第二核酸的结构与功能

第二核酸的结构与功能第一页，共七十四页，编辑于2023年，星期一1956年A.Kornberg发现E.coliDNA聚合酶，1958年分离该酶并在体外环境下酶促合成有活性的DNA,1959年诺奖。1958年Meselson用著名的“密度转移”试验证实DNA的“半保留复制”；建立密度梯度离心。1968年冈崎片段发现后提出DNA半保留不连续复制。1959年S.Wess发现转录酶。1960年JacobMonod经10余年研究后提出乳糖操纵子模型，同时预言mRNA的存在。1961年S.Spiegelman在T2感染的E.coli中发现mRNA，建立分子杂交技术。1965年R.W.Holley测定酵母丙氨酸tRNA的一级结构，提出tRNA的“三叶草”结构模型。1966年M.W.Nirenberg和H.G.Khorana完成全部遗传密码的破译。1967年Kates和McAuslan发现真核转录酶，1970年发现真核mRNA含有polyA尾巴(在天花病毒感染细胞中发现），用oligo(dT)柱分离纯化真核mRNA。

第二页，共七十四页，编辑于2023年，星期一1968年M.Gellert等5个实验室发现DNA连接酶，为发展体外DNA重组技术鉴定了基础。1970年H.M.Temin和D.Baltimore同时发现不同反转录病毒的逆转录酶，补充“中心法则”。1970年H.O.Smith发现第一个II型DNA限制性内切核酸酶HindII，导致一系列DNA限制性内切核酸酶发现及应用，和DNA连接酶一起促进了DNA体外重组的发展。1972年P.Berg等三人建立DNA重组技术，建立了第一个体外DNA重组分子(dvgalDNA片段克隆到SV40)。并建立了含有哺乳动物激素基因的工程菌株，促进了DNA克隆技术的发展和应用。1975年Furuichit和Miura研究质型多角体病毒，发现真核mRNA中的m7Gppp帽子结构。1977年P.Sharp和P.Leder分别从腺病毒II型和鸡卵白蛋白基因中发现真核基因内部含有内含子。1977年和分别发明了不同的测序技术，前者发明了化学断裂法，后者发明了加减法和聚合酶链式反应终止技术（即双脱氧终止技术），他因此第二次获诺贝尔奖。第三页，共七十四页，编辑于2023年，星期一长期以来，人们一直相信所有的酶都是蛋白质，1981-1982年，Cech和Altman各自独立地发现RNA具有生物催化功能，取名为ribozyme（核酶）,这打破了蛋白质对生物催化剂的一统天下，极大促进了有关生命起源、生物进化等生物学中带根本性问题的进一步研究。1985Mullis等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应（Polymeradechainreaction,PCR）,这是一种体外扩增DNA的酶促反应技术，又称PCR扩增。PCR技术的问世，极大地方便了DNA的克隆、鉴定及应用，因此在很短时间内迅速进入生命科学、医学、遗传工程、法医学、考古学等各个领域，并显示巨大的优越性。目前生命科学研究进入后基因时代，更是离不开对核酸的深入广泛研究。第四页，共七十四页，编辑于2023年，星期一核酸可分成两大类，含有核糖的称核糖核酸（RNA）,含有脱氧核糖的称脱氧核糖核酸（DNA）。DNA主要分布在细胞核，储存并携带遗传信息。决定细胞和个体的基因型；RNA主要分布在细胞质中，负责遗传信息的表达，参与体内蛋白质的生物合成；所有生物细胞都含有这两类核酸。对于病毒来说，要么只含有DNA，要么只含有RNA，还未发现既含有DNA又含有RNA的病毒。第五页，共七十四页，编辑于2023年，星期一第一节核酸的化学组成核酸是分子量很大的核苷酸高聚物，是由C、H、O、N和P五种元素组成。正象蛋白质是由氨基酸聚合而成一样，核酸的基本结构单位是单核苷酸。核苷酸水解后产生核苷、磷酸，核苷继续水解，得到碱基和戊糖。其结构单元为核苷酸第六页，共七十四页，编辑于2023年，星期一一、碱基、戊糖与核苷（一）碱基核酸中的碱基有两类：嘌呤碱和嘧啶碱。常见的嘌呤碱有腺嘌呤(A)和鸟嘌呤（G），它们是嘌呤的衍生物。嘧啶碱基有胞嘧啶(C)、尿嘧啶(U)及胸腺嘧啶(T)，都是嘧啶的衍生物。两类核酸所含的主要碱基都是4种，所含的两种嘌呤碱完全相同，即腺嘌呤和鸟嘌呤。但所含的嘧啶碱有所不同，RNA主要含有胞嘧啶和尿嘧啶，大多数DNA也含胞嘧啶，但不含尿嘧啶。见表。第七页，共七十四页，编辑于2023年，星期一除上述五种碱基外，在一些核酸中还存在少量其他修饰碱基，也称为稀有碱基。其中大多数是碱基的甲基化产物或衍生物。tRNA中的修饰碱基种类较多，如次黄嘌呤、二氢尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶（胸腺嘧啶）、4-硫尿嘧啶等。表4-1两类核酸分子组成的比较碱基核糖磷酸嘌呤嘧啶DNAA,GC,T脱氧核糖磷酸RNAA,GC,U核糖磷酸第八页，共七十四页，编辑于2023年，星期一第九页，共七十四页，编辑于2023年，星期一第十页，共七十四页，编辑于2023年，星期一（二）戊糖RNA和DNA是因所含的戊糖不同而分类的。RNA中的戊糖是D-核糖，DNA中的戊糖是D-2-脱氧核糖，某些RNA中含少量的甲基化核糖。核酸分子中的戊糖都是β-D-型。第十一页，共七十四页，编辑于2023年，星期一（三）核苷

