第五章分子生物学基本研究法(上)

第五章分子生物学基本研究法（上）DNA、RNA及蛋白质操作技术当前第1页\共有155页\编于星期五\22点现代分子生物学的快速发展，得益于上个世纪中叶以来研究方法、特别是基因操作和基因工程技术的进步。基因操作主要包括DNA分子的切割与连接、杂交、电泳、细胞转化、核酸序列分析以及基因人工合成、表达、定点突变和PCR扩增等，是分子生物学研究的核心技术。当前第2页\共有155页\编于星期五\22点基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，使之进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续稳定的繁殖和表达。基因工程技术是核酸操作技术的一部分，只不过它强调了外源核酸分子在另一种不同的寄主细胞中的繁衍与性状表达。事实上，这种跨越物种屏障、把来自其它生物的基因置于新的寄主生物细胞之中的能力，是基因工程技术区别于其它技术的根本特征。当前第3页\共有155页\编于星期五\22点重组DNA技术发展史上的重大事件三大成就：在20世纪40年代确定了遗传信息的携带者、即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题；50年代提出了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题；50年代末至60年代，相继提出了“中心法则”和操纵子学说,成功地破译了遗传密码，阐明了遗传信息的流动与表达机制。当前第4页\共有155页\编于星期五\22点5.1基因操作的基本工具（一）限制性核酸内切酶能够识别DNA上的特定碱基序列并从这个位点切开DNA分子。第一个核酸内切酶EcoRI是Boyer实验室在1972年发现的，它能特异性识别GAATTC序列，将双链DNA分子在这个位点切开并产生具有粘性末端的小片段。当前第5页\共有155页\编于星期五\22点内切酶酶切位点内切酶酶切位点BamHⅠGGATCCCCTAGGEcoRⅠGAATTCCTTAAGBanⅡHgiJⅡG(A/G)GC(TC)CC(T/C)CG(A/G)GEcoRⅤEco32ⅠGATATCCTATAGBglⅡAGATCTTCTAGAHindⅢAAGCTTTTCGAAAsuⅡBstBⅠTTCGAAAAGCTTPstⅠCTGCAGGACGTCBstPⅠEco91ⅠGGTNACCCCANTGGFbaⅠBclⅠTGATCAACTAGTDraⅠAhaⅢTTTAAAAAATTTMspⅠHpaⅡCCGGGGCCEco72ⅠCACGTGGTGCACKpnⅠGGTACCCCATGG图5-1几种主要DNA内切酶所识别的序列及其酶切末端。当前第6页\共有155页\编于星期五\22点PvuIIEcoRI当前第7页\共有155页\编于星期五\22点（二）基因克隆的载体载体三要素：自我复制能力；携带外源基因片段大小；插入位点多少；易于鉴定识别程度。当前第8页\共有155页\编于星期五\22点仅仅能在体外利用限制性核酸内切酶和DNA连接酶进行DNA的切割和重组，还不能满足基因工程的要求，只有将它们连接到具备自主复制能力的DNA分子上，才能在寄主细胞中进行繁殖。具备自主复制能力的DNA分子就是分子克隆的载体（vector）。病毒、噬菌体和质粒等小分子量复制子都可以作为基因导入的载体。当前第9页\共有155页\编于星期五\22点pBR322质粒载体由三个不同来源的部分组成的：第一部分来源于pSF2124质粒易位子Tn3的氨苄青霉素抗性基因（AmpR）；第二部分来源于pSC101质粒的四环素抗性基因（tetr）；第三部分则来源于ColE1的派生质粒pMB1的DNA复制起点（ori）。当前第10页\共有155页\编于星期五\22点AmpR当前第11页\共有155页\编于星期五\22点重组DNA操作过程示意图当前第12页\共有155页\编于星期五\22点图5-2DNA连接酶能把不同的DNA片段连接成一个整体

当前第13页\共有155页\编于星期五\22点获得了用外源DNA片段和载体分子重组而成的杂种DNA分子后，还必须通过一个被称为细菌转化的过程将其重新导入到寄主细胞中，才能保证重组DNA分子的增殖（图5-3）。当前第14页\共有155页\编于星期五\22点图5-3重组DNA操作过程示意图

当前第15页\共有155页\编于星期五\22点5.2DNA操作技术5.2.1核酸的凝胶电泳自从琼脂糖（agarose）和聚丙烯酰胺（polyacrylamide）凝胶被引入核酸研究以来，按分子量大小分离DNA的凝胶电泳技术，已经发展成为一种分析鉴定重组DNA分子及蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段。当前第16页\共有155页\编于星期五\22点一种分子被放置到电场中，它就会以一定的速度移向适当的电极。我们把这种电泳分子在电场作用下的迁移速度，叫做电泳的迁移率，它与电场强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比，与片段大小成反比。当前第17页\共有155页\编于星期五\22点生理条件下，核酸分子中的磷酸基团呈离子化状态，所以，DNA和RNA又被称为多聚阴离子（polyanions），在电场中向正电极的方向迁移。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正电极方向迁移。当前第18页\共有155页\编于星期五\22点琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为0.2~50kb之间。聚丙烯酰胺凝胶的分辨范围为1到1000个碱基对之间。凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。当前第19页\共有155页\编于星期五\22点表5-2琼脂糖及聚丙烯酰胺凝胶分辨DNA片段的能力凝胶类型及浓度分离DNA的大小范围（bp）

