基因工程的基本操作程序(精华)

第2节基因工程的基本操作程序当前第1页\共有60页\编于星期五\7点基因工程基本操作的四个步骤：第一步：目的基因的获取第二步：基因表达载体的构建第三步：将目的基因导入受体细胞第四步：目的基因的检测与鉴定当前第2页\共有60页\编于星期五\7点一、目的基因的获取1.什么是目的基因？——主要是指编码蛋白质的结构基因。补充：基因的结构编码区非编码区编码区上游非编码区编码区下游启动子终止子(1)原核基因的结构：与RNA聚合酶结合位点转录起点转录终点终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录编码蛋白质(编码序列)调控遗传信息的表达(调控序列)启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质当前第3页\共有60页\编于星期五\7点一、目的基因的获取1.什么是目的基因？——主要是指编码蛋白质的结构基因。补充：基因的结构(2)真核基因的结构：转录mRNA前体翻译肽链内含子

外显子

编码区非编码区非编码区启动子终止子加工成熟mRNA当前第4页\共有60页\编于星期五\7点一、目的基因的获取1.什么是目的基因？——主要是指编码蛋白质的结构基因。2.获取方法：(1)从基因文库中获取：①基因文库：——将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因。②基因文库的分类：按外源DNA片段的来源分类基因组文库：部分基因文库：含有一种生物的全部基因含有一种生物的部分基因当前第5页\共有60页\编于星期五\7点一、目的基因的获取1.什么是目的基因？——主要是指编码蛋白质的结构基因。2.获取方法：(1)从基因文库中获取：③获取目的基因的根据：——根据目的基因的有关信息，例如，根据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物mRNA，以及基因的表达产物蛋白质等特性来获取目的基因。④建立基因文库的目的：——为了在不知目的基因序列的情况下，便于获得所需的目的基因。当前第6页\共有60页\编于星期五\7点(1)从基因文库中获取：⑤基因文库的构建：基因组文库的构建：直接分离法(鸟枪法)提取某种生物的全部DNA用适当的限制酶切一定大小的DNA片段将DNA片段与载体连接导入受体菌中储存基因组文库注意：基因文库的组建过程就包含了基因工程的步骤。目的基因的获取基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞当前第7页\共有60页\编于星期五\7点(1)从基因文库中获取：⑤基因文库的构建：cDNA文库的构建：反转录法某种生物的单链mRNA单链互补DNA双链cDNA片段导入受体菌中储存与载体连接cDNA文库反(逆)转录酶DNA聚合酶当前第8页\共有60页\编于星期五\7点(1)从基因文库中获取：⑤基因文库的构建：基因组文库和cDNA文库的区别：文库类型cDNA文库基因组文库文库大小小大基因中启动子无有基因中内含子无有基因多少某种生物的部分基因某种生物的全部基因物种间的基因交流可以部分基因可以当前第9页\共有60页\编于星期五\7点一、目的基因的获取1.什么是目的基因？——主要是指编码蛋白质的结构基因。2.获取方法：(1)从基因文库中获取：⑥从基因文库中获取目的基因的优点：——操作简便。⑦从基因文库中获取目的基因的缺点：——工作量大，具有一定的盲目性。当前第10页\共有60页\编于星期五\7点一、目的基因的获取2.获取方法：(2)利用PCR技术扩增目的基因：①什么是PCR？——PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。②PCR的原理：——利用DNA双链复制的原理。③条件：——要有一段已知目的基因的核苷酸序列【前提条件】、四种脱氧核苷酸、引物、热稳定DNA聚合酶(Taq酶)等。当前第11页\共有60页\编于星期五\7点(2)利用PCR技术扩增目的基因：④过程：脱氧胞苷三磷酸脱氧腺苷三磷酸脱氧鸟苷三磷酸脱氧胸苷三磷酸当前第12页\共有60页\编于星期五\7点(2)利用PCR技术扩增目的基因：④过程：A.变性(90℃-95℃)：——双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA。B.退火(55℃-65℃)：——系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。C.延伸(70℃-75℃)：——在Taq酶的作用下，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的DNA链。