体与酶标抗CDV抗体结合,从而间接地标记上酶,再加入底物显色,固相载体上的酶量与样本中受检抗体的量呈正相关。Chan等[14]应用原核表达系统制备CDVH蛋白,将其作为ELISA检测抗原,用于犬血清CDV抗体的检测,具有良好的稳定性和特异性。Litster等[15]对美国某一医疗点用于检测CDV抗体滴度的ELISA试剂盒的准确性进行检测,结果显示该试剂盒的敏感性为75.7%,特异性为91.8%,被证明是测定犬血清中CDV抗体滴度的简便有效工具。孙婧等[16]应用杂交瘤细胞融合技术筛选出能生产捕获抗体的MAbG12杂交瘤细胞株和能生产酶标检测抗体的MAbA2杂交瘤细胞株,建立检测CDV的夹心ELISA检测方法并对条件进行优化,结果显示应用该方法与RT-PCR方法同时检测57份样本,符合率为100%,且与犬的其他病毒性疾病无交叉反应,该方法适用于大批量临床样品检测。3.2免疫组化技术
免疫组化技术可对CDV在各组织中分布情况进行检测。该方法虽然不能作为犬瘟热的早期和活体诊断,但在病理学研究中意义重大,也可为检测样本的筛选提供依据。其一般步骤为:将固定于中性甲醛溶液中的病料(肾脏、肺脏、脑、淋巴结等)修剪、石蜡包埋制块、切片,经免疫组化染色后在光学显微镜下观察。在染色过程中,为提高观察效果,需进行抗原修复方法、最佳抗体稀释度和反应时间、显色底物及作用时间等相关条件的摸索,最终选择最优的试验条件。刘雯等[17]采用间接免疫组化法对6只人工感染的比格犬肠组织CDV抗原进行定位检1320中国畜牧兽医42卷测,结果显示CDV抗原主要在小肠绒毛和李氏隐窝的上皮细胞胞浆内,说明CDV对肠组织的损害主要在小肠黏膜上皮组织。张文奎等[18]对确诊为犬瘟热的病貉肺脏、脑、肾脏、胃、脾脏、淋巴结、扁桃体、鼻、足垫、支气管进行免疫组化检测,确定出CDV分布最广泛的器官是扁桃体。Rentería-Solís等[19]对德国柏林市区97只自由放养的浣熊进行免疫组化检测,结果证实有74只感染CDV。该方法制作的标本可长期保存,只需光学显微镜即可观察,与免疫荧光技术相比不需要荧光显微镜这一相对昂贵的仪器,适用于基层兽医单位。3.3免疫胶体金技术免疫胶体金技术是利用抗原抗体特异性结合的免疫反应原理,将特异性的抗原或抗体以条带状固定在膜上,胶体金标记试剂(抗体或单克隆抗体)吸附在结合垫上,当待检样本加到试纸条一端的样本垫上后,通过毛细作用向前移动,溶解结合垫上的胶体金标记试剂后相互反应,在检测线处形成抗体—待测抗原—金标抗体复合物,再移动至固定的抗原或抗体的区域时,待检物与金标试剂的结合物又与之发生特异性结合而被截留,聚集在检测带上,在对照线处形成抗金标抗体—金标抗体复合物,通过肉眼即可观察显色结果[20]。该技术的关键在于抗体的制备[21],该法现已发展成为诊断试纸条,使用十分方便。近年来在兽医临床上CDV胶体金检测试纸条广泛应用,是基层兽医站和宠物医院确诊犬瘟热最常用的辅助手段。虽然其具有简便、快速的特点,但敏感性和特异性相对较低,其检出率还有进一步优化的空间。4分子生物学检测技术4.1核酸杂交方法核酸杂交技术是一种根据碱基互补配对原理用已知核酸来检测未知核酸,以此来确定是否感染某种疾病等的分子水平检测技术。用于CDV诊断目的的杂交双方是已知序列的CDV探针和待测样品中的CDV核酸,杂交后通过特定方法检测,若有杂交信号,则说明样品中存在CDV核酸,从而证明CDV感染的存在。该方法的关键是要制备敏感、稳定、特异的核酸探针。核酸探针过去常用放射性同位素进行标记,放射性同位素标记的优点是敏感度高,对被检样品处理要求不高,假阳性率低,其缺点是半衰期短,费用昂贵,需防护设备,放射自显影时间较长。近年来发展了非放射性标记,如金属汞、半抗原、生物素、酶等,具有保存时间长、检测方便等优点。国外对CDV核酸杂交技术方法的研究在20世纪80年代至20世纪90年代较多[22-24],近年来未见专门报道。