修改版三黄鸡NLRP3基因组织表达和分布的研

（NLRP3作为最重要的炎性体传感器之一，对调节炎性体活化，避免造成过度激活，有着显著的作用。三黄鸡是华南地区最重要的优质肉鸡品种，也是综合防控压力极大鸡品种之一。但是，到目前为止，还没有NLRP3在鸡的组织特NLRP3在禽类炎症性疾病中作用的不利因素。本研究对三黄鸡NLRP3进行了克隆和序列分析通过重组原核表达纯化蛋白出多克隆抗体分别通过实时荧光定量PCR和免疫组化分析研究三黄鸡各个组织中NLRP3的mRNA相对表达水平及NLRP3NLRP3在鸡炎症性疾病中的作用和为进一步NLRP3在不同物种的功能和进化提供了基础，4部分内1、三黄鸡NLRP3克隆及序列分运用RT-PCR方法扩增了三黄鸡NLRP3并将其克隆到pMD18-T载体中进序对获得的序列提交到GenBank，获得accessionno：KF318520。NLRP3编码734个氨基酸蛋白分子量为82.7KDa通过MegAlign软件对不同物种的NLRP3序列和氨基酸序列进行同源性分析，三黄鸡NLRP3基因与牛、羊、猪、狨、人、猕猴、小鼠和大鼠的同源性分别为54.2%、53.9%、53.7%、55.4%、54.3%、54.5%、53.5%、53.7%，该哺乳类动物间的同源性52%。2、实时荧光定量分析三黄鸡NLRP3的表扩增的目的片段经琼脂糖凝胶电泳检测分别在253bp和167bp处有一条相应的特异性条带，其大小与理论推测相符。NLRP3在三黄鸡所检测的所有组织中均有表达。NLRP3在三黄鸡的肺脏和气管中的表达量大大高于其它通过双酶切和序列测定证明成功构建了pET32a(+)-NLRP3表达质粒。NLRP3His重组融合蛋白得到有效表达通过SDS蛋白凝胶电泳检测纯化蛋白条带大小约为100KDa，与其预测的大小相一致用His抗体和自己的纯化IgG分别进行Westernblot4NLRP3利用免疫组织化学技术对利用免疫组织化学技术对NLRP3蛋白在三黄鸡各个组织的分布进行研究。结果表明，三黄鸡NLRP3蛋白在检测组织的阳性染色细胞的细胞质中均有不同程度的表达和分布。NLRP3蛋白在心脏和脾脏呈现弱阳性至中强阳性反应，但是在 皮细胞呈中至强阳性，肾小球和肾小球囊细胞 theStudyofTissue-specificExpressionPatternandDistributionofNLRP3in YellowChicken(CollegeofVeterinaryMedicine,SouthernAgriculturalUniversity,Guangzhou510642,):Pathogen-associatedmolecularpatterns(PAMPs)yimportantrolein tionwhichmeansresponseofthehosttostimuli.NOD-likereceptorprotein3(NLRP3)infl someisinvolvedintheonsetanddevelopmentofinfl NLRP3,asoneofthemostimportantinfl somesensors,hassignificanteffectontheregulationofinfl someactivationtoavoidtheconsequencesofoveractivation.yellowchickenisthemostimportantqualitybroilerbreedinSouth,whichisofthegreatpressureofcomprehensivepreventionandcontrol avianinfluenza.However,uptodate,therearenodetailedtissuespecificexpressionanddistributiondataaboutNLPR3inchicken,whichisthenegativefactorforfurtherresearchonthetheroleofNLRP3ofdifferenttissuesinavian torydiseases.Here,NLRP3ofyellowchickenwasclonedandsequenceyzed,thepolyclonalantibodywasproducedbypurifiedproteinofbinantprokaryoticexpression.RelativeexpressionlevelsandtissuedistributionofNLRP3wereinvestigatedbyreal-timetativePCRandimmunohistochemicalysis,respectively.TheresultswillhelptoelucidatetheroleofNLRP3ofdifferenttissuesininfl torydiseasesofchickenandprovideabasisforfurtherinvestigationsinthefunctionandevolutionofNLRP3indifferentspecies,whichwouldbehelpfulforfurtherresearchonavian torydiseases.TherearepartsofthisAmplificationofyellowchickenNLRP3geneandsequenceysisyellowchickenNLRP3genewasamplifiedbyRT-PCRandthesequencewasdepositedinGenBank(accessionno.:KF318520),whichyzedwithbioinformaticssoftwares.Theresultsshowedthatthededucedproteinisconsistsof734aminoacidsanditsdeducedmolecularweightis82.7KDa.ThenucleotidesequencesofNLRP3werealignedusingthesoftwareMegAlign(DNAstar,Madison,WI).ThenucleotidehomologyofNLRP3amongyellowchickenandBostaurus,Hainanblackgoat,Susscrofa,Callithrixjacchus,Homosapiens,mulatta,MusmusculusandRattusnorvegicuswere54.2%,53.9%,53.755.4%,54.3%,54.5%,53.5%,53.7%.TheNLRP3geneisconservativeinmlianbutsignificantlydifferentbetweenmlianandchicken,withonly52%homology.Real-TimetativePCRysisofyellowchickenNLRP3Melting-curveprofileysisconfirmedthespecificityofprimersforamplificationofNLRP3andβ-actinfragments.Theamplifiedtargetgenefragmentsof253and167bp,respectively,wereevaluatedbyagarosegelelectrophoresisandwereinaccordancewithexpectations.Thesequencesofthesetwotargetgenefragmentsshowed100%homologywiththeoriginalsequences.NLRP3expressedinallchickentissuesexamined.TherelativeexpressionlevelofNLRP3inthetracheaandlungwereverysignificantlyhigherthanthatinothertissuesexamined(P<0.01).TherewasnosignificantdifferenceofNLRP3expressionlevelsbetweentheheart,liver,spleen,kidneyandbursaofFabricius.ProkaryoticexpressionofyellowchickenNLRP3andthepreparationofthepolyclonalantibodyDoubleenzymedigestionandnucleotidesequenceysisshowedthat binantHis-taggedNLRP3wasefficientlyexpressedandSDSshowedthatthepurifiedproteinbandwasconsistentwiththepredictedsize,whichisapproximay100KDa.WesternblotdetectionusingHis-tagantibodyandourpreparedIgGshowedthatthefusionproteinwastheHis-taggedNLPR3.ImmunohistochemicalysisofyellowchickenThemethodofimmunohistochemistrywasestablishedtodetecttissuespecificdistributionofyellowchickenNLRP3.ImmunohistochemicaldetectionshowedthatchickenNLRP3wastissuespecificdistributionandlocatesincytosmofthepositivestainingcells.Thecytosmexhibitedweaktomediumpositivestainingintheheartandspleen,butstronginthetrachea,lung,brain,liver,bursaofFabricius,andkidney.Ciliatedepithelialcells,basalcellsandcellsinlaminapropriaandsubmucosaoftracheastainedstrongpositive,whilecellsincricoidcartilageshowednegative.ThealveolarepithelialcellsofthepulmonaryalveoliwerestronglypositiveforNLRP3proteinexpressioninthelung.Cardiacmuscleexhibitedweaktomoderatestaining,whilethatoftheconnectivetissueswasnegative.Inthecerebralcortexofthebrain,someareasofthematrixexhibitedweakpositiveandneuronsshowedmediumtostrongpositivestaining.Inspleen,theendothelialreticularcellsexhibitedweaktomediumpositivestainingwhilelymphocyteshowednegative.InbursaofFabricius,lymphocytesofmedullainstannousfollicleshowedstrongwhilecortexcellsshowedfocalstrongpositive.Interestingly,mucosalepithelialcellsofbursaofFabriciusshowedmediumtostrongpositive.Inliver,partoflivercellsexhibitedmediumtostrongpositivestaining.Inkidney,mostoftherenaltubularepithelialcellsexhibitedmediumtostronglypositivestainingwhilethecellsintheglomerulusandBowman’scapsuleswerenegative. 