荧光探针技术测定细胞内离子浓

荧光探针测定细胞内离子浓度技术陶亮中山医学院药理教研室当前第1页\共有58页\编于星期四\11点细胞内离子cytoplasmNa+Cl-Ca2+K+Fe2+当前第2页\共有58页\编于星期四\11点细胞内离子的生理功能细胞结构的组成成分

血红蛋白中Fe2+、超氧化物歧化酶中Cu2+维持细胞膜电位

K+、Cl-、Na+、Ca2+维持胞内外渗透压

Na+

协同转运葡萄糖等营养物质排泄代谢产物当前第3页\共有58页\编于星期四\11点细胞内离子浓度异常与疾病当前第4页\共有58页\编于星期四\11点细胞内Ca2+异常与疾病高血压骨质疏松癫痫当前第5页\共有58页\编于星期四\11点细胞内Na+异常与疾病心律失常猝死当前第6页\共有58页\编于星期四\11点细胞内K+异常与疾病惊厥阵发性舞蹈手足徐动症当前第7页\共有58页\编于星期四\11点细胞内离子浓度测定意义预防疾病的发生提高疾病诊断的准确性增强治疗疗效当前第8页\共有58页\编于星期四\11点常用细胞内离子浓度测定方法当前第9页\共有58页\编于星期四\11点常用测定方法原子吸收光谱法——微量金属元素的测定：Na＋、K＋、Ca2+化学滴定法

——有机化合物与离子可产生颜色变化

如：Ca2+可使铬黑T由蓝变红，使钙盐指示剂钙红从蓝变为酒红。放射性标记法——放射性标记目标离子，如［45Ca］微电极法荧光探针法

当前第10页\共有58页\编于星期四\11点其他新技术核磁共振法NMR不同脲素浓度下,通过监测1H,15N信号强度变化监控MMP-12折叠过程当前第11页\共有58页\编于星期四\11点其他新技术生物芯片技术荧光强度反应荧光标记抗体与相应抗原结合程度LuisA.Rivas,

et.al.

A200-AntibodyMicroarrayBiochipforEnvironmentalMonitoring:SearchingforUniversalMicrobialBiomarkersthroughImmunoprofiling当前第12页\共有58页\编于星期四\11点荧光探针荧光：某些物质吸收了与它本身特征频率相同的光量子后，其原子中的电子被激发到较高的能级，从而产生吸收光谱，有些物质，当用紫外线照射时，它吸收了某种波长的光后还会发射处各种颜色和不同强度的光，而当紫外线停止照射后，这种光也随之消失，这种光称之为荧光。分类：自发性荧光：组织在短波长光照射下自行发射出的荧光，如组织中蛋白质和酯类在紫外线照射下发出微弱的淡蓝色荧光；

诱发荧光：组织与荧光色素结合后，经一定波长的光线照射后发出的荧光荧光探针：常用的诱发荧光，能产生荧光的生物染色剂称之为荧光染料或荧光探针当前第13页\共有58页\编于星期四\11点荧光探针技术的应用当前第14页\共有58页\编于星期四\11点pH测定GuoliangKe,et.al.ACell-Surface-AnchoredRatiometricFluorescentProbeforExtracellularpHSensingpH在时，不同pH值，荧光探针具有不同荧光强度当前第15页\共有58页\编于星期四\11点细胞间通讯GJIC检测当前第16页\共有58页\编于星期四\11点标记活细胞线粒体线粒体荧光探针骨架蛋白MergeAbhikMallick,et.al.DualDrugConjugatedNanoparticleforSimultaneousTargetingofMitochondriaandNucleusinCancerCells当前第17页\共有58页\编于星期四\11点DNA标记通过X－Ray检测口服有机硅修饰PI荧光探针的口服吸收过程MichihiroNakamura,

et.al.Thiol-OrganosilicaParticlesInternallyFunctionalizedwithPropidiumIodideasaMulticolorFluorescenceandX‐rayComputedTomographyProbeandApplicationforNon-InvasiveFunctionalGastrointestinalTractImaging当前第18页\共有58页\编于星期四\11点细胞膜电位检测JihoonKim,et.al.RapidCytotoxicityScreeningPlatformforAmyloidInhibitorsUsingaMembrane-PotentialSensitiveFluorescentProbe细胞凋亡时，膜电位改变，膜结合荧光探针的强度反应细胞凋亡程度当前第19页\共有58页\编于星期四\11点荧光探针技术测定过程荧光探针的负载荧光探针与目的离子结合荧光强度检测：荧光显微镜、流式细胞术、双波长荧光光度计当前第20页\共有58页\编于星期四\11点荧光探针应用条件负载：探针必须局限于要测定离子浓度的区域，最常见