0.3%琼脂糖50000~10000.7%琼脂糖20000~10001.4%琼脂糖6000~3004.0%聚丙烯酰胺1000~10010.0%聚丙烯酰胺500~2520.0%聚丙烯酰胺50~1当前第20页\共有155页\编于星期五\22点图5-4溴化乙锭染料的化学结构及其对DNA分子的插入作用。由于插入了溴化乙锭分子，在紫外光照射下，琼脂糖凝胶电泳中DNA的条带便呈现出橘黄色荧光，易于鉴定。当前第21页\共有155页\编于星期五\22点图5-4DNA脉冲电场凝胶电泳示意图当前第22页\共有155页\编于星期五\22点5.2.2细菌转化与目标DNA分子的增殖通过细菌转化方法将体外构建好的杂种DNA分子导入宿主细胞中。外源DNA通过自身载体上的复制起始点进行复制增殖，能在宿主细胞中长期保存下来，并能以完整的形式从细胞中被分离纯化出来。细菌转化（transformation），是指一种细菌菌株由于捕获了来自供体菌株的DNA而导致性状特征发生遗传改变的过程。提供转化DNA的菌株叫作供体菌株，接受转化DNA的细菌菌株则被称为受体菌株。当前第23页\共有155页\编于星期五\22点图5-5细菌转化及蓝白斑筛选

当前第24页\共有155页\编于星期五\22点为提高效率，可对受体菌进行物理或化学处理，增加其获取DNA的能力。经过这种处理的细胞被称作感受态细胞（competentcells）。当前第25页\共有155页\编于星期五\22点CaCl2法将快速生长期大肠杆菌置于经0℃预处理的低渗CaCl2溶液中，细胞膨胀，膜通透性改变，易与外源DNA相粘附。将该体系转移到42℃下做短暂的热刺激，外源DNA就可能被细胞吸收。将经过转化后的细胞置于选择性培养基上，筛选阳性克隆。转化效率可达到5×106~2×107个转化子/µg超螺旋质粒DNA。当前第26页\共有155页\编于星期五\22点DNA当前第27页\共有155页\编于星期五\22点电击法电脉冲可以在细胞膜上造成小凹陷，形成疏水孔洞。随着跨膜电压增加，大疏水性孔洞会转变为亲水性孔洞，介质中的DNA进入细胞质。将生长至对数中期的E.coli菌液冷却至4℃后离心，洗菌后用10%的甘油悬浮，将高密度菌液（~2×1010/ml）置于特制的电极杯中进行电击。当前第28页\共有155页\编于星期五\22点获得最大转化效率时场强一般为12.5~15kV/cm，时间跨度一般为4.5~5.5毫秒。电击转化与温度有关，一般在0~4℃进行。由于转化载体上常带有LacZ基因，多用带有不同抗生素（常用的抗生素包括氨苄青霉素、卡那霉素和四环素等）的选择性培养基结合α-互补蓝白斑筛选法鉴定转化细胞。当前第29页\共有155页\编于星期五\22点5.2.3聚合酶链式反应（PCR）技术聚合酶链式反应是快速扩增DNA序列最常用的方法。PCR反应的模板DNA若是基因组上的某个片段，就称为genomicPCR，若是mRNA反转录产生的cDNA，就称为RT-PCR。当前第30页\共有155页\编于星期五\22点PCR技术的原理首先将双链DNA分子在临近沸点的温度下加热分离成两条单链DNA分子，DNA聚合酶以单链DNA为模板并利用反应混合物中的四种脱氧核苷三磷酸合成新生的DNA互补链。当前第31页\共有155页\编于星期五\22点

PCR的基本反应步骤变性95˚C延伸72˚C退火Tm-5˚C当前第32页\共有155页\编于星期五\22点5Primer15Primer255TemplateDNAPCR技术原理当前第33页\共有155页\编于星期五\22点Cycle325～30次循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍以上。当前第34页\共有155页\编于星期五\22点DNA解链（变性）引物与模板DNA相结合（退火）DNA合成（链的延伸）三步。经不断重复循环之后，反应混合物中所含有的双链DNA分子数，即两条引物结合位点之间的DNA区段的拷贝数，理论上的最高值应是2n,实得1.8n.当前第35页\共有155页\编于星期五\22点图5-7聚合酶链式反应（PCR）技术当前第36页\共有155页\编于星期五\22点图5-8PCR指数扩增时循环次数与DNA产物数量的比较当前第37页\共有155页\编于星期五\22点1、将含有待扩增DNA样品的反应混合物放置在高温（>94℃）环境下加热1分钟，使双链DNA变性，形成单链模板DNA。94℃加热，变性当前第38页\共有155页\编于星期五\22点2、降低反应温度（退火，约50℃），约1分钟，使寡核苷酸引物与两条单链模板DNA结合在靶DNA区段两端的互补序列位置上。50℃~60℃，退火引物与模板DNA相结合当前第39页\共有155页\编于星期五\22点3、将反应混合物的温度上升到72℃左右保温1-数分钟，在DNA聚合酶的作用下，从引物的3'-端加入脱氧核苷三磷酸，并沿着模板分子按5'→3'方向延伸，合成新生DNA互补链。PCR扩增，72℃左右,按每分钟1000个碱基对设计循环往复当前第40页\共有155页\编于星期五\22点PCR反应体系：

