原核生物基因组及其表达

第一节细菌基因组及其复制

bactiriumreplication

一、细胞中的拟核nucleoid:细菌细胞中的基因组DNA为一种很大的环状双链DNA分子，它可以收缩为原来的千分之一，形成叫做拟核(nucleoid)的结构。拟核在功能上与真核细胞的细胞核相似，但在结构上有明显区别。当前第1页\共有60页\编于星期三\21点ColsedcircularDNA负超螺旋负超螺旋DNA在形成单链缺口后可变成松弛型DNA当前第2页\共有60页\编于星期三\21点细菌DNA也与某些特殊蛋白结合，形成类似真核生物染色质的结构Hu蛋白与组蛋白相似,包裹DNA细菌染色体上只有一个复制启始区(oriC)，复制过程是朝复制终点双向进行的，所以一个细菌染色体就叫做一个复制子。当前第3页\共有60页\编于星期三\21点二、细菌DNA复制的主要酶类细菌DNA的复制过程受许多酶或蛋白质因子的调节，但目前对它们控制染色体复制过程的确切机制还不很清楚。根据对大肠杆菌的遗传和生化研究，至少有18种不同基因的产物直接参与细菌染色体的复制过程.当前第4页\共有60页\编于星期三\21点（一）直接参与复制叉形成的蛋白质1、单链结合蛋白（single-strandbindingprotein，SSB）使DNA双链松弛，但不能解螺旋，可促进。。单链结合蛋白与DNA高亲和性地结合可以保护单链DNA部分不被核酸酶水解。单链结合蛋白可以加强单链DNA对DNA聚合酶的亲和力，DNA聚合酶前进时，会置换出结合在单链上SSB蛋白。次级结构。当前第5页\共有60页\编于星期三\21点2、DnaB蛋白：DNA螺旋酶(helicase)在DNA复制、修复、重组以及接合过程中，DNA两条互补链必须部分分开以形成单链DNA中间体，即解旋。该过程是由DNA螺旋酶催化完成的。SSB，primase,四种核苷三磷酸可提高活性。螺旋酶具有依赖DNA的ATPase活性，可把ATP水解产生的自由能转化为解旋DNA并使螺旋酶本身沿DNA链移动的机械能。当前第6页\共有60页\编于星期三\21点3、DnaG引物酶---RNA聚合酶提高DnaB蛋白与模板的结合与稳定１０－６０ｂｐ；功能？功能：合成冈崎片断的引物RNA当前第7页\共有60页\编于星期三\21点4、DNA聚合酶ⅢpolymoraseDNA聚合酶Ⅲ是真正负责大肠杆菌细胞内合成DNA的复制酶。

DNA聚合酶Ⅲ全酶由α、β、γ、δ、ε、θ、τ、δ’、χ和ψ10种不同的亚基组成。当前第8页\共有60页\编于星期三\21点

功能：？？DNA聚合酶Ⅲ全酶在细胞中的含量很少，在每个细胞中只有10－20个拷贝的全酶（holoenzyme）。DNA聚合酶Ⅲ至少含有3种重要的酶活性。即5’3’DNA聚合酶活性、3’5’外切核酸酶活性和依赖DNA的ATP酶活性。是除掉增长链前端的非互补的核昔酸，提高DNA合成的精确性。DNA聚合酶Ⅲ不具有5’3’外切核酸酶活性(活体内)。当前第9页\共有60页\编于星期三\21点5、DNA聚合酶Ⅰ

大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ是第一个被鉴定的DNA聚合酶，它是由polA基因编码的103kDa的单链多肽。当底物和模板存在时，DNA聚合酶Ⅰ可使脱氧核糖核苷酸依次加到具有3’－OH末端的多核苷酸链上。当前第10页\共有60页\编于星期三\21点DNA聚合酶Ⅰ是一个多功能酶，它可以催化以下的反应：？？

1、DNA链沿5’→3’方向的延长（DNA聚合酶活性）。2、从3’端水解DNA链（3’→5’外切核酸酶活性）。3、从5’端水解DNA链（5’→3’外切核酸酶活性）。当前第11页\共有60页\编于星期三\21点6、DNA连接酶ligase？？

催化两段相邻DNA片段的3‘一OH和5’磷酸基末端的连接反应当前第12页\共有60页\编于星期三\21点（二）在OriC位点起始DNA复制的蛋白质1、Dna蛋白DnaA蛋白为一种具有复制子特异性的启始因子，同时也是细菌DNA复制所必需的蛋白质，它识别oriC的DNA序列，并同oriC进行特异结合。2、DnaC蛋白DnaC蛋白对DnaB与ssDNA稳定起促进作用。当前第13页\共有60页\编于星期三\21点3、DNA回旋酶gyrase在DNA复制的起始、延长、终止起着关键作用。作用：催化依赖ATPDNA超螺旋化催化依赖DNA的ATP的水解在ATP存在，催化负超螺旋的松弛。DNA拓扑异构酶当前第14页\共有60页\编于星期三\21点