的部位是细胞液，但有时为线粒体；校准：探针的荧光强度必须与游离离子浓度定量相关当前第21页\共有58页\编于星期四\11点荧光探针的负载大量负载：AM酯负载酸负载ATP－诱导渗透阳离子脂质体递送电穿孔低渗休克单细胞负载——显微注射法膜片钳技术微量电泳法压力注射法当前第22页\共有58页\编于星期四\11点荧光探针的负载—AM酯负载AM负载技术：Ca2+及其它阳离子探针的羧基和PH探针的酚羟基被分别衍生为乙酰甲酯或乙酸酯，使探针可透过细胞膜并对离子不敏感，一旦进入细胞内，这些衍生的探针就可被普遍存在的细胞内酯酶水解，释放出离子敏感的多阴离子探针不足：区室化：细胞内膜包结构聚集AM酯不完全水解渗漏：有机离子载体、P糖蛋白多药载体等排除胞外当前第23页\共有58页\编于星期四\11点荧光探针的负载—AM酯负载当前第24页\共有58页\编于星期四\11点离解常数Kd：将荧光信号转化为离子信号的关键转换参数校准过程：记录对应于精确控制的离子浓度的荧光信号，通过换算计算出解离常数Kd，荧光探针的校准当前第25页\共有58页\编于星期四\11点荧光探针技术检测Ca2+当前第26页\共有58页\编于星期四\11点Ca2+荧光探针分类紫外光激发的荧光Ca2+探针可见光激发的荧光Ca2+探针荧光Ca2+探针交联物生物性发光Ca2+探针当前第27页\共有58页\编于星期四\11点紫外光激发的荧光Ca2+探针高亲和力的钙探针：Fura-2,

Indo-1及其衍生物Fura-2－成像显微镜首选Indo-1－流式细胞术首选中等亲和力的钙探针：

Fura-4F、Fura-5F、Fura-6F、Fura-FF、Indo-5F低亲和力的钙探针：BTC／BTC-AM，Mag-Fura-2、Mag-Fura-5、Mag-Indo-1金鸡纳皮素（Quin）-2和Quin-2AM

吸收率和量子产率比低，主要用来耗竭胞质液中游离Ca2+，确保单向性Ca2+内流

当前第28页\共有58页\编于星期四\11点可见光激发的荧光Ca2+探针高亲和力的钙探针：

Fluo-3、Fluo-4、Rhod-2和相关的衍生物基于Fluo-3和Rhod-2的低亲和力的钙探针：

Fluo-5F、Fluo-4FF、Fluo-5N、Mag-Fluo-4、Rhod-5N钙绿Calcium

Green、钙橙Calcium

Orange、钙深红Calcium

Crimson探针Fura

Red探针钙黄绿素Calcein当前第29页\共有58页\编于星期四\11点荧光Ca2+探针交联物葡聚糖交联物：Fura、Fluo-4和Indo葡聚糖水溶性，低毒性，无生物活性抵抗内源性糖苷酶的裂解极少区室化很好的存在于活细胞内亲脂性衍生物：Fura-C18、Fura-FF-C18和钙绿-C18与膜表面结合，检测局部浓度变化当前第30页\共有58页\编于星期四\11点生物性发光Ca2+探针水母素、重组水母素及其衍生物从发光的水母和其他海洋生物中分离得到的发光蛋白优点：可排除自发荧光的干扰不渗出，不分泌不发生区室化或细胞内隔离检测长期间内Ca2+变化当前第31页\共有58页\编于星期四\11点Fluo-4荧光探针检测Ca2+Bright-FieldFluo-4

fluorescence

MergeChenyeYang,et.al.

ContinuousFluorescenceImagingofIntracellularCalciumbyUseofIon-SelectiveNanosphereswithAdjustableSpectra当前第32页\共有58页\编于星期四\11点荧光探针技术检测Na+、K+及其它离子当前第33页\共有58页\编于星期四\11点荧光探针技术检测Na+和K+SBFI和PBFI及其AM酯：苯并呋喃基荧光团连接到一种冠醚

螯合剂SBFI：对Na+选择性强PBFI：对K+选择性强

SBFI和PBFI的应用：

SBPI用于测定分离线粒体的Na+梯度或不同组织和细胞内Na+水平或Na+外流

PBFI用于测定K+外流与细胞凋亡间关系当前第34页\共有58页\编于星期四\11点荧光探针技术检测Na+钠绿比SBFI对Na+的选择性更高激发波长488nm，可替代Confocal和流式细胞仪进行检测对细胞光损伤小应用：评估大鼠丘脑神经元持续Na+蓄积检测缺氧诱导的神经元Na+内流当前第35页\共有58页\编于星期四\11点荧光探针技术检测Na+CoroNa