核苷是碱基与戊糖生成的糖苷，即戊糖的第1位碳原子(C1)分别与嘌呤碱的第9位氮原子N9或嘧啶碱的第1位氮原子N1相连。所以糖与碱基之间的连接键是N-C糖苷键。在tRNA中存在少量5-核糖尿嘧啶，其C1是与尿嘧啶的第5位碳原子以C－C键连接而成的，因为连接方式特殊，也称为假尿苷。因为所含戊糖不同，核苷分为核糖核苷，用单字符号A、G、C、U表示；脱氧核苷，在单字符号前加一小写的d，如dA、dG、dC、dT。常见的修饰核苷有：二氢尿苷D，假尿苷ψ，次黄苷或肌苷I，黄嘌呤核苷X。第十二页，共七十四页，编辑于2023年，星期一第十三页，共七十四页，编辑于2023年，星期一二、核苷酸（一）核苷酸的结构核苷酸是核苷的戊糖上羟基与磷酸形成的酯。核苷酸的核糖有3个自由的羟基（2′，3′,5′），所以可分别生成2′-，3′-，和5′-核苷酸。脱氧核糖上只有2个自由羟基，相应的脱氧核苷只能生成3′-和5′-脱氧核苷酸。体内的游离核苷酸多为5′-核苷酸，常在其单字符号后添上MP表示单核苷酸，如AMP,GMP，dTMP等。第十四页，共七十四页，编辑于2023年，星期一单核苷酸可以在5′位上进一步磷酸化产生5′-二磷酸核苷和5′-三磷酸核苷。如生物体内的腺苷酸AMP可与一分子磷酸结合成腺苷二磷酸（ADP），ADP再与一分子磷酸结合成腺苷三磷酸（ATP）（图）。其他单核苷酸可以和腺苷酸一样磷酸化，产生相应的二磷酸或三磷酸化合物。（二）核苷酸的功能在体内，核苷三磷酸作为核酸生物合成的原料，此还外在生物体内的能量代谢中起着重要的作用。其中ATP在所有代谢途径化学能的贮藏和利用中起着关键的作用，称生物的能量“通用货币”。另外ATP还可作为淀粉生物合成中葡萄糖的载体。其他核苷三磷酸还参与特定的代谢过程，如UTP作为葡萄糖载体参与糖原的合成，CTP参加磷脂的合成，GTP参加蛋白质和嘌呤的合成等。第十五页，共七十四页，编辑于2023年，星期一图4-1核苷酸及其磷酸化合物图4-2cAMP的结构式第十六页，共七十四页，编辑于2023年，星期一腺苷酸还与维生素PP（尼克酰胺）形成辅酶Ⅰ（尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸）和辅酶Ⅱ（尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸），它们在生物氧化中起传递氢的作用。腺苷酸还与黄素形成黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD），分子的一半是腺嘌呤二核苷酸，另一半是磷酸核黄素，又称黄素单核苷酸（FMN）。FAD和FMN也是在生物氧化系统中起传递氢的作用。辅酶A分子中也包含腺苷酸结构，还有泛酸，即水溶性B族维生素，以及氨基乙硫醇（H2N-CH2-CH2-SH），后者部分的硫基（－SH）是辅酶A作为酰基载体参与多种反应的一个重要基团，因此，辅酶A常用HSCoA表示。ATP在腺苷酸环化酶的作用下可以生成3′,5′-环状腺苷酸(cAMP)，cAMP具有以下的结构式（图）。同样，GTP在鸟苷酸环化酶的催化下可以生成3′,5′-环鸟苷酸(cGMP)。第十七页，共七十四页，编辑于2023年，星期一cAMP和cGMP是一些激素等信号分子发挥生理作用的媒介物,被称为第二信使。cGMP是cAMP的拮抗物，二者共同在细胞的生长发育中起着重要的调节作用。目前cAMP及其衍生物已用于临床，对心绞痛、心肌梗塞等冠心病发作症状有明显效果。近些年还发现，一些核苷多磷酸和寡核苷多磷酸类参与基因转录调控过程。如ppGpp或pppGpp以及pppApp，pppAppp等。许多核苷酸类衍生物可作为抗病毒和抗肿瘤药物，前者如,5-碘尿苷、阿糖胞苷、阿糖腺苷及多聚肌苷酸和多聚胞苷酸，后者如,5-氟嘧啶、,6-巯基嘌呤等。第十八页，共七十四页，编辑于2023年，星期一三、核酸中核苷酸间的连接实验证明，DNA和RNA都是没有分支的多核苷酸长链，链中前一个核苷酸的3′－羟基和后一个核苷酸戊糖上的5′-磷酸形成酯键，借助这种3′5′－磷酸二酯键将核苷酸彼此相连，形成核酸链。每条线形核酸链都有一个5′-末端和一个3′-末端（图），即如果多核苷酸片段最后一个核苷酸的戊糖的C3′-羟基不再参与3′,5′-磷酸二酯键的构成，这一端就是3′端，反之，如果其C5′-羟基不再参与磷酸二酯键的构成，就是5′端，这样RNA和DNA链都有方向性。核酸分子戊糖和磷酸所构成的主链上的磷酸基是酸性的，在生理pH下带负电荷；而侧链嘌呤和嘧啶碱基团相对不溶于水而具有疏水性质。第十九页，共七十四页，编辑于2023年，星期一