前 1.1性炎症的发生及其机 NLRP蛋白及其在炎症反应中的作 NLRP蛋白NLRP3炎性复合体的组成及其在炎症反应中作 NLRP3的分子结构及其分布情 NLRP3炎性复合体参与机体炎症的途径及其机 NLRP3炎性复合体参与流感炎症的途径及其作 本研究的目的和意 材料与方 材 实验动 抗 主要试剂盒及试 主要溶液的配 RNA提取用试剂的配 琼脂糖电泳用试剂的配 大肠杆菌感受态的及转化用溶液的配 免疫组化相关溶液的配 主要仪器设 分析工具软 方 三黄鸡NLRP3的克隆与鉴 三黄鸡总RNA的提 引物的设计与合 cDNA的合 PCR扩增三黄鸡NLRP3PCR产物的回 感受态细胞（JM109）的（氯化钙法 pMD18-T载体的连接反 连接产物的转 阳性质粒菌落和质粒PCR鉴 质粒双酶切鉴 重组质粒的序列测定及分 三黄鸡NLRP3荧光定量实 三黄鸡NLRP3的原核表达与多抗的三黄鸡NLRP3的组织学分 免疫组化的实验步 免疫组化结果的判 结果与分 三黄鸡NLRP3的克隆与质粒的鉴 三黄鸡NLRP3的序列分 三黄鸡荧光定量实验NLRP3和β-actin的鉴 荧光定量实验溶解曲 荧光定量PCR扩增曲 标准曲 三黄鸡NLRP3的原核表达与多抗原核表达载体构建结 三黄鸡NLRP3蛋白的诱导表达及纯 重组蛋白的纯 三黄鸡NLRP3蛋白多克隆抗体的三黄鸡NLRP3的组织学分 讨论与结 参考文 附录 附录 1.1性炎症的发生及其机反应恰当的炎症反应是机体免疫系统为移除有害刺激或病原体及促进损伤免疫反应中发挥作用，既能感受各种病原或相关相关分子模式，又这两个免疫系统识别和清除的病原微生物固有免疫系统也称为天然免疫系(patternrecognitionreceptors,PRRs)广泛识别和结合存在于病原体上的病原相关分子模式(pathogen-associatedmolecularpatterns,PAMPs)和宿主自身的相御反应。固有免疫是机体的第一道防线可对环境中的微生物及理化损伤做出反应,维持机体稳态。NLRP3炎性复合体被激活后，促进IL-1β前体和IL-18前体的成熟和IL-β、IL-18的分泌。IL-1β、IL-18等方面有积极作用。I-1β和I-18会通过细胞表面上的受体作用于巨噬细胞，诱导某些趋化因子和粘附分子的表达，募集和激活中性粒细胞等免疫细胞。如果过量表达则会过度的炎症反应还可以通过-kB诱导多种促损伤的酶类合成，增加细胞的细胞毒作用（Bonatal.,199；Hagbergetl.,199；Lebel-Binayetal.,200），从而对细胞和组织产生损伤作用。机体后，首先引起的是免疫系统这种免疫反应天然存在机体不是针对某一种异体物质（包括微生物，而是针对一切的异体物质。这包括部位的屏扰素和K细胞（自然细胞）等，在侵入和早期时，对防止入侵、杀灭和清除，起着主要的免疫作用。到目前为止，研究已经发现多种可激活NLRP3炎性复合体，引起机体的炎性反应NLRP3炎性复合体可感应识别RNA如流感（Kannegantietal.2006）、脑心肌炎（EMCV（Rajanetal.2011）、西尼罗（Byrneetal.,2001）、呼吸道合胞（RSV）（Takeuchietal.,1998）、丙（HCV）（Burdetteetal.,2012）、麻疹（Measles）（Komuneetal.,2011）等，也可感应识别DNA，如腺（Allenetal.,2009）、水痘带状疱疹（Barlanetal.,2011）、疱疹（HSV）（Sergerieetal.,2007）、乙和释放，引起炎症反应。多种和不同的成分可激活caspase-1，而IL-1β和IL-18又在对的免疫应答中起了重要的作用（Rathinametal.,2010）。同存在的形式。NLRP3炎性复合体抑制的机制主要有以下几种：直接2010；Xiangetal.,1999）。NLRP蛋白作为宿主抵抗病原体的第一道防线固有免疫通过模式识别受pattern-recogitinrecetorsPRs来识别病原体相关分子模式(pathogenassociatedmoleclarattrns，MPs)，活下游信号通路，机体的炎症反应及免疫应答。模式识别受体从信号转导受体方面可分为以下三类:视黄酸诱导I样的受体(RIG-IlikerecetorsRLsoll样体(olllierecetorTLs)和核苷酸结合寡聚化结构域(nucleotidebindingolgomerizatin，O)样受体ND-likereceptos，NRs)，这些受体可被细菌和病-κBIFN；Kaaietal.,2009））NOD样受体（NODlikereceptors,NLRs）是一个近年在炎症反应中发现的胞浆蛋白，是固有免疫系统对病原体的一类重要感受器，感受来自病原体上的病原相关分子模式（pathogen-asssociatedmolecularpatterns,AMPs，也可以感知内源性信号相关分子模式（danger-associatedmolecularpatterns,DAMPs），并且与其它蛋白共同组装成多分子信号复合物炎症小体 some)，活化半胧氨酸蛋白酶(caspase)导致炎症介质的表达和释放，炎症反应（Akiraetal.,2006；Takeuchietal.,2010）。NLRs包括5个NOD成员，14个NLRP（NLRfamily,pyrincontaining 称为NACHT-LRR-PYD-containing proteins，NALP)，以及IPAF(theIL-1β）CII（classtransactivaterNAIP（NeuronalApoptosisInhibitorProtein）（Petrillietal.,2007）。NLR成员包括NLRP1、NLRP3、NLRC4和NLRP6。NLRP蛋白作为NLRs状细胞、粒细胞、T细胞和B细胞等（Vialaetal.,2004）。NLRP32002年Martinon等（Martinonetal.,2002）提出具有核苷酸结合寡聚化区域，它”（Morietal.2011；Schertzeretal.2011）。第一个被发现的炎性复合体是NLRP1炎性复合体。随着复合体等（Schroderetal.,2010）。NR3（nucleoide-inding oiomerization leucinerich repetscontaiingyrin3）炎性复合体是一种细胞质内的多蛋白聚合物，是目前研究最详尽的炎性体，其主要由核苷酸结合寡聚化结构域受体（NLRP3、由P胱天蛋白酶募集域(caspase recruiment CRD) 构成的酸溶性胶原蛋白 (AS) 、pro-casase-1蛋白等3部分组成（Martinonetal,2002）。