D.多次重复：当前第13页\共有60页\编于星期五\7点一、目的基因的获取2.获取方法：(2)利用PCR技术扩增目的基因：⑤方式：——以指数方式扩增，即2n(n为扩增循环的次数)。当前第14页\共有60页\编于星期五\7点⑥PCR技术扩增与DNA复制的比较：PCR技术DNA复制相同点原理原料条件不同点解旋方式场所酶结果碱基互补配对四种脱氧核苷酸模板、能量、酶DNA在高温下变性解旋解旋酶催化体外复制细胞核内热稳定的DNA聚合酶细胞内的DNA聚合酶大量的DNA片段形成整个DNA分子2.获取方法：(2)利用PCR技术扩增目的基因：当前第15页\共有60页\编于星期五\7点一、目的基因的获取2.获取方法：(3)化学方法人工合成：——如果基因比较小，核苷酸序列又已知，也可以通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成。当前第16页\共有60页\编于星期五\7点一、目的基因的获取练一练：1.多聚酶链式反应(PCR)是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。PCR过程一般经历下述三十多次循环：95℃下使模板DNA变性、解链→55℃下复性(引物与DNA模板链结合)→72℃下引物链延伸(形成新的脱氧核苷酸链)。下列有关PCR过程的叙述中不正确的是()A．变性过程中破坏的是DNA分子内碱基对之间的氢键，也可利用解旋酶实现B．复性过程中引物与DNA模板链的结合是依靠碱基互补配对原则完成C．延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP、四种核糖核苷酸D．PCR与细胞内DNA复制相比所需要酶的最适温度较高C当前第17页\共有60页\编于星期五\7点一、目的基因的获取练一练：2.获取目的基因的方法有多种，下列不属于目的基因获取方法的是()A．从基因组文库中获取B．从cDNA文库中获取C．从含目的基因生物细胞中获取D．利用PCR技术获取C3.

PCR技术扩增DNA，需要的条件是()①目的基因②引物③四种脱氧核苷酸④DNA聚合酶等⑤mRNA⑥核糖体A．①②③④B．②③④⑤C．①③④⑤D．①②③⑥A当前第18页\共有60页\编于星期五\7点一、目的基因的获取练一练：4.有关基因工程的叙述正确的是()A．限制酶只在获取目的基因时才用B．重组质粒的形成是在细胞内完成的C．质粒都可以作为运载体D．蛋白质的氨基酸排列顺序可以为合成目的基因提供线索D5.在基因工程技术中，下列方法与目的基因获得无关的是()A．辐射诱变法B．从基因文库中获取C．反转录法D．人工合成法A当前第19页\共有60页\编于星期五\7点一、目的基因的获取练一练：6.下列关于基因工程的说法中，正确的是()

A．基因工程的设计和施工都是在细胞水平上进行的B．目前基因工程所有的目的基因都是从供体细胞中直接分离得到的C．只要检测出受体细胞中含有目的基因，那么目的基因一定能成功进行表达D．基因工程能使科学家打破物种界限，定向改造生物性状D当前第20页\共有60页\编于星期五\7点一、目的基因的获取练一练：7.下列获取目的基因的方法中需要模板链的是()①从基因文库中获取目的基因②利用PCR技术扩增目的基因③反转录法④通过DNA合成仪利用化学方法人工合成A．①②③④B．①②③C．②③④ D．②③D当前第21页\共有60页\编于星期五\7点二、基因表达载体的构建1.构建目的：——使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。2.基因表达载体的组成：目的基因启动子终止子标记基因当前第22页\共有60页\编于星期五\7点二、基因表达载体的构建1.构建目的：——使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。2.基因表达载体的组成：想一想：启动子、终止子和标记基因分别有什么作用？启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质，但启动子本身不被转录。终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录。标记基因：鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来。当前第23页\共有60页\编于星期五\7点二、基因表达载体的构建3.构建表达载体：同一种限制酶载体(如质粒)DNA分子(含目的基因)一个切口两个黏性末端两个切口(两个黏性末端)的目的基因基因表达载体(如重组质粒)DNA连接酶当前第24页\共有60页\编于星期五\7点二、基因表达载体的构建3.