多核苷酸链的化学式第二十页，共七十四页，编辑于2023年，星期一第二节DNA的分子结构

一、DNA的一级结构DNA的一级结构就是指DNA分子中通过3′5′－磷酸二酯键连接的核苷酸排列顺序。任何DNA分子的糖-磷酸的连接总是一样的,不同核酸之间的千差万别,只在于每个糖环上连接的碱基排列顺序不同,所以核酸的一级结构也称为核苷酸序列或碱基序列。生物之具有多样性就在于它们的DNA中核苷酸序列或碱基序列的变化多端，也即它们的基因组结构不同。无论是DNA，还是RNA，在它们的生物合成的聚合反应中，都是按照5′3′方向进行的，因此没有特别指定时，核苷酸序列都是按照5′3′方向读写。第二十一页，共七十四页，编辑于2023年，星期一a基因组与染色体所谓基因组是指一个独立生物体所包含的全部遗传信息。在细胞中遗传信息储存在称为染色体的基因结构体上，每条染色体含有一个DNA分子。一般细菌在单条环状染色体上携带它们的全部基因，每条染色体只有一份拷贝，也即其细胞或个体每个基因有一份拷贝，为单倍体。高等生物的染色体为线状的，不同生物有不同数目的染色体，通常每条染色体包含有两份拷贝，因而每个基因有两份拷贝，为双倍体。偶尔也发现有些生物细胞的每条染色体有两份以上的拷贝，如三份拷贝的，称三倍体，四份拷贝的，称四倍体等等。所有基因均为单拷贝的一套完整的基因组称单倍体基因组，因此，通常生物体均含有两个或两个以上拷贝的完整基因组。需要注意的是，单倍体细胞的一些基因可能有多份拷贝，如具单条染色体的大肠杆菌E.coli其延长因子EF-Tu基因有两份拷贝，核糖体RNA基因有7份拷贝，酵母Saccharomycescerevisiae的单倍体细胞中有多达40%的基因是双重拷贝的。第二十二页，共七十四页，编辑于2023年，星期一b原核生物基因组的特点原核生物基因组DNA分子较小，其基因分布的主要特点有:①每个基因在基因组中出现仅一次或几次，而且主要为编码蛋白质的结构基因，其次为调控序列。②功能关联的基因常集中在一起，形成一个功能单位在DNA分子的特定部位，相关结构基因常转录成一个mRNA。③有重叠基因存在，同一段DNA可编码多种蛋白质分子，这种现象见于病毒、线粒体和叶绿体及质粒DNA分子。第二十三页，共七十四页，编辑于2023年，星期一c真核生物基因组的特点真核生物的基因一般分布在若干条染色体上，基因组比原核生物复杂庞大，体细胞基因组是双倍体，配子细胞为单倍体。其基因组组成特点有:①重复序列真核生物DNA分子中特定碱基序列重复出现的频率相差很大，可分为:单拷贝序列在整个基因组中只出现一次或少数几次，为编码蛋白质的结构基因。大多数蛋白质(包括珠蛋白，卵清蛋白、丝心蛋白和酶蛋白等)的基因在单倍体中都是单拷贝序列。单拷贝序列在人基因组中约占DNA总量的65%，在高等生物中占总DNA的20%。第二十四页，共七十四页，编辑于2023年，星期一中度重复序列在DNA分子中可重复几十到数万次，长度300-7000bp(碱基对)，大多与单拷贝基因间隔排列。rRNA基因、tRNA基因和某些蛋白质基因属中度重复序列，还有许多中度重复非编码DNA由长散布元件(LINE)构成，哺乳动物基因组中有2到3万拷贝的LINE（L1）家族，一个完整的L1元件约7000bp，包含两个编码序列，然而绝大多L1元件要短。人的DNA约25%属中度重复序列。第二十五页，共七十四页，编辑于2023年，星期一高度重度序列可重复几十万到上百万次，它们一般位于着丝粒和端粒处，不转录，可能与染色体结构的形成及基因表达的调控有关。人的DNA中有10%是由高度重复序列构成的。许多高度重度序列为短散布元件（SINE）,最为人熟知的SINE是300bp的Alu元件，因被限制性内切酶Alu切成170bp而得名，在哺乳动物及人类单倍体基因组中重复30-50万次。卫星DNA，不像LINE与SINE散布在整个基因组中，而是高度重复DNA以长的串联重复簇出现，并总是紧紧卷曲在异染色质中，因此也是惰性的。其量在不同生物中是高度可变的。短的串联重复构成的DNA称小卫星或可变数的串联重复（VNTR)，其拷贝数远比卫星DNA少。人与人之间的短随机重复片段在总长度上有很大的不同，这使得我们可以区分每个人，并用于司法鉴定。除了重复序列外，真核生物细胞还有假基因，这是正常基因的缺陷型拷贝，它的缺陷阻止它被表达。在细胞中假基因只以一份或两份拷贝存在，占总DNA的极小部分。第二十六页，共七十四页，编辑于2023年，星期一②在结构基因中编码片段被不编码片段隔开，基因中不编码的居间片段称为“内含子”(intron)，而编码的片段则称作“外显子”(exons)。内含子将编码基因隔成不连续基因或断裂基因(splitgene)。如鸡卵清蛋白基因含有7个内含子,它们把卵清蛋白基因分割成8个外显子（图4-4），基因共有7700bp,而其mRNA只有1859个核苷酸。各类真核生物基因中的内含子数目、位置和占基因总长的比例都不同，但组蛋白基因没有内含子。③基因家族许多来源相同，结构相似，功能关联的基因或串联排列集中成基因簇，或分散在不同部位。前者如rRNA、组蛋白基因，后者如珠蛋白、生长激素等基因。第二十七页，共七十四页，编辑于2023年，星期一图4-4卵清蛋白基因白色代表内含子，用A、B、C……表示，黑色代表外显子，用1、2、3……表示。基因总长7700bp,被7个不编码区分割成8个编码片段，编码部分的总长度为1872bp，数字为该片段的长度，以bp表示。第二十八页，共七十四页，编辑于2023年，星期一因为"成熟"的mRNA只能与为其编码的基因中编码区结合形成DNA-RNA杂交分子，不能结合的内含子区便突出成环(图4-5)，可在电镜下清楚看到。图4-5鸡卵清蛋白基因的结构左侧的电子显微镜照片显示卵清蛋白基因克隆与卵清蛋白mRNA间形成的复杂“杂交分子”结构；右侧为该照片的示意图,从环形突起部分可看出7个内含子（A到G）的位置。第二十九页，共七十四页，编辑于2023年，星期一二、DNA的空间结构肺炎球菌的转化实验以及噬菌体感染实验使科学家们相信DNA是遗传物质，但遗传信息是如何贮存在DNA中，仍难以推测。1953年，Chargaff等应用色谱法对多种生物DNA的碱基组成进行了分析，发现DNA中的腺嘌呤数目与胸腺嘧啶的数目相等，胞嘧啶（包括5-甲基胞嘧啶）的数目和鸟嘌呤的数目相等。后来又有人证明腺嘌呤和胸腺嘧啶间可以生成两个氢键；而胞嘧啶和鸟嘌呤之间可以允许生成3个氢键。在前人工作的基础上，Waston和Crick于1953年的4月25日在《Nature》发表了题为“核酸的分子结构-脱氧核糖核酸的结构”的文章，阐述了双螺旋结构的要点。后人的许多工作证明，这个模型基本上是正确的。(2)DNA的二级结构①X射线衍射1951年，RosalindFranklin和MauriceWilkins利用X射线衍射图谱分析了DNA的晶体。X射线衍射数据说明DNA中含有两条或两条以上具有螺旋结构的多核苷酸链，而且沿纤维长轴有0.34nm和3.4nm两个重要的周期性变化。②关于碱基成对的证据③电位滴定行为第三十页，共七十四页，编辑于2023年，星期一图X射线衍射第三十一页，共七十四页，编辑于2023年，星期一b双螺旋结构模型的内容①DNA分子是由两条方向相反的平行多核苷酸链构成的，两条链的糖-磷酸主链都是右手螺旋，有一共同的螺旋轴，一条链的方向是5′-3′，另一条链则是3′-5′。螺旋表面有一条大沟和小沟。②两条链上的碱基均在主链内侧，而磷酸及戊糖位于外侧，彼此以磷酸二酯键相连接，形成DNA分子的骨架，两条链借碱基之间的氢键和碱基之间堆积力牢固地连为一体。一条链上的A与另一条链上的T配对，G一定与C配对。A与T配对形成两个氢键，G与C配对形成3个氢键（图）。氢键维持双螺旋的横向稳定性，碱基堆积力维持双螺旋的纵向稳定性。磷酸残基上的负电荷与介质中的正离子形成的离子键也稳定双螺旋结构。正是这三种作用使双螺旋结构相当稳定。由于碱基对的大小基本相同，所以无论碱基序列如何，双螺旋DNA分子整个长度的直径相同，螺旋直径为2nm。