AC是细胞内一类重要的衔接蛋白，N端为PYD结构域，C端是CRD结构域，其作用是连接N蛋白及caspase-前（Joostenetal.,211Caspase-1是一种分子量为5Kd的无活性酶原，通过形成的炎症小体被剪切成为成20Kd及10K的活性形式结构活性casase-1剪切细胞介素-1（IL-1和白细胞介素-18（I-8）的前体使之成为成形式结构（Joostenetal.,2011）。I-β是一种重要的细胞因子在机体炎症反应中发挥重要作用IL-1β分子量31Kd的无活性前体形式结构于细胞浆中通过caspas-1剪切成为成分子量为17K的成熟形式来发挥作用（Turneretal,2014）。I-1β可诱导白细胞向受损伤组织进行浸润引起发热促进造血及血管内膜再生多种细胞增殖（Naiketal.,201）。作为免疫炎性反应的“感受器”和“调节器，NRP3炎性复合体能够识别外源性和内源性信号通过LRNLRP3与其配体MD结合后使原来处于自我抑制无活性状态的NR3发生构象变化出了NCHT结构域然后通过三磷酸腺（T的聚合而形成高度有序的NLRP3蛋白寡聚体，接着募集凋亡相关斑点样蛋白(apoptosi-associated speck-like protein，AC)及半胱天冬酶(caspase)形成复杂的复合物——炎性复合体(ifl some)（Bouchier-Hayesetal.2001），pro-caspase-1变为有催化活性的caspase-1，催化IL-1β的前体pro-IL-1β变为成IL-1β，1β18al.2003PYDCARD两个结构域组成ASCPYD结构域与NLRP3中的PYDCARD结构域则通过同类型结构募集caspase-1的CARD结构域（Bouchier-Hayesetal.,2001；Tingetal.,2005）。到目前为止，上皮细胞、平滑肌细胞等多种细胞中表达（Chenetal.,2011）。 PYDs-containingprotein3)，又名NALP3CLR1.1CryopyrinCIAS1PYPAF1NLR(NODlikereceptor)险信号的细胞质识别受（Satohetal.,2013其端是一个约20个氨基酸残基的结构域富含亮氨酸重复(leuie—richrepatLRR)结构域其以构架形式供蛋白与糖脂之间蛋白与蛋白之间以及病原体或微生物之间的相互作用在识别和感应病原相关分子模式(AMP)上发挥重要作用。中间部分是核苷酸结合寡聚化结构域 (nucleotid—bindingndoligoerizationD／NCH)为NRs各成员共有的特征性结构域。NACHT结构域在激活过程中介导NRP3分子的自身寡聚化其与凋亡蛋白激酶活化因子的核苷酸结合区具有同源性蛋白端是效应结构域即热蛋白结构域(P)主要分布在细胞间质及细胞膜中具有将NRP3受体分子与下游衔接蛋白衔接起来的作用（Bryantetal.,2009；Takahashi,011还可以和AC的PYD结构域结合调节caspas-的激活（Agostinietl.,204）。NR3的表达细胞主要是单核巨噬细胞、嗜中性粒细胞和一些初级免疫细胞。、、能够感应和识别包括细菌真菌及其毒素和抗体如细胞壁成分、微生物的DNA、RNA等多种病原体（Dostertetal.,2009；Hafner-Bratkovicetal.,小颗粒等非病原体来源刺激物（Dostertetal.,2008；Halleetal.,2008），与此同萄糖等信号也会刺激其活化，参与免疫炎性反应（Baueretal.,2012；Brozetal.,2010）。、、性的pro-IL-1β前体和激活信号路径即控制着无活性的pro-IL-1β向有生物学活性的成熟IL-1β的成熟过程2个信号路径（Grossetal.,2011）。免疫细胞天然表达的内源性NLRP3水平还不能够到达炎性复合体的激活水平从而产生caspase-1（Bauernfeindetal.,2009），而预激信号路径可以提高NLRP3的产生pro-IL-1β。因此，预激信号路径在免疫细一是NLRP3激活物诱生活性氧，而活性氧再介导NLRP3成为活化多聚体。而活性氧抑制剂可以阻断IL-1β和IL-18的生成，这些相关研究也从另外一个角度阐述了该机制（Cruzetal.,2007；Sekiyamaetal.,2005）。二是溶酶体裂解蛋NLRP3（Halleetal.2008Hornungetal.,2008）。NLRP3有自我调节的作用正常情况下处于非激活状态但当存在NLRP3活化剂时，它可寡聚化募集ASC，继而活化caspase-1。到目前为止，NLRP3炎性复合体的激活主要有3种机制，即ATP依赖的钾离子外流，溶酶体的溶解以及活性氧的形成。第一个机制是ATP依赖的钾离子外流。病原体、损伤坏死细胞和相关配体等释放ATP结合细胞膜表面的门控离子通道P2X7嘌呤受体，导致钾离子快速外流，细胞膜孔上的衔接P2X7嘌呤受体的pannexin-1通道逐渐开放。胞外的NLRP3激活剂小分子配体可通过pannexin-1孔隙进入细胞质从而激活NLRP3炎性复合体（Kahlenbergetal.,2004；Kannegantietal.,2007）。第二个机噬细胞溶酶体随之裂解，并释放出溶酶体蛋白酶类(组织蛋白酶B)至胞质后，继而激活NLRP3炎性复合体（Gasseetal.,2009；Yinetal.,2013）。因此，通过抑制溶酶体蛋白酶类活性的方式即可有效防止炎性体的活化（Hornungetal.,2008）。第三个机制是活性氧（reactiveoxygenspecies，ROS）的形成。大部分生活性氧(reactiveoxygenspecies，ROS)，细胞内活性氧簇的增加，促使硫氧还 TRX）的解离，然后TXNIP与NLRP3相结合，随之激活炎症小体（Lee,2011；Zhouetal.2010）。研究表明，ROSNLRP3炎症小体。ROS（Casseletal.,2008；Dostertetal.,2008；Fukumotoetal.,2013）。到目前为止研究已经发现流感能通过激活NLRP3炎性复合体引起免疫炎性反应，NLRP3炎性复合体在发生过程中具有非常重要的作用。早在2009年，Thomas等（Thomasetal.,2009）就发现流感RNA组可激活NLRP3炎性复合体。而在流感过程中，NLRP3炎性复合体就参与到性免疫应答（Ichinoheetal.,2009）。有研究表明，流感质子可通过胞内M2炎性复合体的活化，从而细胞因子IL-1β的分泌，最终导致免疫炎性反应（McAuleyetal.,2013）。