常用30μl，各种成分的实际用量应根据实验者选用的该成分的终浓度及所拥有的储备液浓度进行核算。10×buffer：1×30/10=3μlMgCl2:1.5×30/25=1.8μldNTPs:0.2×30/10=0.6μl引物P：0.4×30×2/10=2.4μlTaq酶(5U/μl)：1/5=0.2μl

模板：1μl

水：30-3-1.8-0.6-2.4-0.2-1=21μl当前第41页\共有155页\编于星期五\22点

操作：

5份标本总体积30μl×6=180μl1.取一0.5mlEp管，依次加入下列试剂：

10×buffer：3μl×6=18μlMgCl2:1.8μl×6=10.8μldNTPs:0.6μl×6=3.6μl

引物P：2.4μl×6=14.4μlTaq酶(5U/μl)：0.2μl×6=1.2μl

水：21μl×6=126μl

共174μl，先用移液器/指弹混匀，后用离心机瞬时混匀（管壁上液体沉至管底）。当前第42页\共有155页\编于星期五\22点2.另取5支0.2mlEp管，分别加入上述液体29μl。3.分别取标本模板各1μl，加入上述5支Ep管中，混匀，分别加入2滴液体石蜡（防止加温过程中液体蒸发影响反应体积），离心机瞬时离心，备用。4.反应条件：PCR扩增仪

94℃30″，55℃30″，72℃1′，

35个循环，72℃延伸5′。

当前第43页\共有155页\编于星期五\22点PCR反应条件优化：1、温度、循环参数：⑴变性温度和时间：保证模板DNA解链完全是保证整个PCR扩增成功的关键。加热90～95℃，30～60s，再复杂的DNA分子也可变性为单链。根据模板DNA复杂程度，可以调整变性温度和时间。一般情况下选择94℃30″，可使各种复杂的DNA分子完全变性。温度过高或高温持续时间过长，可对Taq酶活性和dNTP分子造成损害。当前第44页\共有155页\编于星期五\22点⑵复性温度和时间：PCR扩增特异性取决于复性过程中引物与模板的结合。复性温度的选择，可根据引物的长度和G+C含量确定，长度在15～25bp之间时，复性温度Tm=4(G+C)+2(A+T)计算得到，一般位于40～60℃，30～60s。复性温度越高，产物特异性越高。复性温度越低，产物特异性越低。一般情况下选择55℃30″，足以使引物与模板之间完全结合。当前第45页\共有155页\编于星期五\22点⑶延伸温度和时间：一般位于Taq酶最适作用温度70～75℃之间。引物小于16个核苷酸时，过高的延伸温度不利于引物与模板的结合，可以缓慢升温到70～75℃。延伸反应时间，可根据待扩增片段的长度而定，<1Kb，1分钟足够；>1Kb需加长延伸时间，10Kb片段延伸时间可达15分钟。延伸时间过长可出现非特异扩增，常用72℃1′。

当前第46页\共有155页\编于星期五\22点⑷循环数：其他参数选定后，PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。理论上说20～25次循环后，PCR产物的积累即可达到最大值，实际操作中由于每步反应的产率不可能达到100%，因此不管模板浓度是多少，20～30次是比较合理的循环次数。循环次数越多，非特异扩增增加。当前第47页\共有155页\编于星期五\22点2、MgCl2浓度：可显著影响PCR的产量及产物特异性

1.5～2.0mM

过高：增加非特异扩增并影响产率过低：酶活性显著下降。

当前第48页\共有155页\编于星期五\22点3、引物：

0.2～1μM

偏高：非特异产物扩增及错配，增加引物之间形成引物二聚体，产量降低。偏低：产量降低。

引物设计原则：总原则是提高扩增的效率和特异性当前第49页\共有155页\编于星期五\22点引物设计原则⑴长度15～30b，过短特异性降低，过长则成本增加，产量也下降。⑵引物碱基尽可能随机分布，避免出现嘌呤、嘧啶堆积现象，引物G+C含量宜在45～55%左右。⑶引物内部不能含有自身互补序列，否则会形成发夹样二级结构，两个引物之间尤其在3’末端不应有互补链存在，不然会形成引物二聚体。⑷引物的碱基顺序不应与非扩增区域有同源性(<70%)或少于连续8个的互补碱基。要求在引物设计时采用计算机进行辅助检索分析。当前第50页\共有155页\编于星期五\22点⑸引物的5′

末端碱基：并没有严格的限制，只要与模板DNA结合的引物长度足够，其5′末端碱基可以不与模板DNA匹配呈游离状态。最多可游离10个碱基并不影响PCR反应进行。⑹引物的3′

末端碱基：原则上要求引物的3′末端与模板DNA一定要配对，另外3′末端的末位碱基在很大程度上影响着Taq酶的延伸效率。引物3′末端碱基在错误配对时不同碱基的引发效率存在很大差异，最好选T、G、C，而不选A。当前第51页\共有155页\编于星期五\22点PCR扩增产物的分析