构建表达载体：(1)用一定的_______切割质粒，使其出现一个切口，露出________。(2)用_____________切断目的基因，使其产生________________。(3)将切下的目的基因片段插入质粒的____处，黏性末端因_________________而相连，再加入适量___________，形成了一个重组DNA分子(重组质粒)。限制酶黏性末端同一种限制酶切口碱基互补配对原则相同的黏性末端DNA连接酶当前第25页\共有60页\编于星期五\7点二、基因表达载体的构建3.构建表达载体：特别提醒：(1)用限制酶切割载体和含目的基因的DNA分子时，可以使用不同的限制性核酸内切酶,但是必须切出相同黏性末端。(2)不同基因可以拼接的原因：不同生物的基因具有相同的结构和化学组成，都是双螺旋结构，都由四种脱氧核糖核苷酸组成，都遵循相同的碱基互补配对原则：A—T，G—C。(3)目的基因与载体的结合过程，实际上是不同来源的基因重组的过程。当前第26页\共有60页\编于星期五\7点二、基因表达载体的构建练一练：1.如图为基因表达载体的模式图，下列有关基因工程中载体的说法错误的是(

)A．基因工程的核心步骤是基因表达载体构建B．任何基因表达载体的构建都是一样的，没有差别C．图中启动子位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位D．抗生素抗性基因的作用是作为标记基因，用于鉴别受体细胞中是否导入了目的基因B当前第27页\共有60页\编于星期五\7点二、基因表达载体的构建练一练：2.下列操作中不属于基因表达载体构建过程的是()A.用一定的限制酶切割质粒露出黏性末端B.用同一种限制酶切割目的基因露出黏性末端C.将切下的目的基因片段插入质粒切口处D.将重组DNA导入受体细胞中D3.下列哪项不是基因表达载体的组成部分()A.启动子B.终止子C.标记基因D.复制原点D当前第28页\共有60页\编于星期五\7点二、基因表达载体的构建练一练：4.下列关于基因表达载体的叙述不正确的是()A．启动子是与RNA聚合酶识别和结合的部位，是起始密码B．启动子和终止子都是特殊结构的DNA短片段，对mRNA的转录起调控作用C．标记基因是为了鉴别受体细胞中是否有目的基因从而便于筛选D．基因表达载体的构建视受体细胞及导入方式不同而有所差别A当前第29页\共有60页\编于星期五\7点三、将目的基因导入受体细胞1.什么是转化？——目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。2.常用的受体细胞：——大肠杆菌、枯草杆菌、农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。3.将目的基因导入受体细胞的原理：——借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。当前第30页\共有60页\编于星期五\7点三、将目的基因导入受体细胞4.将目的基因导入植物细胞：①适用范围：(1)农杆菌转化法：——双子叶植物和裸子植物。小知识：植物的分类依据是否形成种子种子植物裸子植物：松、杉、柏、银杏被子植物双子叶植物：花生、大豆单子叶植物：水稻、玉米孢子植物藻类植物：衣藻、水绵、海带苔藓植物：葫芦藓、地钱蕨类植物：肾厥、满江红当前第31页\共有60页\编于星期五\7点三、将目的基因导入受体细胞4.将目的基因导入植物细胞：②农杆菌特点：(1)农杆菌转化法：——在自然条件下感染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有感染能力。当植物受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大量的酚类化合物，吸引农杆菌移向这些细胞，这时农杆菌的Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并整合到受体细胞染色体DNA上。当前第32页\共有60页\编于星期五\7点三、将目的基因导入受体细胞4.将目的基因导入植物细胞：③转化过程：(1)农杆菌转化法：当前第33页\共有60页\编于星期五\7点三、将目的基因导入受体细胞4.将目的基因导入植物细胞：(2)基因枪法：适用范围：——适用于单子叶植物，但成本较高。当前第34页\共有60页\编于星期五\7点三、将目的基因导入受体细胞4.将目的基因导入植物细胞：(3)花粉管通道法：适用范围：——适用于被子植物，且十分简便经济。胚珠花药花丝柱头花柱子房壁子房雄蕊雌蕊当前第35页\共有60页\编于星期五\7点三、将目的基因导入受体细胞5.