有研究，构成NLRP3炎性复合体主要结构的NLRP3、ASC和Caspase-1中一个或者多个结构缺陷或者被敲除的小鼠在流感病毒时支气管肺泡液和中IL-1β和IL-18水平明显下降肺部的清除能力受到一定程度的损害，呼吸道炎症明显减轻而率显著提高（Allenetal.,2009；Ichinoheetal.,2009；Kannegantietal.,2006；Thomasetal.,2009）。NLRP3的研究主要集中在哺乳类动物，如人和小鼠。三黄鸡是华南地区最重要的优质肉鸡品种，也是综合防控压力极大鸡品种之一。NLRP3在鸡的组织特异性表达和分布的详细数据。NLRP3在禽类炎症性疾病中作用的不利因素。本研究对三黄鸡NLRP3进行了克隆和序列分析，通过重组原核表达纯化蛋白出多克隆抗体，分别通过实时荧光定量PCR和免疫组化分析研究三黄鸡NLRP3mRNANLRP3蛋白的组织分布。研究结NLRP3在鸡炎症性疾病中的作用和为进一步试验所用三黄鸡为60日龄，购自华南实验动物中心辣根酶标记抗兔IgG，购自中杉金桥生物技术HIS单克隆抗体，购自鼎国生物技术TotalRNA提取试剂购自宝生物工程（大连）Code:D312RNAisoReagent PrimeScriptTM1stStrandcDNASynthesisKit购自宝生物工程（大连）有 Code:D6110APrimeScript200RnasedNTPMixture（10mMOligodTRandom6RnaseTaKaRaExTaq购自宝生物工程（大连）Code:DRR001ATaKaRaExTaq(5U/uL) 1TaKaRaLATaq购自宝生物工程（大连）CodeNo.:RR02MATaKaRaLATaq(5U/μl) 25μL10×LAPCRBufferII(Mg2+ 1dNTPMixture(各2.5 400pMD18-TVector购自宝生物工程（大连）Code:D101ApMD18-TVector(50ng/uL) 20μL×1支Control Ligation DNA凝胶回收试剂盒购自宝生物工程（大连）Code:DR-IDR-II28Rinse80ElutionSpin50Collection50质粒DNA小量纯化试剂盒购自宝生物工程（大连）CodeSolution15Solution15Solution2428Rinse80ElutionSpin50Collection50SYBR®PremixExTaqTM(PerfectReal 200（大连）DNAMarker100购自宝生物工程（大连）DNAMarker15000购自宝生物工程（大连）DAB试剂盒购自中杉金桥生物技术Code：ZLI-9017(12)中性树胶(显微光学用)购自标本模型厂产品IPTG购自宝生物工程（大连）（EB自鼎国生物技术。RNA20min。⑵75%无水乙 0.1%DEPC ⑴10mg/mL溴化乙锭（EB）100mgEB10mL 冰乙 0.5MEDTA（pH 100mL50大肠杆菌感受态的及转化用溶液的配⑴氨苄青霉素(AMP)液：将1g氨苄青霉素溶于10mL去离子水中，终浓度100mg/mL，用0.22um微孔滤膜过滤除菌，分装成1mL，-20℃备用gal20mgX-20mg/mL-LB胰蛋白 酵母提取 20min。LB15g12150℃以下时，倒制平板。如要加入抗生素如氨苄青霉素（Amp)卡那霉Amp/LB/X-gal/IPTG在浇制好的Amp/LB平板上加入40uLX-gal(20mg/mL)以及20uLIPTG(200mg/mL)37℃温育至液体完全吸⑴10%福尔固定1000mL。⑵0.02MPBS(pH1000mLNaCl8.5g，Na2HPO42.8g，NaH2PO40.4g0.01M柠檬酸缓冲液(pH1000mL水中加柠檬酸三钠3g，柠檬酸0.4g超速离心机：TGL-16H，医学仪器；冷冻台式离心机：TGL-16R，医学仪器PCR扩增仪：PTC1148，BIO-RAD公司荧光定量PCR仪：Bio-RadiQ5opticlesystem，BIO-RAD公司；Gilson公司、芬兰大龙公司；凝胶透射分析仪：UV-3B，医学仪器；超低温冰箱：925，ThermoForma，；电热恒温鼓风干燥箱：101-1-BS，跃进医疗器械厂单人单面净化工作台：SW-CJ-IFD，苏州净化设备，中国苏州；电子天平：JM2102，余姚纪铭称重校验设备；便携式pH计：PHB-3，三信仪表厂，中国数显恒温水浴锅：HH-1，常州澳华仪器。研钵，钵棒，药匙，锡箔纸，各种玻璃耗材均购自广州丛源仪器。全自动脱水机：TP1020Leica，德国；烘片机：HI1220Leica轮转式切片机：RM2145Leica光学显微镜：XSP-2C光学仪器五厂，中国；生物组织包埋机：BM-V孝感市电子仪器厂，中国孝感；电热恒温水浴锅：KWS宁波自动化仪表厂，中国浙江；电热恒温鼓风干燥箱：101-1-BS跃进医疗器械厂，中国；显微照相设备：Axioskop2plusZEISS，德国；PCR引物设计软件：Primer5.0DNA序列数据库：NCBI/Genbank/nucleotide保守结构域分析：NCBI/Conserveds三黄鸡NLRP3的克隆与鉴RNA试验用品的预处理：研钵及钵棒，药匙洗净后，用锡箔纸包裹，2006小时；塑料制品用0.1%的DEPC水溶液浸泡过夜后牛皮纸包裹，高高压灭菌，37TrizolReagent⑴将已速冻的三黄鸡组织迅速转移至用液氮预冷的研钵中，用钵棒快速研100mg组织粉末加入到1mLRNAisoReagent5min。⑵加入200μl氯仿盖紧离心管盖用力震荡待充分溶液呈乳白状后，5min后，4℃12,000×g15min。⑶从离心机中取出离心管，此时液体分为三层，即：无色的上清液，10min。4℃，12000g10min⑸弃去上清缓慢沿离心管壁加入75%的乙醇1mL洗涤RNA沉淀4℃12,000g离心5min；弃去乙醇RNA保存于-80℃。参照GenBank登录的原鸡NLRP3设计特异性引物，用以扩增NLRP3，引物均由宝生物工程大连有限公司合成，上游引物为：5'-AGCACGCCATGGCGATGGCAGGAGAAGAAA-3'，下游引物为：-cDNAPrimeScriptTM1stStrandcDNASynthesisKit0.2mLPCR管中配制下列混合液：TotalOlidodT10mMdNTPDEPCPCR PCR上述变性，退火后反应 RNase 5×PrimerScript DEPC PCR 1uLcDNAcDNAPCR扩增，其余小量分PCRNLRP3依据TaKaRa提供的引物合成说明书，用超纯水稀释引物至终浓度20pmol/uL。