1、凝胶电泳分析法：聚丙烯酰胺凝胶电泳灵敏度远高于琼脂糖电泳，用于探讨PCR扩增的灵敏度效果好，但配制复杂，

常用琼脂糖凝胶电泳。

2、点杂交

3、微孔板杂交法当前第52页\共有155页\编于星期五\22点当前第53页\共有155页\编于星期五\22点PCR技术的主要用途

1、目的基因的克隆：

PCR技术为在重组DNA过程中获得目的基因片段提供了简便快速的方法。

2、基因的体外突变：可以随意设计引物在体外对目的基因片段进行嵌和、缺失、点突变等改造。

当前第54页\共有155页\编于星期五\22点3、DNA和RNA的微量分析：

PCR技术高度敏感，对模板ＤＮＡ的含量要求很低，是DNA和ＲNA微量分析的最好方法。实际工作中，一滴血液、一根毛发或一个细胞已足以满足PCR的检测需要，因此在基因诊断方面具有极广阔的应用前景。4、DNA序列测定：

PCR技术的引入使DNA测序工作大大简化，也提高了测序的速度。5、基因突变分析：利用PCR与一些技术的结合可以大大提高基因突变检测的敏感性。当前第55页\共有155页\编于星期五\22点三、PCR技术的应用（一）反转录PCR（RT-PCR）RT-PCR是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。当前第56页\共有155页\编于星期五\22点（二）锚定PCR（anchoredPCR）用于在体外扩增未知序列的DNA片段的方法，而一般的PCR必须预先知道欲扩增DNA片段两侧的序列，但人们经常需要分析一端序列未知的基因片段，可利用锚定PCR。该法的基本原理是在基因未知序列端添加同聚物尾，人为赋予未知基因末端序列信息，再用人工合成的多聚尾互补的引物作为锚定引物，在与基因另一侧配对的特异引物参与下，扩增带有同聚物尾的序列。当前第57页\共有155页\编于星期五\22点（3）反向PCR（iversePCR）

常规PCR可扩增位于二个引物之间的DNA片段，但不能扩增引物外侧的DNA序列，反向PCR则可扩增引物外侧的DNA片段，对已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增和研究。当前第58页\共有155页\编于星期五\22点（四）巢式PCR（nestedPCR）

是指利用两套PCR引物（巢式引物）对进行两轮PCR扩增反应。在第一轮扩增中，外引物用以产生扩增产物，此产物在在内引物的存在下进行第二轮扩增。由于巢式PCR反应有两次PCR扩增，从而降低了扩增多个靶位点的可能性（因为与两套引物都互补的引物很少）增加了检测的敏感性；又有两对PCR引物与检测模板的配对，增加了检测的可靠性。当前第59页\共有155页\编于星期五\22点当前第60页\共有155页\编于星期五\22点（五）原位PCR(InsituPCR)原位PCR是指在组织或细胞标本片上直接进行PCR，对细胞中的靶DNA进行扩增，通过掺入标记基团直接显色或结合原位杂交进行检测的方法。可分为直接法和间接法。基本步骤：组织切片或细胞固定→蛋白酶消化→原位PCR扩增→冲洗→产物检测

优点：灵敏度高，可进行细胞内定位。当前第61页\共有155页\编于星期五\22点（六）多重PCR（multiplexPCR）多重PCR是在同一反应中采用多对引物同时扩增几个不同的DNA片段，如果基因某一区段缺失，则相应的电泳图谱上此区段PCR扩增产物长度减少或消失，从而发现基因异常。多重PCR具有灵敏快速特点，特别适用检测单拷贝基因缺失、重排、插入等异常改变，其结果与Southernblotting一样可靠，但多重PCR会检测小片段缺失当前第62页\共有155页\编于星期五\22点（七）不对称PCR（asymmetricPCR）

目的：扩增产生特异长度的单链DNA

在扩增循环中引入不同引物浓度，一般用二种不同浓度的引物，50－100：1比例的引物浓度，在最初10－15个循环中主要产物还是双链DNA，但当低浓度引物被消耗尽后，高浓度引物介导的PCR反应就会产生大量单链DNA。单链DNA可用作杂交探针或DNA测序。当前第63页\共有155页\编于星期五\22点（八）免疫PCR(ImmunoPCR,Im-PCR)免疫PCR结合了抗原抗体反应的特异性和PCR的高敏感性，是一种极为敏感的抗原检测技术，适合于各种微量抗原的检测。免疫PCR的关键在于形成抗体—标记DNA耦联物，作为桥梁连接免疫反应的特异性和PCR的高扩增能力。免疫PCR主要由两个部分组成，第1部分是类似于普通ELISA的抗原抗体反应，第2部分即常规的PCR扩增和电泳检测。

当前第64页\共有155页\编于星期五\22点5.2.4实时定量PCR（realtimequantitativePCR，Q-PCR）由于PCR敏感性高，扩增产物总量变异系数大，定量不准确。90年代末期出现了Q-PCR，利用荧光检测PCR仪绘制DNA扩增过程中的累积速率动态变化图，基本消除在测定终端产物丰度时变异系数较大的问题。当前第65页\共有155页\编于星期五\22点混合在PCR反应液中的荧光探针只有与大片段DNA结合后，才能够被激发出荧光。随着新合成DNA片段的增加，由于结合到DNA上的荧光探针增加，被激发产生的荧光相应增加。非序列特异性荧光染料SYBRGreenI,激发光波长520nm。当前第66页\共有155页\编于星期五\22点SYBRGreenI作探针的实时定量PCR实验过程图示当前第67页\共有155页\编于星期五\22点HanP.,LiQ.,andZhuY.X.(2008)ThePlantCell20:1482-1493.