③成对碱基大致处于同一平面，该平面与螺旋轴基本垂直。糖环平面与螺旋轴基本平行，磷酸基在糖环的外侧。相邻碱基对平面间的距离为0.34nm。第三十二页，共七十四页，编辑于2023年，星期一图4-7DNA螺旋表面的大沟和小沟第三十三页，共七十四页，编辑于2023年，星期一图4-8由Waston和Crick确定的碱基对中的氢键图形1A＝0.1nm第三十四页，共七十四页，编辑于2023年，星期一（二）DNA的超螺旋结构

在二级结构基础上DNA的双螺旋进一步折叠缠绕成更为复杂的结构。

1.原核生物DNA的超螺旋结构

原核生物DNA二级结构多为环状双螺旋，在细胞内双螺旋可进一步扭曲形成超螺旋。超螺旋DNA是如何形成的呢?在DNA中，从双螺旋的一端看过去，一个碱基对相对于下一个碱基对旋转了36°，每一螺旋(旋转360°)含有10个碱基对，具有这样结构的环形DNA分子称为处于松弛状态的分子。如果将之切断，使变成线性双螺旋分子，然后，设想用两手分别捏住线性DNA分子的两端，捻动其中的一端或两端同时向相反方面捻动，双螺旋形可以形成过旋或欠旋结构。当向右捻动时，等于紧旋，相对于它的松弛状态这时DNA分子处于一种超过原有螺旋状态的状态，称为过旋。因DNA分子的两端被固定，捻动施加的力释放不掉，所以过旋分子增加了额外的扭转张力。当将处于松弛状态的双螺旋向左捻动时，等于解旋，相对于它的松弛状态此时DNA处于一种没有达到原有旋转状态的状态，称为欠旋。同样，因DNA分子的两端被固定，欠旋也给双螺旋DNA分子增加了额外的应力。处于松弛型的环状DNA的链环数如图所示。第三十五页，共七十四页，编辑于2023年，星期一第三十六页，共七十四页，编辑于2023年，星期一

当将线性过旋或欠旋的双螺旋DNA形成一个环时，就会因要抵消过旋或欠旋所增加的额外应力自动形成额外的超螺旋。过旋DNA会自动形成额外左手螺旋，这样的超螺旋称为正超螺旋；而欠旋DNA形成额外右手螺旋，称为负超螺旋(见图)。生物体内大多数DNA分子都有负超螺旋结构，还未发现正超螺旋DNA。有的DNA分子的超螺旋数可达20或30。典型的细菌染色体每1000个碱基对就含有5个超螺旋，而真核生物的DNA含有的超螺旋更多。第三十七页，共七十四页，编辑于2023年，星期一