张永霞等[25]采用斑点杂交法对CDVN基因进行地高辛(DIG)标记制备cDNA探针,用此探针与样品(疑似犬瘟热患病犬鼻液、病死犬脾脏、肝脏、心脏、肺脏、肾脏、血液)中RNA杂交检测CDV基因,试验结果表明该法比胶体金诊断试纸检出率高,脾脏是最适宜的检测样本,斑点杂交技术在CDV早期诊断和流行病学调查中有很高应用价值。4.2巢式RT-PCR(nestedRT-PCR)巢式RT-PCR是一种变异的RT-PCR,使用两对RT-PCR引物。第1对RT-PCR引物扩增片段和普通RT-PCR相似。第2对引物称为巢式引物(因为其在第1次RT-PCR扩增片段的内部)结合在第1次RT-PCR产物内部,使得第2次RT-PCR扩增片段短于第1次扩增。巢式RT-PCR的好处在于,如果第1次扩增产生了错误片段,则第2次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低。因此,巢式RT-PCR的扩增非常特异。杨井泉等[26]建立了CDV巢式RT-PCR检测方法,并用此法对石河子地区疑似感染CDV的病料进行检测,结果表明该研究建立的巢式RT-PCR不仅能有效检测CDV感染,而且能够检测多种组织样品,补充了形态学、理化和生物学鉴定的不足,减少RT-PCR的误检率,适用于CDV的早期快速诊断和流行病学调查。Fischer等[27]采用巢式实时荧光定量RT-PCR(RT-nqPCR)方法分别对疑似患犬瘟热病犬的血液、尿液、直肠黏膜拭子和结膜拭子进行检测,结果显示血液的检出率最高。该方法需经过两轮PCR反应,与普通RT-PCR反应相比大大提高了反应的特异性,比免疫层析技术(IC)的敏感性更高,同时又采用限制性片段长度多态性(RFLP)分析技术对扩增的NC基因核苷酸序列进行分析,以此来确定是否为CDV野毒株感染。Yi等[28]建立用于区分CDV野毒株与疫苗株的等位基因特异性RT-PCR方法,而采用病毒分离培养方法却无法区分,该方法可用于CDV的临床检测和流行病学监测,具有很强的特异性。4.3TaqMan实时荧光定量RT-PCR和SYBRGreenI实时荧光定量RT-PCR常规RT-PCR仅对反应的终产物进行定性定量分析,而实时荧光定量RT-PCR可对反应中每一循环进行定性定量分析,与常规RT-PCR相比,实5期苏凤艳等:犬瘟热诊断技术的研究进展1321时荧光定量RT-PCR具有自动化程度高、操作简单、解决PCR污染问题、特异性更强、灵敏度高、可直接对产物进行定量的特点[29-30]。常用的实时荧光定量PCR试剂有TaqMan水解探针、SYBRGreenI和分子信标。其中SYBRGreenI可用于多种模板、灵敏度高、使用方便、价格相对便宜,较常用;TaqMan探针特异性高,是只有引物和探针都与同一模板结合时才能检测,可在一次反应中同时检测多个不同的序列,但该探针只适于一个特定的目标;分子信标可用于单核苷酸多态性的检测,尤其适用于检测点突变,但该探针设计困难、价格昂贵,一般不用。全传松等[31]根据CDV核衣壳蛋白(NP)基因的保守序列设计引物和探针,并经反应体系和反应条件的优化,建立了TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法。试验结果显示,该法敏感性是常规RT-PCR方法的100倍;特异性强,与其他犬类病毒不发生交叉反应;稳定性好,组内、组间变异系数均小于5%。该法适于犬瘟热的早期诊断。李菊梅[32]采用RT-PCR扩增CDVF基因并构建、纯化pMD18-T-F重组克隆质粒,并以此为模板作荧光定量PCR扩增,建立了CDVSYBRGreenI实时荧光定量RT-PCR检测方法,用此法检测病料检出率明显高于常规RT-PCR方法,该方法的建立可为犬瘟热诊断、分子流行病学调查、疫情监测工作的开展提供技术依据。4.4双重PCR方法