荧光强度当前第68页\共有155页\编于星期五\22点为确保荧光检测的确实是靶DNA，又设计了仅能与目的DNA特异结合的荧光探针。TaqMan探针是一段与靶DNA序列中间部位结合的单链DNA，长50bp-150bp，该DNA的5’和3’端带有短波长和长波长两个不同荧光基团，由于彼此距离靠近，在荧光共振能量转移（FRET）作用下发生荧光淬灭，因而检测不到荧光。当前第69页\共有155页\编于星期五\22点随着PCR反应的进行，TaqMan探针结合到目的DNA序列上，并且会被具有外切酶活性的TaqDNA聚合酶逐个切除而降解。切下来的荧光基团解除了荧光淬灭的束缚，会在激发光下发出荧光，因此，产生的荧光强度直接反映了所扩增靶DNA的总量。当前第70页\共有155页\编于星期五\22点TaqMan探针实时定量PCR技术当前第71页\共有155页\编于星期五\22点Ct值是产物荧光强度首次超过设定阈值时，PCR反应所需的循环数。利用标准曲线，可以确定样品中待检测靶DNA的绝对含量。图5-11用实时定量PCR法分析未知样品靶基因的绝对表达量。当前第72页\共有155页\编于星期五\22点5.2.5基因组DNA文库构建把某种生物的基因组DNA切成适当大小，分别与载体组合，导入微生物细胞，形成克隆。汇集包含基因组中所有DNA序列的克隆（理论上每个序列至少有一个代表），这样的克隆片段的总汇，称为基因组DNA文库。当前第73页\共有155页\编于星期五\22点图5-13用Sau3A限制性核酸内切酶消化真核生物基因组DNA并利用噬菌体载体构建基因组文库的过程图示。当前第74页\共有155页\编于星期五\22点当前第75页\共有155页\编于星期五\22点DNA文库的完备性Clark和Carbon于1975年提出公式：N=ln(1-p)/ln(1-f)式中：N表示一个基因组文库所应该包含的重组克隆数目；p表示所期望的靶基因在文库中出现的概率；f表示重组克隆平均插入片段的长度与基因组DNA总长的比值。为获得整个基因簇或一个基因及其两翼延伸序列，基因组文库中的DNA片段常大于20kb。以人为例，其基因组大小为3×109bp若p=99%，平均插入片段大小为20kb，则N=6.7×105。当前第76页\共有155页\编于星期五\22点构建基因组文库最常用的是λ噬菌体载体（克隆能力约15—20kb）和限制性内切酶部分消化法。例如用识别4个核苷酸的核酸限制性内切酶Sau3A，与BamHI是一对同尾酶消化DNA，由Sau3A酶切产生的DNA片段可插入到经BamHI消化的λ噬菌体载体上。当前第77页\共有155页\编于星期五\22点λ噬菌体作为克隆载体当前第78页\共有155页\编于星期五\22点此外，还有很多大容量克隆载体，如柯斯质粒、细菌人工染色体（BAC）、P1源人工染色体（PAC）、酵母人工染色体（YAC）等都可用于基因组文库的构建。它们的优点是可以插入更大片段DNA，但是稳定性一般较差，在大量复制的过程中容易出现缺失现象。操作也相对较困难。当前第79页\共有155页\编于星期五\22点5.3RNA基本操作技术真核生物基因组DNA庞大，有大量重复序列，很难直接分离得到靶基因片段。而cDNA来自反转录的mRNA，无冗余序列，通过筛选cDNA文库，可较快地分离到相关基因。当前第80页\共有155页\编于星期五\22点细胞中的总RNA包括mRNA，rRNA，tRNA以及一些小RNA（sRNA）。一个典型的动物细胞约含10-5μgRNA，其中：80%-85%为rRNA15%-20%为tRNA及sRNAmRNA约占总RNA的1%-5%当前第81页\共有155页\编于星期五\22点rRNA分子具有确定的大小和核苷酸序列，特别是28S和18S特征性条带是电泳鉴定总RNA纯度和完整性的重要参数。当前第82页\共有155页\编于星期五\22点LiQetal.(2006)J.Integr.PlantBiol.48:114-120.当前第83页\共有155页\编于星期五\22点RNA提取的基本原理与方法（一）总RNA提取的基本原理与方法1、原理通过变性剂破碎细胞或者组织，然后经过氯仿等有机溶剂抽提RNA，再经过沉淀，洗涤，晾干，最后溶解。但是由于RNA酶无处不在，随时可能将RNA降解，所以实验中有很多地方需要注意，稍有疏忽就会前功尽弃。提取步骤：破碎组织→分离RNA→沉淀RNA→洗涤RNA→融解RNA→保存RNA。当前第84页\共有155页\编于星期五\22点所有RNA的提取过程中都有五个关键点，即：样品细胞或组织的有效破碎；有效地使核蛋白复合体变性；对内源RNA酶的有效抑制；有效地将RNA从DNA和蛋白混合物中分离；对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。但其中最关键的是抑制RNA酶活性。RNA的提取目前阶段主要可采用两种途径:1、提取总核酸，再用氯化锂将RNA沉淀出来；2、直接在酸性条件下抽提，酸性下DNA与蛋白质进入有机相而RNA留在水相。当前第85页\共有155页\编于星期五\22点2、总RNA提取的方法（1）（异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法）TRIZOL试剂中的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，其中异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中。当加入氯仿时，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA进入水相，离心后可形成水相层和有机层，这样RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离开。水相层（无色）主要为RNA，有机层（黄色）主要为DNA和蛋白质。当前第86页\共有155页\编于星期五\22点（二）mRNA的提取mRNA的分离方法较多，其中以寡聚（dT）-纤维素柱层析法最为有效，已成为常规方法。此法利用mRNA3’末端含有Poly（A+）的特点，在RNA流经寡聚（dT）纤维素柱时，在高盐缓冲液的作用下，mRNA被特异地结合在柱上，当逐渐降低盐的浓度时或在低盐溶液和蒸馏水的情况下，mRNA被洗脱，经过两次寡聚（dT）纤维柱后，即可得到较高纯度的mRNA。当前第87页\共有155页\编于星期五\22点图5-14PolyATtractmRNA的分离纯化过程简图。当前第88页\共有155页\编于星期五\22点三、DNA或RNA浓度、纯度和相对分子质量的测定（一）分光广度法DNA或RNA链上碱基的苯环结构在紫光区具有较强吸收，其吸收峰在260nm处。波长为260nm时，DNA或RNA的光密度OD260不仅与总含量有关，也随构型而有差异。对标准样品来说，浓度为1μg/ml时，DNA钠盐的OD260＝0.02当OD260＝1时，dsDNA浓度约为50μg/mlssDNA浓度约为37μg/mlRNA浓度约为40μg/ml