2．真核生物DNA的超螺旋结构及其在染色质中的组装真核细胞染色体DNA为线形双螺旋，与组蛋白共同组成核小体(nucleosome)，是染色体的基本组成单位。核小体中的组蛋白有五种，分别为H2A、H2B、H3、H4和H1。由H2A、H2B、H3和H4各两分子形成八聚体核心，DNA线形双螺旋(约146bp)盘绕在该核心上形成核小体核心颗粒，核小体核心颗粒之间再由连接DNA(约60bp)和组蛋白H1前后连接为串珠状结构(图2—8)。串珠状结构进一步盘旋折叠，形成染色质纤维，后者再经多次折叠、盘曲，最终形成染色单体这一独特的超螺旋形式。真核细胞的基因组DNA经这种包装后可高度压缩，使很长的DNA分子被有规律地装入细胞核内。第三十八页，共七十四页，编辑于2023年，星期一第三十九页，共七十四页，编辑于2023年，星期一第四十页，共七十四页，编辑于2023年，星期一三、DNA的功能DNA是遗传的物质基础，DNA分子中核苷酸序列中储存了生物的全部遗传信息；DNA可以通过自我复制将储存的遗传信息忠实地从一代细胞传给下一代细胞；DNA储存的遗传信息还可通过转录和翻译产生蛋白质。可见DNA的核苷酸序列决定细胞内所有的RNA核苷酸序列和蛋白质的氨基酸序列。遗传学上所指的基因(gene)就是DNA分子中的某一功能片段，它可以通过复制遗传给子代，还可以通过转录和翻译，保证支持生命活动的各种蛋白质在细胞内有序地合成；而基因组(genome)则是指一个生物体的全部基因序列。综上所述，DNA是生物遗传繁殖的物质基础，也是个体生命活动和生命现象的基础。第三节RNA的分子结构与功能RNA是由AMP、GMP、CMP和UMP四种核苷酸为基本单位，以3’，5，-磷酸二酯键连接而成的多聚核苷酸链。有些RNA分子中含有少量的稀有碱基和稀有核苷。RNA分子一般比DNA小得多，由数十个至数千个核苷酸组成，通常都是以单链形式存在。但RNA的多核苷酸链可以回折，通过A=U配对，C三G配对形成局部双螺旋结构，而非互补区则膨出成环，形成发夹结构或茎环结构(stem-loop)

第四十一页，共七十四页，编辑于2023年，星期一RNA在细胞核中合成，主要分布在胞质中。RNA的种类、结构多种多样，它的主要作用是将DNA的遗传信息表达为蛋白质多肽链的氨基酸序列。根据在蛋白质的合成中所起的作用不同，RNA主要分为三类：信使RNA(messengerRNA，mRNA)、转运RNA(transferRNA，tRNA)和核糖体RNA(ribosomalRNA，rRNA)。mRNA可直接传递DNA分子上的遗传信息，是蛋白质合成的直接模板；tRNA携带、转运蛋白质合成的原料——氨基酸；rRNA与蛋白质组成核糖体，是细胞中蛋白质合成的场所。一、mRNA和hnRNAmRNA是一种将DNA的遗传信息转换为特定序列氨基酸的多聚核苷酸，mRNA种类很多，但寿命很短，大多为1-3min，更新速度快。它的数量也很少，仅占RNA总量的3％左右。绝大多数真核生物mRNA的3′端有一段长度100-200个碱基的多聚腺苷酸(po1yA)，po1yA结构与mRNA的半衰期有关。原核生物mRNA的3′端一般无或者有小于10个bp的polyA序列。真核生物mRNA5’端有一个7-甲基鸟嘌呤核苷三磷酸的结构，称为帽子结构（图）。这种结构有抗5’-核酸外切酶降解的作用，与蛋白质生物合成的正确起始有关。第四十二页，共七十四页，编辑于2023年，星期一图mRNA真核生物的帽子结构第四十三页，共七十四页，编辑于2023年，星期一第四十四页，共七十四页，编辑于2023年，星期一真核生物mRNA只为一条肽链编码，称单顺反子，原核生物mRNA可为一条或多条肽链编码，为二条以上编码的称多顺反子。真核生物mRNA中有编码区和非编码区，编码区碱基序列决定氨基酸序列，非编码区与蛋白质合成调控有关。原核生物mRNA的5’端有一不编码的前导序列以及在多顺反子之间有不翻译区。原核生物mRNA在转录形成的同时就结合核糖体，进行着翻译过程，指导合成多肽链。真核生物转录在细胞核中进行，首先形成分子大小不一的RNA，称为核不均一RNA（hnRNA），它们随后被加工为成熟的mRNA，进入细胞质参加蛋白质合成。真核生物mRNA具有二级结构，如鸭珠蛋白mRNA有45-60％的核苷酸处于双螺旋之中；兔珠蛋白mRNA有55-62％的核苷酸的碱基配对。第四十五页，共七十四页，编辑于2023年，星期一二、tRNAtRNA在三类主要RNA中相对分子质量最小，仅由70～90个核苷酸组成，约占细胞总RNA的15％。tRNA的主要功能是转运氨基酸到核糖体上，参与多肽链合成。tRNA通过其共有的3’CCA一0H末端结构与某一特定的氨基酸连接，并通过反密码子与mRNA分子上的密码子互补配对，使转运的氨基酸按照。mRNA的遗传信息依次排列。细胞内tRNA的种类很多，但都具以下类似的结构特点：①分子中的双螺旋区称臂，不能配对的部分称环，tRNA-般由四臂四环组成。②三叶草的叶柄称氨基酸臂，由7个碱基对组成，富含G—C，其3′末端为CCA-OH结构，用来连接活化的氨基酸。③氨基酸臂对面的环称反密码子环，由7个核苷酸组成，环中央的三个碱基是与三联体密码相对应的反密码子。反密码子常出现次黄苷酸。④左臂连接一个二氢尿嘧啶环(也称为D环),由8－12个核苷酸组成，环上有二氢尿嘧啶。⑤右侧有一个TψC环（因环中有TψC序列而得名）和一个核苷酸数变化较大的可变环（也称额外环）。第四十六页，共七十四页，编辑于2023年，星期一图4-16tRNA的二级结构通式在tRNA中加入的核苷酸,其命名如下:以加入的核苷酸前一个核苷酸的序号加冒号后再编号.例如,20:1和20:2表示在第20位核苷酸之后加入的第一个和第二个核苷酸。图中粗黑圆圈表示所有tRNA在这个位置上的核苷酸都是固定不变的,或者变化较小，椭圆表示并非所有tRNA在这个位置上都有核苷酸存在。例如,在第18,19往前的两个核苷酸.在第20位后的两个核苷酸以及在可变环中的核苷酸(其中有17个核苷酸可有可无)。Ⅰ、二氢尿嘧啶环;Ⅱ、反密码子环;Ⅲ、可变环;Ⅳ、TψC环第四十七页，共七十四页，编辑于2023年，星期一酵母苯丙氨酸tRNA的三级结构为倒L形．其大小为6.5×7.5×2.5nm。氨基酸臂与TψC臂形成一个连续的双螺旋区．构成字母L下面的一横。而二氢尿嘧啶环与反密码环构成字母L的—竖。二氢尿嘧啶环和TψC环组成字母L的拐角。见图4-17。图4-17酵母苯丙氨酸-tRNA三级结构示意图第四十八页，共七十四页，编辑于2023年，星期一三、rRNA