稀释之前用低速离心机离心数秒，稀释操作过程中要操作，避TaKaRaLATaqPCRPCRPCRdNTPTaKaRaLA10×LATaqPCR 35PCRPCRDNADNA1.5mLEp管中，称量凝胶重量并计算凝胶体积（1mg=1μL的比例进行计算）。4DR-IBuffer，65℃6～10min，并于其间轻摇几次EPDR-IBuffer1/2DR-IIBufferSpinColumnCollectionTubeSpinColumn内，12000rpm1min，弃滤液。500μLRinseASpinColumn12000rpm30s700μLRinseBSpinColumn12000rpm30s⑻将SpinColumnEP30μL去离子水洗脱DNA12000rpm1min1μL感受态细胞（JM109）的（氯化钙法-80℃40μl在琼脂平板上复苏，37℃37℃2-3mLLB培养基，用灭菌的牙签挑取LB37℃摇床培养过夜。⑷取前一天摇的菌液100μl于新的灭菌10mLLB中，放到37℃摇，2h100mL250mL3min，4℃7000prm10min，弃上清。3mL0.1mol/LCaCl2轻轻吸打悬浮菌体，然后两管并为一管，4℃7000rpm离心，10min，弃上清。1mLCaCl215%100μl1.5mLEp管中，-80℃pMD18-T0.2mLPCRPCR回收产物

ab灭菌双蒸 cLigation 50-100μL5-10μLPCR连接产物，30min。42℃45-60s2minAmp/LB/X-gal/IPTG平板上，待菌液被平板吸收后，将37℃温箱中倒置培养过夜。PCR鉴定PCR鉴定:10×LATaqBufferdNTPMixture

上游引 下游引 TaKaRaLA 灭菌双蒸 分别用灭菌牙签挑选若干白斑，在反应体系中捻动数次，弃掉牙签，盖好PCRPCR 30more PCR3mL(100μg/mL)LB培养基中，37℃250μLSolutionI(含RNaseA1)，充分悬浮细菌沉淀。250μLSolutionII5～6次使其混匀，让菌体充400μL4℃SolutionIII5～6次使其混匀，直2min，12000rpm10min，取上清。SpinColumnCollectionTubeSpinColumn12000rpm1min，弃滤液。SpinColumn40μLDNA1min，12000rpm1min，回收⑾取1μL质粒DNAPCR1：50PCR扩增，反25uL如下：10×LATaqBufferdNTPMixture

上游引 下游引 TaKaRaLA 稀释质 灭菌双蒸 PCR 30more 1μLPCR取三黄鸡的PCR鉴定阳性质粒pMD18-T-C-NLRP3NcoⅠXhoⅠ双酶切20μL体系中进行，包括：10×K将提取的重组质粒送至宝生物工程(大连)公司，序列正确的三黄鸡pMD18-T-C-NLRP3。用DNAMAN6.0、DNAStar7.0软件对不同物种的NLRP3序列和氨基酸序列进行同源性分析；用DNAMAN6.0构建NLRP3系统进化树；用ProtParamTool()分析氨基酸组成、等电点等理化性质；用SignalP4.1Server()分析蛋白质信号肽；用ProtScale()分析蛋白质的疏水性；用Conserveds工具，分析三黄鸡NLRP3保守区结构域；用TMpred()分析预测蛋白质的跨膜三黄鸡NLRP3荧光定量实根据Genbank中三黄鸡NLRP3(登录号为KF318520)设计1对特异性R1,253bpR2连)合成。:–-PCR扩增三黄鸡8个组织的NLRP3荧光片RNA、反转录成PCR反应体系。分别以三黄鸡各个组织cDNA为模板，NLRP3荧光片段PCR反应体系NLRP3荧光片段PCR反应体10×ExTaq dNTP Forward Reverse TaKaRaEx NLRP3荧光片段的PCR反应条件 35 2%PCRPCR扩增三黄鸡8个组织的β-actin荧光片分别以三黄鸡各个组织cDNA为模板，β-actin荧光片段的PCR反应体β-actinPCR反应体10×ExTaq dNTP Forward Reverse TaKaRaEx β-actin的PCR反应条件 2%PCRPCR，重组质粒正确后利用1ug/ul的重组质粒模板作为标准曲线的最高PCR扩增。PCRSYBR®PremixEx Forward Reverse ROXReferenceDye 重组质 PCRPCRSYBR®PremixEx Forward Reverse ROXReferenceDye 与β-actin实验程序均为Stage30StageStageABIreal-timeRT-PCR7500systemsoftware软件对结果进行统计计算，SPSS20.0P值检（1）PCRNLRP3ORF10×ExTaqdNTPTaKaRaExPCR 35moretimes 2min30s PCRPCR(2)PCRPET32α（+）载体的连接、、。PET32α（+）-NLRP3PCR、0。PET32α（+）-NLRP3的双酶切鉴定10×K重组质粒及分PCR和双酶切鉴定都为阳性的重组质粒送宝生物工程（大连）有限公司，命名为PET32α（+）-NLRP3。NLRP3将鉴定后的阳性重组质粒PET32α（+）-NLRP3重新转化到感受态细胞BL21(DE3)中,并均匀涂布于含Amp的LB平板上，温箱培养过夜。同时设置LB/Amp的液体培养基中，37°C摇床4~6OD600达到0.8~1.0时，留取部分菌液保种。1mMIPTG37°C5h1mL10min，4°C12000rpm10min50μL0.2MTris-Cl（pH8.0）50μL的2×SDS100°C10min12000rmp5min，10uL上样，同时设立蛋白标准分子量对照。80V120V，染色当电泳结束后取下凝胶，用不低于5倍体积的考马斯亮兰，4hWesternBlottingSDS结束后，取出垫-滤纸-PVDF膜-滤纸-纤维垫的顺序，装入转印夹中。PVDF膜侧接正极，4°C200mA2h。PVDFS5～10min。用铅笔标出作为分子量的用TBST对PVDF膜进行脱色，直至红色条件下孵育过夜）加入HIS单克隆抗体（1:1000），摇室温孵育1h（或2～8°C条件TBST35min加入稀释的辣根酶标记抗兔IgG（1:5000），摇室温孵育30min。