核苷酸浓度约为30μg/ml（由于底物不同有差异）当前第89页\共有155页\编于星期五\22点DNA样品的浓度（μg/μl）:OD260×稀释倍数×50/1000RNA样品的浓度（μg/μl）:OD260×稀释倍数×40/1000当DNA样品中含有蛋白质、酚或其他小分子污染物时，会影响DNA吸光度的准确测定。一般情况下同时检测同一样品的OD260、OD280和OD230，计算其比值来衡量样品的纯度。经验值：纯DNA：OD260/OD280≈1.8(＞1.9,表明有RNA污染；＜1.6，表明有蛋白质、酚等污染）纯RNA：1.7＜OD260/OD280＜2.0（＜1.7时表明有蛋白质或酚污染；＞2.0时表明可能有异硫氰酸残存）若样品不纯，则比值发生变化，此时无法用分光光度法对核酸进行定量，可使用方案二的方法或其他方法进行估算。当前第90页\共有155页\编于星期五\22点由于RNA分子敏感脆弱，在自然状态下难以被扩增，为了研究mRNA所包含的功能基因信息，一般将其反转录成稳定的DNA双螺旋（cDNA，complementaryDNA），再插入到可以自我复制的载体中。当前第91页\共有155页\编于星期五\22点图5-15cDNA合成过程示意图。当前第92页\共有155页\编于星期五\22点图5-16定向cDNA合成及分子修饰当前第93页\共有155页\编于星期五\22点因为绝大多数大肠杆菌细胞都会切除带有5'-甲基胞嘧啶的外源DNA，所以实验中常选用mcrA-mcrB-菌株以防止cDNA被降解。当前第94页\共有155页\编于星期五\22点cDNA文库的构建cDNA的长度一般在0.5-8kb之间，质粒载体和噬菌体类载体都能满足要求。cDNA文库常用Uni-zapXR（一种λ噬菌粒载体）做载体，它具备噬菌体的高效性和质粒载体系统利用蓝白斑筛选的便利，可容纳0-10kbDNA插入片段，含有pBluescript载体的全部序列。重组后可通过体内剪切反应（InVivoExcision）将cDNA插入片段转移到质粒系统中进行筛选、克隆和序列分析。当前第95页\共有155页\编于星期五\22点基因文库的筛选基因文库的筛选是指通过某种特殊方法从基因文库中鉴定出含有所需重组DNA分子的特定克隆的过程。筛选的方法有很多种，如核酸杂交法，PCR筛选法和免疫筛选法等。当前第96页\共有155页\编于星期五\22点1、核酸杂交法：核酸杂交法以其广泛的适用性和快速性成为基因文库筛选中最常用的一种方法，用放射性标记的特异DNA探针适用于高密度的菌落杂交筛选。将待筛选菌落转移到硝酸纤维素膜上，适当温育。同时保留原来的菌落平板作对照。当前第97页\共有155页\编于星期五\22点取出已经长有菌落的膜，用碱液处理，使菌落发生裂解，DNA随之变性。用蛋白酶K处理硝酸纤维素膜去除蛋白质，形成菌落DNA的印迹。80℃烘烤滤膜，将DNA固定在膜上。将滤膜与放射性标记的DNA或RNA探针杂交，通过放射性自显影显示杂交结果。通过对应于平板上的位置找到相应克隆。当前第98页\共有155页\编于星期五\22点图5-17通过核酸杂交筛选目的克隆流程图当前第99页\共有155页\编于星期五\22点2、PCR筛选法将整个文库（以质粒的形式或者细菌的形式均可）保存在多孔培养板上，用设计好的目的基因探针对每个孔进行PCR筛选，鉴定出阳性的孔，把每个阳性孔中的克隆再稀释到次级多孔板中进行PCR筛选。重复以上程序，直到鉴定出与目的基因对应的单个克隆为止。当前第100页\共有155页\编于星期五\22点3、免疫筛选法该法仅适用于对表达文库的筛选。若实验中靶基因的序列完全未知但是有针对该基因产物的特异性抗体，就可以采用免疫筛选法。当前第101页\共有155页\编于星期五\22点图5-18噬菌体表达文库的免疫化学筛选法示意图