rRNA是构成核糖体的RNA，也是细胞内主要的和分子量较大的一类DNA,大约占细胞RNA总量的80%。核糖体是蛋白质生物合成场所，可分为大小两个亚基,其亚基组成及rRNA的种类和沉降系数如下表所示。原核生物核糖体中蛋白质占1/3，rRNA占2/3。真核生物核糖体蛋白质和rRNA各占一半。目前多种rRNA的一级结构和二级结构已经确定，其特定碱基序列所具有的功能也在不断被揭示。70S80S原核生物真核生物核糖体rRNA核糖体rRNA16S18S5S、23S5S、5.8S、28S第四十九页，共七十四页，编辑于2023年，星期一第五十页，共七十四页，编辑于2023年，星期一四、非编码小RNA

细胞内的不同部位还存在一类被称之为非编码小RNA(smallnon-messengerRNA，snmRNAs)的小分子RNA。近年来对snmRNAs进行了广泛深入的研究，并由此产生了RNA组学(RNomics)，“RNA组学”就是从基因组水平研究细胞中snmRNAs结构与功能的一门新的科学。snmRNAs在基因的转录、转录后加工及翻译中发挥重要组织和调控作用，形成了细胞中高度复杂的RNA网络。(一)核(内)小RNA核小RNA(smallnuclearRNA，snRNA)，存在于细胞核中，此类中的一些RNA具有催化活性，与核内蛋白质共同组成RNA剪接体，在hnRNA转录后加工中起重要作用，其次在控制细胞分裂和分化，协调胞内物质传输等中起作用。(二)核仁小RNA核仁小RNA(smallnLmleolarRNA，snoRNA)，存在于核仁，在rRNA前体的剪接加工和转录后修饰过程中起重要作用，主要与2-O-核糖甲基化及假尿嘧啶核苷的形成有关。第五十一页，共七十四页，编辑于2023年，星期一(三)胞质小RNA胞质小RNA(smallcytoplasmicRNA，scRNA)的种类很多，其中7SLRNA与蛋白质一起组成信号识别颗粒(SRP)，SRP参与分泌性蛋白质的合成。(四)催化性小RNA催化性小RNA(smallcatalyticRNA)主要参与生物体内RNA前体的加工剪接。20世纪80年代初，T．R．Cech在研究四膜虫的rRNA剪接加工过程中发现，当除去所有蛋白质后rRNA前体仍可进行剪接，表明RNA分子本身具有酶的催化作用，后将这类具有催化功能的小RNA命名为“ribozyme'’，译为“核酶”。人工设计的核酶在临床上已被试用于治肿瘤和病毒性疾病等。(五)小干扰RNA小干扰RNA(smallinterfer’ingRNA，siRNA)，是生物宿主对外源侵入的基因表达的双链RNA进行切割所产生的特定长度和特定核酸序列的小片段RNA，siRNA可以与外源基因表达的mRNA相结合，然后降解这些mRNA分子，使其失去合成蛋白质的能力，从而导致基因沉默，这一现象被称为RNA干扰。siRNA能特异并高效地抑制基因的活性，因此RNA干扰技术已经成为一项常规的基因功能研究手段。

第五十二页，共七十四页，编辑于2023年，星期一(六)微小RNA．微小RNA(microRNA，miRNA)，是一种单链小分子RNA。它广泛存在于真核生物中，是一组不编码蛋白质的短序列RNA，能够与那些和它的序列互补的mRNA分子甚至特定的DNA片段相结合，导致基因的沉默。据推测，mRNA调节着人类1/3的基因。研究表明miRNA在癌症、心脏病、艾滋病等各种疾病的治疗中起到一定的作用。第四节核酸的理化性质一、核酸的一般理化性质