RedCoroNa

Red氯化物细胞通透性酯对Na+高选择性应用：对细胞的Na+内流产生敏感反应测定培养的上皮细胞和人肺组织气管气道表面液体当前第36页\共有58页\编于星期四\11点SBFI荧光探针技术检测Na+ChristopheM.Lamy,et.al.SodiumSensinginNeuronswithaDendrimer-BasedNanoprobeControlTTXTTX阻断Na+通道，Na+荧光探针标记Na+，膜Na+电位紊乱当前第37页\共有58页\编于星期四\11点荧光探针技术检测其它离子荧光Cl－探针：6-甲氧基喹啉衍生物SPQ检测原理：经扩散限制的碰撞淬灭应用：用于检测CFTR活性其他转运蛋白，如GABAA、红细胞Cl－／HCO3交换器等荧光探针技术检测其他离子氰化物硫化物、亚硫酸根、硫酸根、硫代硫酸根亚硝酸根、硝酸跟和一氧化氮磷酸根和焦磷酸根硒当前第38页\共有58页\编于星期四\11点荧光探针技术检测pH当前第39页\共有58页\编于星期四\11点荧光探针技术检测pH细胞内胞质液pH常为6.8－7.4，而酸性细胞器内pH则为4.5－6.0细胞内pH值可部分发生改变，而且速度相当慢荧光pH探针可有效检测不同生理和病理过程中pH变化生理范围的pH测定－SNARF、SNAFL酸性细胞器的pH测定－LysoSensor探针当前第40页\共有58页\编于星期四\11点用于测定近中性pH的荧光探针荧光素黄——中性pH测定首选发射波长较长、量子产率高易从细胞内流失荧光素黄衍生物BCECF－2`,7`-二(2-羧乙基)-5(6)-羧基荧光素不易透过细胞膜pKa=6.98,更适于生理条件下pH的测定SNAFLs－半萘酚荧光素类pKa在7.6－7.9范围内均发生漂移,可用比率法测定体系的pH值当前第41页\共有58页\编于星期四\11点SNAFLs－半萘酚荧光素类共轭程度更大,其吸收波长也更长当前第42页\共有58页\编于星期四\11点酸性pH使用的探针LysoSensor探针与生物大分子共价结合，通过细胞固有机制主动摄取检测酸性细胞器，追踪酸性细胞器运输俄勒冈绿和二氯荧光黄衍生物当前第43页\共有58页\编于星期四\11点荧光探针技术检测pH不同pH条件下，荧光探针CN-pH荧光强度不同，测定荧光强度可计算出相应的pH值BaoliDong,et.al.DualSite-ControlledandLysosome-TargetedIntramolecularChargeTransfer−PhotoinducedElectronTransfer−FluorescenceResonanceEnergyTransferFluorescentProbeforMonitoringpHChangesinLivingCells当前第44页\共有58页\编于星期四\11点荧光探针强度检测方法的选择激光共聚焦显微镜流式细胞仪双波长荧光光度计当前第45页\共有58页\编于星期四\11点激光共聚焦显微镜（LSCM）当前第46页\共有58页\编于星期四\11点LSCM探针选择荧光探针与研究的结构有密切关系选择荧光强度较强的探针同时应用多种荧光探针时，避免发射光谱重叠荧光探针溶剂对荧光强度无影响如组织需固定，选择耐受固定剂的荧光探针当前第47页\共有58页\编于星期四\11点荧光信号的检测Gm促进Rhod－2标记的Ca2+向胞浆转移EdgarJ.Paredes-Gamero,et.al.

Cell

PermeableGomesinPeptidePromotesCellDeathbyIntracellularCa2+Overload当前第48页\共有58页\编于星期四\11点流式细胞仪当前第49页\共有58页\编于星期四\11点荧光探针的选择当前第50页\共有58页\编于星期四\11点荧光信号检测Wan-KyuOh,et.al.FluorescentPolymerNanoparticleforSelectiveSensingofIntracellularHydrogenPeroxide检测FITC-PAN标记的H2O2的释放量当前第51页\共有58页\编于星期四\11点双波长荧光光度法当前第52页\共有58页\编于星期四\11点双波长荧光光度法应用条件：a)干扰组分在该两波长处的吸光度相同b)被测组分在该两波长的吸光度差ΔA要足够大当前第53页\共有58页\编于星期四\11点双波长荧光光度法测定Ca2+原理：荧光探针：第一代：quin-2

第二代：Fura-2—用于双波长荧光示踪测定[Ca2+]i

第三代：Fluo-3—用于激光光聚焦显微镜测定[Ca2+]iFura-2有二种形式Fura-2—游离形式，不能透过细胞膜，可与Ca2+结合；

激发峰值:380nm，与Ca2