TBST35min。检测将PVDF膜置于TanonFineDoX6全自动化学发光图像分析系统的暗箱中，将稀释好的HPR化学发光试剂加至PVDF膜上，经一定时间，在电脑屏幕三黄鸡NLRP3NLRP31L4h的细菌培养物置于预先称重的离心管中，4℃5000g弃上清，称沉淀的重量，每克(湿重)5mLPBS缓冲液，轻轻悬动，12000g10PBS2×SDS凝5min，12000rpm3minSDS电泳后用蒸馏水反复凝胶3遍再用PBS3遍用4℃预冷的0.25mol/LKCl30sPBS3次，4℃静置过夜。次日4000g离心，201mg/mL。NLRP3蛋白多克隆抗体的。动物免疫将上述纯化的蛋白(浓度约1mg/mL)与弗氏完全佐剂混合后500μg/500μL纯化的重组蛋白，加入等量的弗氏完全佐剂，并用两个注射器和胶管成乳白色乳剂后免疫新西兰兔剂的鉴定：将。脉少量采血，经ELISA和琼扩检测抗体效价，合格后即可采血。50mL灭菌离心管收集箱中过夜，取出后4000r/min离心10min。将转移到新的洁净的离心管中，5630minNaN30.02%，分装后-80℃保存。（8三黄鸡NLRP3的组织学分1cm，放入10％中尔固定48h以上。10h⑶梯度(70%：5h；80%：4h；90%：3h；95%：2h；100%I：20min；100%II：20min)脱水。二甲苯(I：25minII：25min)透明。⑷561.5h4μm42°C12h90%、80%、70%各3min，蒸馏水2min)。3%H2O2(甲醇:H2O29:1)10min0.02MPBS5min×30.02MPBS5min×31:200PBS替代一抗作为空白对照，371.5h0.02MPBS5min×31:4000IgG，371h0.02MPBS5min×3DAB显色：DAB5min0.02MPBS5min×41:101min10min⒅梯度脱水(70%、80%、90%、95%各3min，无水乙醇I5min，无水II5minI10minII10min)。无棕黄色颗粒的判为5%的判为弱阳性；明亮的棕黄色颗粒在组织中零星分布且比例大于50%或片状染色的的判为三黄鸡NLRP3的克隆与质粒的鉴的扩增产物，经1%琼脂糖凝胶电泳检测，得到一条单一的条带，其大小与预测的NLRP3的理论大小相符。将目的片段克隆到pMD18-T载体，转化E.coli三黄鸡NLRP3的PCR鉴定和双酶切鉴定结果（图3.1。重组质粒pMD18-T-C-NLRP3经分析结果正确，并将序列上传到NCBI上，序列号为图3.1三黄鸡NLRP3的PCR鉴定、双酶切鉴定结重组质粒的双酶切产物三黄鸡NLRP3的序列分将三黄鸡NLRP3与牛（ ）、羊（KM236558）、 进行序列比对发现三黄鸡NLRP353.7%、55.4%、54.3%、54.5%、53.5%、53.7%（图3.2）。用DNAMAN构建NLRP3系统进化树，结果显示该哺乳类动物间的同源性高，鸡和哺乳类动52%（3.3）。ProParamNLRP3蛋白的理化性质分5.62。ProtScale对其的疏水性进行分析发现该蛋白最大的疏水指数位于第Server对其信号肽预测分析表明该蛋白不存在信号肽（3.5）。sPYD结构域、NACHT结构域、LRR结构域，是结构保守蛋白（3.6）TMpred软件分析其二级结构，发现该蛋白存（loop1（3.7）图3.2NLRP3的同源性比图3.3NLRP3的系统进化3.4NLRP33.5NLRP33.6NLRP33.7NLRP3三黄鸡荧光定量实验NLRP3和β-actin的鉴相应的特异性条带，其大小与理论推测相符（3.8←β-图3.8用于荧光定量三黄鸡 和β-actinPCR结果SyberGreenIreal-timePCR时，判断产物反应特SyberGreenI分PCRSyberGreenI结合。3.93.10NLRP3基图3.10三黄鸡β-actin的荧光定量实验的溶解曲PCRNLRP3和β-actin的荧光定量PCR扩增曲线分别如图3.11和图3.12所示。两个的扩增曲线均分为三个时期：基数期、指数期和平台期。在基数终的PCR产物量不能计算出起始DNA拷贝数。在指数扩增期，PCR产物量的 图3.11三黄鸡NLRP3的荧光定量PCR扩增曲图3.12三黄鸡β-actin的荧光定量PCR扩增曲将NLRP3和β-actin的重组质粒作为模板，模板稀释后作为标准样品，将未知的待测样品和标准样品置于同一实验中进行荧光定量PCR，用PCR产物量的对数值与起始3.133.14所示。NLRP3的标准曲线方程为：y=-2.758973x+29.080881(R2=0.999497)此标准曲线的R2>0.99。β-actin的标准曲线方程为：y=-2.758807x+22.635201(R2=0.999815)R2>0.99。图3.13三黄鸡NLRP3的标准曲图3.14三黄鸡β-actin的标准曲NLRP3在各个组织的相对表达水NLRP3在三黄鸡心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、大脑、气管、法囊组织中均有表达。NLRP3在三黄鸡的肺脏和气管中表达量明显高于其它表3.1NLRP3在各个组织的相对表达水组 NLRP3相对表达水平（心 肝 脾 肺 肾 大 气 法氏 图3.15三黄鸡NLRP3在各个组织的相对表达水PCR扩增获得NLRP3片断，将片段与PET32α(+)载体同时分别进行挑取阳性菌落做质粒PCR3.162205bp3.16PET32α(+)-NLRP3PCR（M：DL5000DNAMarker；1：PCR；2PET32α(+)-NLRP3NLRP3将阳性BL21(DE3)IPTG浓度为1mM的LB培养基度37°CWB检测，得到单一条带，且大小与目的条带一致（3.17,3.18）3.17PET32α(+)-NLRP3蛋白图3.18His单克隆抗体检测NLRP3的表3.19,3.20。3.19SDS3.20WB三黄鸡NLRP3蛋白多克隆抗体的将好的抗体用WB方法检测，图3.21结果显示：所的抗体能与抗 的抗特异性较好。图3.21抗特异性检检测结果表明：三黄鸡NLRP3蛋白在检测组织的阳性染色细胞的细胞质中均有不同程度的表达和分布。NLRP3蛋白在心脏和脾脏呈现弱阳性至中强阳性呈（图3.22A）。肺泡上皮细胞呈现强阳性反应（图3.22B）。