DNA为白色纤维状固体，RNA为白色粉末;RNA和DNA都是极性化合物，都微溶于水而不溶于乙醇、乙醚、氯仿等有机溶剂。常用乙醇从溶液中沉淀核酸。它们的钠盐比自由酸易溶于水。高分子溶液比普通溶液粘度要大得多，不规则线团分子比球形分子的粘度大，而线形分子的粘度更大。由于天然DNA分子量大，分子细长，长度可达几厘米，因此，即使是极稀的DNA溶液，粘度也极大。RNA分子DNA分子短得多，呈无定形。RNA的粘度比DNA粘度小。当DNA溶液加热，或在其他因素作用下发生螺旋→线团转变时，粘度降低。所以可用粘度作为DNA变性的指标。第五十三页，共七十四页，编辑于2023年，星期一核酸分子高度不对称，因此核酸的旋光性很强，旋光方向为右旋。这是核酸的一个重要特性。DNA分子的大小可用长度(m)、相对分子质量或碱基对(bp)来表示。1mDNA=2000×103=3×103bp二、核酸的紫外吸收性质碱基的嘌呤环和嘧啶环为共轭体系，可强烈吸收260-29Onm波段紫外光，其最高的吸收峰接近260nm(图4-19)，蛋白质由于芳香族氨基酸残基而在280nm左右有最大吸收峰。利用这一特性，可以鉴别核酸样品中的蛋白质杂质。还可以利用核酸的这一特性来定位测定它在细胞和组织中的分布，细胞的紫外光照相主要是利用核酸的强烈吸收紫外光作用，也可利用这种性质测定嘌呤或嘧啶衍生物在纯溶液中的含量(每摩尔这种物质在一定pH条件下的紫外吸收值为常数)，以及它们在色谱和电泳谱上的位置。常利用核酸电泳后在紫外灯下显出清晰的荧光带，可方便地进行核酸操作。第五十四页，共七十四页，编辑于2023年，星期一图DNA的紫外吸收光谱1.天然DNA2.变性DNA3.核苷酸总吸收值第五十五页，共七十四页，编辑于2023年，星期一三、核酸的两性性质含有酸性的磷酸基和碱性的含氮碱基，既可解离成阴离子又可解离成阳离子。碱基的解离由于嘧啶和嘌呤化合物杂环中的氮原子以及各种取代基具有结合和释放质子的能力，所以含氮碱基既有碱性解离又具有酸性解离的性质。例如胞嘧啶环上3位“—N＝”转变为带正电荷的“—N+H＝”，2位的烯醇式羟基可释放质子，呈酸性。第五十六页，共七十四页，编辑于2023年，星期一2核苷的解离核苷中的糖对碱基解离有一定的影响，核糖上的羟基也可发生解离。3核苷酸的解离含有磷酸，使核苷酸具有较强的酸性。磷酸可发生两级解离，分别称为第一磷酸基团解离（pKIP)和第二磷酸基团解离（pKIIP)第五十七页，共七十四页，编辑于2023年，星期一4核酸分子的解离核酸分子多核苷酸链中，除末端磷酸残基外，磷酸二酯键中的磷酸残基只有一个解离常数（pKa=1.5)，因分子中磷酸残基pKa较低，当溶液pH值高于4时，核酸分子几乎全部解离呈多阴离子状态，故可把核酸看成具有较强酸性的多元酸。可与金属离子成盐，也可与碱性蛋白结合。碱基解离与pH有关，碱基解离又影响碱基对之间氢键性质，因此pH影响双螺旋碱基对间氢键稳定性。DNA在pH4.0～11.0之间稳定。5核苷酸与核酸的等电点核酸和核苷酸既有酸性磷酸基,又有碱性基团,所以是两性电解质，在一定的pH条件下，可以解离而带电荷，因此都有一定的等电点，RNA等电点为pH2.0～2.5，DNA等电点为pH4.0～4.5第五十八页，共七十四页，编辑于2023年，星期一四、核酸的颜色反应由于核酸的磷酸基酸性较强，常表现为酸性，能与Na＋、K＋、Mg＋等金属离子结合成盐，也易与碱性化合物结合成复合物，如与甲苯胺蓝、派罗红、甲基绿等碱性染料结合。其中甲苯胺蓝能使DNA、RNA都染上蓝色，派罗红专染RNA成红色，甲基绿专染DNA成绿色，故细胞组织化学中利用此性质用于核酸染色。1地衣酚反应