将目的基因导入动物细胞：(1)导入方法：——显微注射法。(2)过程：——目的基因表达载体提纯→从雌性动物内取出卵(卵在体内或体外受精)并进行显微注射→含目的基因的受精卵→胚胎早期培养至囊胚期再移植到雌性动物输卵管或子宫，使其发育成具有新性状的动物。当前第36页\共有60页\编于星期五\7点三、将目的基因导入受体细胞6.将目的基因导入微生物：(1)原核生物特点：——繁殖快、单细胞、遗传物质少。(2)方法：——用Ca2+处理细胞→感受态细胞表达载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子。当前第37页\共有60页\编于星期五\7点三、将目的基因导入受体细胞知识拓展：(1)不同生物的受体细胞不同：植物一般为体细胞(也可以受精卵)，动物一般为受精卵，微生物一般为大肠杆菌。(2)上图中发生②与发生①相比，②会使目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达，原因是在进行细胞分裂时，细胞核上的DNA经复制后平均分配到两个子细胞中，保证了亲子代遗传性状的稳定性，而①细胞分裂时，细胞质是不均分的，子细胞不一定含有目的基因。当前第38页\共有60页\编于星期五\7点三、将目的基因导入受体细胞练一练：1.基因工程中科学家常采用细菌、酵母菌等微生物作为受体细胞，主要原因是()A．结构简单，操作方便B．繁殖速度快C．遗传物质含量少、简单D．性状稳定,变异少B2.在培育下列作物的转基因品种时，适合用农杆菌转化法导入目的基因的是()A．小麦B．玉米C．大豆D．水稻C当前第39页\共有60页\编于星期五\7点三、将目的基因导入受体细胞练一练：3.采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列导入目的基因的做法正确的是()①将毒素蛋白注射到棉受精卵中②将编码毒素蛋白的DNA序列，注射到棉受精卵中③将编码毒素蛋白的DNA序列，与质粒重组，导人细菌，用该细菌感染棉的体细胞，再进行组织培养④将编码毒素蛋白的DNA序列，与细菌质粒重组，注射到棉的子房并进入受精卵A.①②B.②③C.③④D.④①C当前第40页\共有60页\编于星期五\7点三、将目的基因导入受体细胞练一练：4.回答有关基因工程的问题：(1)构建基因工程表达载体时，用不同类型的限制酶切割DNA后，可能产生黏性末端，也可能产生____末端。若要在限制酶切割目的基因和质粒后使其直接进行连接，则应选择能使二者产生______(相同、不同)黏性末端的限制酶。(2)利用大肠杆菌生产人胰岛素时，构建的表达载体含有人胰岛素基因及其启动子等，其中启动子的作用是__________________________________________________________________________________________。在表达载体转化大肠杆菌时，常用________处理大肠杆菌，以利于表达载体进入；为了检测胰岛素基因是否转录出了mRNA，可用标记的胰岛素基因片段作探针与mRNA杂交，该杂交技术称为____________________。为了检测胰岛素基因转录的mRNA是否翻译成__________，常用____________杂交技术。平相同RNA聚合酶识别和结合的位点，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需要的蛋白质人胰岛素Ca2＋DNA分子杂交技术抗原—抗体当前第41页\共有60页\编于星期五\7点三、将目的基因导入受体细胞练一练：4.回答有关基因工程的问题：(3)如果要将某目的基因通过农杆菌转化法导入植物细胞，先要将目的基因插入农杆菌Ti质粒的__________中，然后用该农杆菌感染植物细胞，通过DNA重组将目的基因插入植物细胞的_______________上。T－DNA染色体的DNA当前第42页\共有60页\编于星期五\7点四、目的基因的检测与鉴定1.分子水平的检测：(1)导入检测：即检测转基因生物的DNA上是否插入了目的基因。——这是目的基因能够在受体细胞中稳定遗传的关键。①方法：——DNA分子杂交技术。②过程：——将转基因生物的DNA提取出来，在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等作标记，以此作为探针，使探针与基因组DNA杂交，如果显示出杂交带，就表明目的基因已插入染色体DNA中。