心肌细胞呈部分基质呈现弱阳性反应，神经元细胞则呈现中至强阳性反应（3.22D）。在脾脏内皮网状细胞呈现弱阳性至中强阳性反应而淋巴细胞呈图3.22E）反应。法氏囊黏膜上皮细胞呈现中至强阳性反应（3.22F）。在肝脏，部分肝细胞呈现中至强阳性反应（3.22G）。在肾脏，大多数肾小管上皮细胞呈现中至强阳性反应，而肾小球和肾小球囊细胞呈（图3.22H）。气管纤毛上皮细胞，基底细胞，固有层和粘膜下层细胞呈强阳性，环状软骨细胞呈Scanbar=50µm肺泡上皮细胞呈现强阳性反应。Scanbar=50µmC心肌细胞呈弱阳性至中强阳性，心肌间结缔组织呈。Scanbar=50µm大脑皮层部分基质呈弱阳性，神经元细胞呈中至强阳性。Scanbar=50µm脾脏内皮网状细胞呈弱阳性至中强阳性，淋巴细胞呈。Scanbar=50µmScanbar=50µmGScanbar=50µmH大多数肾小管上皮细胞呈中至强阳性，肾小球和肾小球囊细胞呈。Scanbar=50µm图3.22NLRP3在三黄鸡的检测组织内分布的免疫组织化学检炎性复合体在感受来自病原微生物的病原相关分子模式(pathogenassociatedmolecularpatterns,PAMPs)和受损或细胞释放的损伤相关分子模式(damageassociatedmolecularpatternsDAMPS)，包括微生物配体，细胞因子和活性氧簇，就会被重新组装而激活，从而参与到机体性免疫应答之中（Elinavetal.,种各样的炎症性疾病（Strowigetal.2012）。作为最重要的感受器之一，NLRP3（Burdetteetal.2012；Pontilloetal.2012；Pontilloetal.2012；Shietal.,2012）。NLRP3蛋白的组织表达形式可以有助于阐明其在鸡炎症性疾病过程中NLRP3在鸡的组织特异性表达和分布的详细数据，NLRP3在禽类炎症性疾病中作用的进一步研究。本研究对三黄鸡NLRP3进行了克隆和序列分析比对。结果显示，该基通过对鸡IL-1β序列进行分析也发现了IL-1β在哺乳类动物和禽类之制。我们关于鸡NLRP3与其他物种同源性的分析结果，将会为哺乳类和禽不受caspase-1约束的细胞凋亡通路等，有着广泛和密切的联系（Anandetal.,2011；Pothlichetetal.,2013；Sutterwalaetal.,2014；Zhangetal.,2012）。本试验所的鸡NLRP3多克隆抗体有助于对NLRP3炎性复合体诱导的信号通路实时荧光定量和免疫组织化学检测的结果分别显示了NLRP3和蛋白在三黄鸡组织中的表达情况。NLRP3mRNA在三黄鸡所检测的所有组织中均有表NLRP3mRNA，新城疫等的主要发病场所，其对宿主有着重要的影响作用（Villegas,1998）。由于的，IL-1β表达量发生了改变，这证明NLRP3炎性复合体得到了激活（Yuetal.,2014）。NLRP3蛋白表达的免疫组织化学分析Mansson（Manssonetal.,2011）NALP3mRNA和蛋白存在于鼻息肉和正常的上呼我们之前关于NLRP3蛋白在BALB/c小鼠组织中分布情况的是相一致的（Huangetal.,2014）。由于法氏囊是禽类相比于哺乳类动物所特有的免疫，在病原体对鸡的中扮演着重要的角色，因此，NLRP3可能是这个发生炎症反应的重要分子。之前也有报告显示，NLRP3蛋白可以在人类的主要免疫细胞中被检测出来（Kummeretal.,2007）。这些结果表明，NLRP3在炎症反应中的作用是具有位点专一性的。BALB/c小鼠NLRP3蛋白表达的免疫组织化学结果显示，只有极少量的肝细胞呈现中至强阳性反应（Huangetal.,2014），NLRP3蛋白表达结果中，则有相当大部分肝细胞呈现中这些结果说明，NLRP3组织分布的不同可以因此推断出生物物种的不同。NLRP3对于调控炎性复合体激活以避免过度活化所造成的不良结果具有非NLRP3的研究主要集中在哺乳类动物，如人和小鼠。三黄鸡是华南地区最重要的优质肉鸡品种也是综合防控压力极大鸡NLRP3在鸡的组织特异性表达和分布的NLRP3在禽类炎症性疾病中作用的不利因素。本研究对三黄鸡NLRP3进行了克隆和序列分析，通过重组原核表达纯化蛋白出多克隆抗体，分别通过实时荧光定量PCR和免疫组织化学NLRP3mRNANLRP3蛋白的组织分布。研究结果显示，三黄鸡NLRP3与牛、羊、猪、狨、人、猕猴、小53.7%。该在哺乳类动物间的同源性高，在鸡和哺乳类动物间的同源性低，仅有52%。NLRP3mRNA在所有检测的组织中均有表达，且在气管和肺中的表果表明，鸡NLRP3克隆及序列分析，组织特异性表达和分布将有助于阐明 两年时间以来对我耐心的指导和无微不至的。尽管只是两年时间的相处，但勤勤恳恳，踏踏实实工作的行为却已经深深地了我。作为导师，宁老师以自己的实际行动为我们这些树立了一个值得学习和敬佩的榜样宁老师是一个的老师，也是一个严格要求的导师。对于学术之外的事情，宁老师对我们格外宽容，可以，但是只要涉及到人品、学术道德和学术态度，他对我们这些却是异常的严厉，不容许有一点的不端和随便的行为。宁老师钻研实验。两年时间转瞬即逝，我也即将离开以宁老师为的病理教研室，但是，宁老师在做人和做事方面对我的教育会一直影响着我的一生。在即程中给予的和帮助。医解剖组胚教研室叶亚琼师姐、梁美乐、张丽华同学，在实验和写作过程中过以及过我的所有老师、同学以及已毕业的师兄师姐。在毕业之际，我还要感谢我的家人。感谢他们在我两年的阶段，始终包容着我的，支持着我的决定，在物质上和精神上给予我无微不至的关在即将完成之际，再一次向所有关心、帮助、支持我的亲人、老师、同南表示最衷心的感谢!AgostiniL,MartinonF,BurnsK,etal..NALP3formsanIL-1beta-processinginflsomewithincreasedactivityinMuckle-Wellsautoinfltorydisorder[J].Immunity,AkiraS,UematsuS,TakeuchiO.Pathogenrecognitionandinnateimmunity[J].Cell,AllenIC,ScullMA,MooreCB,etal..TheNLRP3inflsomemediatesinvivoinnateimmunitytoinfluenzaa 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