D-核糖与浓盐酸和苔黑酚(甲基间苯二酚)共热产生绿色，在670nm有最大吸收。第五十九页，共七十四页，编辑于2023年，星期一2二苯胺反应D-2－脱氧核糖核酸和二苯胺一同加热产生蓝紫色，在595nm有最大吸收。可利用这两种糖的特殊颜色反应区别DNA和RNA或做为二者定量测定的基础。3钼蓝反应用强酸将核酸样品高温消化，使有机磷变为无机磷，进一步与钼酸铵反应生成磷钼酸，经还原生成蓝色复合物，650nm测定第六十页，共七十四页，编辑于2023年，星期一第六十一页，共七十四页，编辑于2023年，星期一五、核酸的变性和复性(一)核酸的变性天然的双螺旋DNA和具有双螺旋区的RNA溶液在一些物理化学因素的作用下，氢键断裂，空间结构破坏，双螺旋解开，变成无规线团状态的现象称为DNA变性。DNA变性后会发生性质改变，如生物学功能部分或全部丧失，紫外吸收增强（图）、粘度下降，浮力密度升高等。变性主要是二级结构的改变引起的，并不涉及磷酸二酯键断裂。引起核酸变性的理化因素有：加热、有机溶剂、酸、碱等。核酸变性后由于原双链中向内互补的碱基对拆离暴露，故对260nm紫外吸收值增高，该现象称为增色效应。反之为减色效应。DNA的加热变性从开始解链到完全解链，是在一个相当窄的温度范围内完成的，因此加热DNA溶液达一定温度时，260nm的吸光度骤然增加，最后达到最大值，其过程类似与晶体的熔解，以温度对其紫外吸收值作图得一曲线，将紫外吸收的增加值达最大增加值一半时的温度值称熔解温度(Tm)(图)，即50%DNA变性时温度。第六十二页，共七十四页，编辑于2023年，星期一图DNA的熔点第六十三页，共七十四页，编辑于2023年，星期一影响变性温度的因素有：①三个氢键的G-C对与二个氢键的A-T对相对含量，DNA链中G-C对含量愈高,亦愈高反之则低。有经验公式为:.②溶液的离子强度可影响，离子强度高，升高，因为DNA链上解离带负电荷的磷酸基团与介质中正离子形成离子键，稳定双螺旋结构。离子强度较低的介质,较低。在纯水中，DNA在室温下即可变性。DNA制品不应保存在极稀的电解质液中。RNA也具有螺旋→线团之间的转变。但由于RNA只有局部的双螺旋区，所以这种转变不如DNA那样明显。变性曲线也不那么陡，值较低。③溶液的pH，高pH下碱基广泛失去质子，氢键形成的能力丧失。pH大于11.3时,DNA完全变性。pH低于5.0时，DNA易脱嘌呤。对单甲酰胺、尿素、甲醛等可破坏氢键,妨碍碱基堆积,使下降,常使用作变性剂.第六十四页，共七十四页，编辑于2023年，星期一(二)核酸的复性在适当条件下，变性DNA分开的两条互补链可重新经由氢键连接而形成双螺旋结构的过程叫复性(renaturation)。复性后DNA的一系列理化性质得到恢复，如粘度增高，生物活性部分恢复，260nm紫外吸收降低到原来变性前的水平。变性核酸复性时需缓慢冷却，故又称退火。复性时核酸单链随机碰撞，不能形成碱基配对或只形成局部碱基配对时，在较高的温度下两链重新又分离,经多次试探性碰撞，碱基配对正确，才能形成完整的双螺旋（图）。如果复性过快，单链上碱基来不及识别配对，则仍为单链。核酸复性时，温度不宜过低。一般认为比Tm低25℃左右的温度是复性的最佳条件。第六十五页，共七十四页，编辑于2023年，星期一图核酸的变性与复性过程第六十六页，共七十四页，编辑于2023年，星期一(三)核酸杂交在退火条件下，不同来源的DNA由于某区域碱基互补，成双链，或DNA单链和RNA链的区域性碱基互补形成DNA-RNA双链杂合的过程称核酸杂交，或分子杂交。杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基序列完全互补，只要有一定同源序列（不同来源）的单链彼此间有一定程度的互补序列，就可形成。核酸杂交可在液相或固相载体上进行，硝酸纤维素膜常作为载体。核酸杂交广泛用于进行基因定位，确定基因拷贝数等，使用天然的或人工合成的一段合适的DNA或RNA单链，经放射性同位素或荧光标记，通过杂交可以在许多其他DNA片段中检出一个特殊DNA片段，这种标记的互补核酸链称做探针。杂交后通过检测标记的位置就可找到相应特定的核酸。第六十七页，共七十四页，编辑于2023年，星期一用探针直接与菌落或组织细胞中的核酸杂交，因未改变核酸所在的位置，称原位杂交技术。将核酸直接点在膜上，再与探针杂交称点杂交，使用狭缝点样器时，亦称狭缝印迹杂交。该技术主要用于分析基因拷贝和转录水平的变化，亦可用于检测病源微生物和生物制品中的核酸污染状况。英国生物学家Southern提出一种方法，将电泳变性后的DNA片段转移至硝酸纤维素上，再进行分子杂交，此法称为Southern印迹杂交（Southernblotting）。后来Alwine提出将RNA经电泳变性后转移至纤维素膜上再进行杂交的方法，被戏称为Northern印迹杂交（Northernblotting）。通过抗体与抗原结合的方法来分析蛋白质，被称为Western印迹杂交（Westernblotting）。分子杂交技术还可以用于检出特殊RNA，依靠这些技术可以分离和鉴定基因和RNA。这种技术的发展和完善，已经可以用来在一根毛发的基础上证实某个人是否在犯罪现场，或者某个个体在临床症状发生几十年前预测它可能发生的疾病。因此，核酸的杂交技术在分子生物学、分子遗传学和医学等领域的应用极为广泛。第六十八页，共七十四页，编辑于2023年，星期一六、核酸的分离纯化与测定一核酸的提取

应注意保持核酸的完整性，尽量降低核酸酶的活性，如加柠檬酸钠、EDTA等抑制剂或去激活剂；防强酸、强碱的降解作用；防高温、剧烈搅拌等。1DNA提取

核蛋白（DNP）在核内，先提取DNP。破碎细胞后，用1～2mol/LNaCl液提取DNP,稀释至0.14mol/L使DNP沉淀出来，反复再溶解再沉淀以进一步纯化，加十二烷基磺酸钠使蛋白变性沉淀，而DNA呈溶解状态，离心取上清，加乙醇或乙醚可得纤维状DNA2RNA提取先离心分离有关细胞器，再从细胞器中提取某种RNA，从核糖体、从细胞质、从多聚核糖体提，用酚法，先用异硫氰酸胍等使蛋白变性，再用苯酚和氯仿多次除蛋白，得RNA。二核酸的分离纯化密度梯度离心、羟基磷灰石或甲基白蛋白硅藻土柱色谱纯化DNA。密度梯度离心、多种柱色谱法纯化RNA。第六十九页，共七十四页，编辑于2023年，星期一七、核酸的测定

1核酸含量的测定（1）紫外吸收法根据核酸的紫外吸收性质进行的含量测定，灵敏度高，但有干扰。（2）定磷法纯的核酸含磷量9.5%，通过钼蓝反应生成钼蓝化合物，在650～660nm比色测定，算出总含磷量，减去无机磷的量，即为核酸磷的量，乘以10.5即得核酸含量。（3）定糖量根据地衣酚反应生成绿色物质，在670～680nm比色测定，与标准曲线比较得样品RNA含量；根据二苯胺反应生成蓝色化合物，在595nm比色测定，与标准曲线比较得样品DNA含量。2核酸纯度的测定(1)紫外吸收法纯DNA的A260/A280为1.8，纯RNA的A260/A280为2.0，通常用A260