多重PCR技术是以PCR技术为基础发展起来的一种检测方法,在一次反应中同时检测多种病原,与单一PCR相比,不仅保持了较高的敏感性和特异性,而且能检测混合感染,具有较高的临床应用价值[33-34]。对于犬科动物病毒性疾病的检测,双重PCR方法研究报道较多,即在一次反应中同时检测两种病原。由于双重PCR反应需两对引物和两种模板,极易出现非特异性扩增或无法扩增,因此在引物设计时应注重选择合适的基因片段长度、退火温度和GC含量。依据双重PCR检测技术,刘大飞等[35]、耿庆华等[36]、孙园园等[37]均建立了CDV与另外一种病毒的双重PCR检测方法,其敏感性明显高于商品化胶体金试纸条,并有利于检测出两种病毒混合感染病料,且与普通PCR检测结果的符合率在98%以上,该法可在临床中推广应用。5新型高效检测技术5.1基因芯片技术基因芯片技术是在核酸杂交技术的基础上开发出的一种快速、高效和高通量的检测技术。国内外有关基因芯片技术应用于人类疾病早期诊断研究的报道较多[38-40],而在动物性疾病的研究方面相对较少,目前国内还未有用于检测动物性疾病的标准化基因芯片投放市场,整体还处于研制和开发阶段。朱晓光等[41]设计出CDV寡核苷酸探针,建立样品PCR扩增方法,制备基因芯片,建立了CDV目视化基因芯片检测方法,并以TCID50为10-2CDV细胞毒为样品,检测出该基因芯片的灵敏度比普通PCR的灵敏度高100倍,病料检测与PCR符合率为100%。表明该方法具有灵敏度高、特异性强的特点,适用于CDV的流行病学调查和种特异性鉴定。5.2液相芯片技术液相芯片技术是一种继蛋白质芯片和基因芯片之后创新地将流式细胞术与荧光微球结合的新型多通道高通量生物芯片检测体系,可同时对同一血清样品中多种病原抗体进行定性分析,实现多种病原抗体的实时检测[42-43]。液相芯片检测体系一般分为两种:抗原—抗体反应液相蛋白芯片和核酸杂交反应液相基因芯片。张海雷[44]采用液相蛋白芯片技术制备CDV重组H蛋白捕获微球,建立的CDV抗体液相芯片检测方法,具有特异性强、敏感性高、重复性和稳定性好等特点,与ELISA试剂盒的检测结果符合率高,可作为ELISA试验的替代技术用于检测CDV抗体水平。5.3环介导等温扩增技术
环介导等温扩增(loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)技术自2000年首次由日本学者开发以来,已在多种细菌性、病毒性和寄生虫性疾病的检测方面得到了广泛的应用。该技术是一种全新的核酸扩增方法,能在等温条件下短时间内进行核酸扩增,具有简单、快速、强特异性等特点。与普通PCR相比,不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程,在灵敏度、特异性和检测范围等方面堪比甚至优于PCR技术,且不依赖任何专门仪器设备即可实现现场高通量快速检测,其检测成本远低于荧光定量PCR。胡嘉欣等[45]采用反转录环介导等温扩增(RT-LAMP)技术对CDVN基因保守区的8个位点设计6条引物进行RT-LAMP一步法扩增,试验结果表明该法的灵敏度是RT-PCR的103倍,整个试验过程比RT-PCR缩短1.5h,具有成本低、方便快捷等优点,适于兽医临床诊断和流行病学调查等相关研究。温海等[46]也建立了检测CDV的RT-LAMP方法,并与RT-PCR方法相比,1322中国畜牧兽医42卷试验结果显示该法的检出率更高,不易出现假阴性结果。6小结与展望随着犬瘟热疫苗的大范围接种及变异毒株等诸多因素的不断出现,许多CDV感染动物不再出现典型特征,一些弱毒感染耐过的动物在不断散播着CDV,对健康易感动物造成威胁,即使是野毒株感染也只有在感染动物的临床期才能观察到。因此,建立早期快速而准确的检测方法才能控制犬瘟热的流行。整体而言,随着近几年分子生物学及免疫学检测技术的进步,使得CDV的诊断变得越来越准确、简便、易行。因每种技术均有其优缺点及诸多限制因素,因此在对疑似犬瘟热感染的动物进行诊断时,最好多种检测方法相结合,以最大限度提高检测的敏感性和特异性。目前PCR技术、基因芯片技术、液相芯片技术、RT-LAMP等已进入临床试验研究阶段,相信随着这些技术的不断成熟和完善,不久的将来会在临床上广泛应用。参考文献:
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