当前第102页\共有155页\编于星期五\22点5.4SNP的理论与应用SNP是SingleNucleotidePolymorphism的缩写，即单核苷酸多态性，指基因组DNA序列中由于单个核苷酸（A，T，C和G）的突变而引起的多态性。当前第103页\共有155页\编于星期五\22点5.4.1SNP（单核苷酸多态性）概述科学上把染色体DNA同一位置上的每个碱基类型叫做一个等位位点。SNP是基因组中最简单最常见的多态性形式，具有很高的遗传稳定性。SNP检测和分析技术已经成为继限制性片段长度多态性（RFLP）和微卫星标记（SSR）之后的第三代遗传标记。当前第104页\共有155页\编于星期五\22点图5-19染色体上共同遗传的SNP组合。图中SNP1和SNP2在同一条染色体上而且距离很近，SNP1有等位位点A和G，SNP2有等位位点G和T。因此，染色体对有两种可能的SNP组合。当前第105页\共有155页\编于星期五\22点单倍型基因型外显子IV内含子IV57130165232236H1H-4TTATTH-3TTATTH-1TTATTE-2TTATTB-73TTATTH2MO17CTACCB-1CTACCH3H60CCTTT玉米globulin1不同单倍型和基因型之间的多态性比较

当前第106页\共有155页\编于星期五\22点据估计，人类DNA中每300-1000个碱基对就有一个SNP，因此，一个人类个体大约携带300万-1000万个SNPs。位于染色体上某一区域的一组相关联的SNP等位位点被称作单倍型（haplotype），相邻SNPs的等位位点倾向于以一个整体遗传给后代。因此,SNP成为第三代遗传标志,人体许多表型差异、对药物或疾病的易感性等等都可能与SNP有关。

当前第107页\共有155页\编于星期五\22点现在普遍认为SNP研究是人类基因组计划走向应用的重要步骤。这主要是因为SNP将提供一个强有力的工具，用于高危群体的发现、疾病相关基因的鉴定、药物的设计和测试以及生物学的基础研究等。SNP在基因组中分布相当广泛。大量存在的SNP位点，使人们有机会发现与各种疾病，包括肿瘤相关的基因组突变；从实验操作来看，通过SNP发现疾病相关基因突变要比通过家系来得容易；有些SNP并不直接导致疾病基因的表达，但由于它与某些疾病基因相邻，而成为重要的标记。SNP在基础研究中也发挥了巨大的作用，近年来对Y染色体SNP的分析，使得在人类进化、人类种群的演化和迁徙领域取得了一系列重要成果。当前第108页\共有155页\编于星期五\22点根据SNP在基因组中的分布位置分为编码区SNP（cSNP），调控区SNP（pSNP）和非编码区SNP（rSNP）三类。编码区内的变异率仅占周围序列的1/5，cSNP的总量显著少于其它两类SNPs。cSNP分为同义cSNP（synonymouscSNP），编码序列的改变不影响所翻译的氨基酸序列）和非同义cSNP（non-synonymouscSNP），碱基序列的改变使氨基酸序列发生改变，可能影响蛋白质的功能。当前第109页\共有155页\编于星期五\22点5.4.2SNP的检测技术通过DNA测序法获得新的SNP。基因分型（genotyping）是指利用数据库中已有的SNP进行特定人群的序列和发生频率的研究，主要包括基因芯片技术、Taqman技术、分子信标（molecularbeacons）技术和焦磷酸测序法（pyrosequencing）等。当前第110页\共有155页\编于星期五\22点1．基因芯片技术通过优化芯片杂交程序，使探针只与完全互补的序列杂交而不与含有单个错配碱基的序列杂交。优点是高通量，一次可对多个SNP进行规模性筛选，被检起始材料也很少，操作步骤简单。缺点是芯片设计成本高。而且，由于DNA样品的复杂性，有些SNP不能被检测。当前第111页\共有155页\编于星期五\22点2．Taqman技术PCR反应系统中加入2种不同荧光标记的分别与两个等位基因配对的探针。随着PCR的进行，与模板完全配对的探针逐步被TaqDNA聚合酶的5’→3’外切活性所切割，荧光基团与3’端的淬灭基团分离，荧光基团被激活。不完全配对的探针（代表另一种等位基因）不能被有效切割，供体荧光基团依然被淬灭。当前第112页\共有155页\编于星期五\22点3．分子信标（molecularbeacon）技术是一种呈茎环结构的荧光标记的寡核苷酸，环状区与靶序列特异性结合，茎干区由5-8个碱基对组成，5’端带有荧光发生基团，3’端带有荧光淬灭基团。自由状态时，分子信标呈发卡式结构，荧光几乎完全淬灭。与靶分子相结合时，荧光基团和淬灭基团之间的距离增大，分子信标的荧光恢复。当前第113页\共有155页\编于星期五\22点Taqman技术（上）及分子信标技术（下）原理示意图。当前第114页\共有155页\编于星期五\22点5.5基因克隆（clone）技术在多细胞的高等生物个体水平上，克隆表示由具有相同基因型的同一物种的两个或数个个体组成的群体。从同一受精卵分裂而来的单卵双生子（monozygotictwins）便是属于同一克隆。当前第115页\共有155页\编于星期五\22点在细胞水平上，克隆一词是指由同一个祖细胞（progenitorcell）分裂而来的一群带有完全相同遗传物质的子细胞。在分子生物学上，人们把将外源DNA插入具有复制能力的载体DNA中，使之得以永久保存和复制这种过程称为克隆。当前第116页\共有155页\编于星期五\22点RACE技术（rapidamplificationofcDNAends）在已知cDNA序列基础上克隆5’或3’端缺失序列的技术。根据已知序列设计基因片段内部特异引物，由该片段向外侧进行PCR扩增得到目的序列。用于扩增5’端的方法称为5’RACE，用于扩增3’端的称为3’RACE。当前第117页\共有155页\编于星期五\22点5’RACE在反转录酶的作用下，以基因片段内部特异性引物（GSP1）启始cDNA第一条链合成。RNase降解模板链mRNA，纯化第一链。用末端转移酶在cDNA链3’端加入连续的dCTP。以连有oligo(dG)