当前第43页\共有60页\编于星期五\7点②过程：放射性同位素标记目的基因的DNA片段TACGGTCATGTCGCATGCTAGATGCCAGTACAGCGTACGATCGTACAGCGTA基因探针待测转基因生物1染色体DNA单链TACGGTCATGTCGCATGCTAG待测转基因生物2染色体DNA单链ATCCGGTGTAGGTCATGCTCGGTACAGCGTA基因探针GTACAGCGTA基因探针显示出杂交带不能显示出杂交带当前第44页\共有60页\编于星期五\7点四、目的基因的检测与鉴定1.分子水平的检测：(1)导入检测：即检测转基因生物的DNA上是否插入了目的基因。①方法：——DNA分子杂交技术。②过程：——检测受体细胞是否具有标记基因所控制的性状，如果具有标记基因所控制的性状，就表明受体细胞中含有目的基因，从而可以筛选出含有目的基因的受体细胞。想一想：欲检测受体细胞中是否含有目的基因，除了DNA分子杂交法外，可以如何检测？当前第45页\共有60页\编于星期五\7点四、目的基因的检测与鉴定1.分子水平的检测：(2)转录检测：即检测目的基因是否转录出了mRNA。——这是检测目的基因是否发挥功能作用的第一步。①方法：——(DNA-RNA)分子杂交技术。②过程：——从转基因生物中提取出mRNA，在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等作标记，以此作为探针，使探针与mRNA杂交，如果显示出杂交带，就表明目的基因在转基因生物中已经转录出了mRNA。当前第46页\共有60页\编于星期五\7点②过程：放射性同位素标记目的基因的DNA片段TACGGTCATGTCGCATGCTAGATGCCAGTACAGCGTACGATCGTACAGCGTA基因探针待测转基因生物1中的mRNAUACGGUCAUGUCGCAUGCUAG待测转基因生物2中的mRNAAUCCGGUGUAGGUCAUGCUCGGTACAGCGTA基因探针GTACAGCGTA基因探针显示出杂交带不能显示出杂交带当前第47页\共有60页\编于星期五\7点四、目的基因的检测与鉴定1.分子水平的检测：(3)翻译检测：即检测目的基因是否翻译成相应的蛋白质。——这是检测目的基因是否发挥功能作用的第二步。①方法：——抗原—抗体杂交技术。②过程：——从转基因生物中提取出蛋白质，用相应的抗体进行抗原—抗体杂交，如果显示出杂交带，就表明目的基因已形成蛋白质产品。当前第48页\共有60页\编于星期五\7点②过程：目的基因动物(如小鼠)体内抗体转基因生物中蛋白质抗原蛋白质表达显示出杂交带目的基因已形成蛋白质当前第49页\共有60页\编于星期五\7点四、目的基因的检测与鉴定2.个体生物学水平的鉴定：(1)实例1：一个抗虫或抗病的基因导入植物细胞后，是否赋予了抗虫或抗病的特性，需要做抗虫或抗病的接种实验，以确定是否具有抗性以及抗性的程度。(2)实例2：有的基因工程产品需要与天然产品进行功能活性比较，以确定转基因产品的功能活性是否与天然产品相同。当前第50页\共有60页\编于星期五\7点四、目的基因的检测与鉴定练一练：1.1976年,美国的科学家首次将人的生长抑制素释放因子的基因转移到大肠杆菌,并获得了表达，此文中的表达是指该基因在大肠杆菌()A.能进行DNA复制B.能传递给细菌后代C.能合成生长抑制素释放因子D.能合成人的生长素C当前第51页\共有60页\编于星期五\7点四、目的基因的检测与鉴定练一练：2．利用外源基因在受体细胞中表达，可生产人类所需要的产品。下列选项中能说明目的基因完成了在受体细胞中表达的是(

)A．棉花二倍体细胞中检测到细菌的抗虫基因B．大肠杆菌中检测到人胰岛素基因及其mRNAC．山羊乳腺细胞中检测到人生长激素DNA序列D．酵母菌细胞中提取到人干扰素蛋白D当前第52页\共有60页\编于星期五\7点五、课堂练习1.基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的,在基因操作的基本步骤中,不进行减基互补配对的步骤是()A.人工合成目的基因B.目的基因与载体结合C.将目的基因导入受体细胞D.目的基因的检测和表达C当前第53页\共有60页\编于星期五\7点五、课堂练习2.下列关于基因工程的叙述，错误的是(

)A．目的基因和受体细胞均可来自动、植物或微生物B．限制性核酸内切酶和DNA连接酶是两类常用的工具酶C．人胰岛素原基因在大肠杆菌中表达的胰岛素原无生物活性D．载体上的抗性基因有利于筛选含重组DNA的细胞和促进目的基因的表达D当前第54页\共有60页\编于星期五\7点五、课堂练习3.为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。(1)获得耐盐基因后，构建重组DNA分子所用的限制性内切酶作用于图中的____处，DNA连接酶作用于____处。(填“a”或“b”)aa