的锚定引物和基因片段内部特异的nested引物进行PCR扩增，得到目的片段，用nestPCR检测。当前第118页\共有155页\编于星期五\22点当前第119页\共有155页\编于星期五\22点3’RACE1、用oligo(dT)锚定引物启始cDNA第一链的合成.2、降解模板mRNA.3、用通用锚定引物和基因片段内部特异引物进行PCR扩增得到目的3’片段，用nestPCR法检测.当前第120页\共有155页\编于星期五\22点5.5.2cDNA差示分析法

(RDA,RepresentationDifferenceAnalysis)通过降低cDNA群体复杂性和更换cDNA两端接头等方法，特异性扩增目的基因片段。因为Tester和Driver在接受差示分析前均经一个4碱基切割酶处理，形成平均长度256bp的代表群，保证绝大部分遗传信息能被扩增。每次T减D反应后仅设置72℃复性与延伸，94℃变性这两个参数共20个PCR循环，PCR产物的特异性和所得探针的纯度高。当前第121页\共有155页\编于星期五\22点当前第122页\共有155页\编于星期五\22点当前第123页\共有155页\编于星期五\22点5.5.3Gateway大规模克隆技术Gateway技术利用λ噬菌体进行位点特异性DNA片段重组，实现了不需要传统的酶切联接过程的基因快速克隆和载体间平行转移。当前第124页\共有155页\编于星期五\22点Gateway大规模克隆策略当前第125页\共有155页\编于星期五\22点TOPO反应:将目的基因PCR产物连入Entry载体。载体上的CCCTT被拓扑异构酶所识别，通过与切口处的磷酸基团形成共价键，将该酶偶联在载体上。5’GTGG粘性末端攻击PCR产物的互补性末端并与接头序列CACC退火，使PCR产物以正确方向连入Entry载体。当前第126页\共有155页\编于星期五\22点LR反应：将目的片段从Entry载体中重组入表达载体。Entry载体上基因两端具有attL1和attL2位点，目的载体上含有attR1和attR2位点，在重组蛋白的作用下发生定向重组，形成新的位点attB1和attB2，将目的基因转移到表达载体中。当前第127页\共有155页\编于星期五\22点GetEntryVectorGetExpressionVectorGetcDNATOPOLR当前第128页\共有155页\编于星期五\22点当前第129页\共有155页\编于星期五\22点当前第130页\共有155页\编于星期五\22点120AP2/EREBPgeneswereclonedFengJXetal(2005)AsystematicannotationupdateviacDNAsequenceanalysisandcomprehensiveprofilingofdevelopmental,hormonalorenvironmentalresponsivenessoftheArabidopsisAP2/EREBPtranscriptionfactorgenefamily.PMB59:853-868.当前第131页\共有155页\编于星期五\22点5.5.4基因的图位克隆法（Map-basedcloning）所有具有某种表现型的基因都可以通过该方法克隆得到。通过构建遗传连锁图，将目的基因定位到某个染色体的特定位点，并在其两侧确定紧密连锁的RFLP或RAPD分子标记。当前第132页\共有155页\编于星期五\22点通过对不同的生态型及限制性内切酶和杂交探针的分析，找出与目的基因距离最近的分子标记，通过染色体步移法将位于这两个标记之间的基因片段克隆并分离出来，根据基因功能互作原理鉴定目的基因。当前第133页\共有155页\编于星期五\22点图5-26染色体步移法克隆基因示意图当前第134页\共有155页\编于星期五\22点在RFLP作图中，连锁距离是根据重组率来计算的，1cM（厘摩）相当于1%的重组率。人类基因组中，1cM≈1000kb；拟南芥菜中，1cM≈290kb；小麦中，1cM≈3500kb。当前第135页\共有155页\编于星期五\22点用图位克隆法获得水稻脆杆基因BCl

当前第136页\共有155页\编于星期五\22点将BCl定位于水稻3号染色体（Chr3）分子标记C524a和RM16之间；B.覆盖BCl位点的BAC大片段。C.BCl位点的精细定位。BCl位点被定位于分子标记P2和P4之间与P3共分离。D.BCl基因结构。红色为编码区，白色为5’和3’非翻译区，黑色线段为内含子。bcl-1和bcl-2表示两个突变位点。

当前第137页\共有155页\编于星期五\22点Li