(三)终止DNA复制过程的蛋白质

细菌DNA的复制终止过程可能需要数种不同的终止蛋白。在大肠杆菌中，染色体复制终止过程需要一种叫做Tus蛋白的终止因子。当前第15页\共有60页\编于星期三\21点三、细菌DNA复制的模型

（一）大肠杆菌oric的结构在这一区域中，能够使DNA自动复制的最小片段为245bp。

当前第16页\共有60页\编于星期三\21点大肠杆菌的最小oriC序列中存在5段9bp的结构高度保守的序列，DnaA蛋白与这5个位点结合，所以这5个位点又叫DnaA框(DnaAbox).

大肠杆菌最小oriC序列的另一特征是其中存在许多GATC位点，这种位点是Dam甲基化酶作用的目标位点，所以叫做dam位点。在oriC中还存在与膜蛋白结合的位点当前第17页\共有60页\编于星期三\21点（二）细菌染色体DNA的复制1、oric组装和活化DnaA蛋白结合——促进DnaB解螺旋和SSB蛋白与ssDNA结合——DnaG引物酶合成引物RNA——合成冈崎片断当前第18页\共有60页\编于星期三\21点当前第19页\共有60页\编于星期三\21点2、复制叉的延长合成引物后——延长DnaA聚合酶3和引物体——复制体replisome冈崎片断：DnaB解螺旋、DnaG引物酶、SSB蛋白、DnaA聚合酶3复制体的两个活动中心：当前第20页\共有60页\编于星期三\21点当前第21页\共有60页\编于星期三\21点3、DNA复制的终止复制叉双向移动——最后在与oriC相对的复制终止子ter终止。当前第22页\共有60页\编于星期三\21点四、质粒的一般特征及其复制调节

质粒：1-多个双链DNA小环，只有少数基因，依赖于主染色体独立复制。附加体episome:也可以插入到细菌染色体中。某些质粒和附加体可以通过conjuction细菌结合传递信息。当前第23页\共有60页\编于星期三\21点拷贝数分类：singlecopyplasmidMulticopyplasmid

细胞中质粒的拷贝数还与质粒的不相容性(imcompatibility)有关。质粒不相容性是指在一组质粒中，其成员不能共存于同一细菌细胞中的现象。当前第24页\共有60页\编于星期三\21点第二节细菌基因组的转录与翻译

一、与转录有关的酶enzyme(一)依赖与DNA的RNA聚合酶原核生物只有一种RNA聚合酶,由4-5个亚基组成。其活性受到利福平(rifampicin)和利迪链菌素(streptolydigin)的抑制。当前第25页\共有60页\编于星期三\21点RNA聚合酶分子量为440kD，由4个亚基组成，各个亚基的分子量分别为160kD,150kD,70kD和40kDaδ亚基是RNA聚合酶的核心酶，它催化RNA链延长，当前第26页\共有60页\编于星期三\21点(二)CAP因子及其识别位点CAP(代谢降解物激活蛋白)因子与cAMP(环腺苷酸)结合的蛋白，控制某些操众元的表达。CAP与lac识别位点结合提高转录水平50倍。

通常认为，CAP因子、a因子以及核心RNA相连成一线，各自覆盖各自的识别位点.当前第27页\共有60页\编于星期三\21点(三)其它辅助因子在大肠杆菌中：1、H因子，影响聚合酶活性。H1和H2因子结合在一起时，其增效作用比单独存在时高许多倍。2、Hu因子3、D因子当前第28页\共有60页\编于星期三\21点(四)核糖体对转录的作用在许多细菌中，当编码蛋白质的基因开始转录以后，核糖体必须迅速结合到延长的RNA链上，转录才能进行。mRNA.当前第29页\共有60页\编于星期三\21点在活体条件下，RNA启始合成的位点在基因转录起点上游，RNA聚合酶中的δ单位与这一位点结合，形成启始复合体，所以叫做启动子。转录起点上游第10个碱基的位置，即一10位,为TATAAAT.第二段位于这一位点上游25个碱基的位置即一35位,为RNA聚合酶识别位点.二、转录启始、延长与终止

(一)启动子的结构特征当前第30页\共有60页\编于星期三\21点当前第31页\共有60页\编于星期三\21点（二）转录启始1、RNA聚合酶与启动子结合---关闭复合体。2、关闭复合体---开放复合体—合成RNA1、活化子----CAP蛋白协助RNA聚合酶结合。NTRC蛋白，作用于前面之后。2、受DNA超螺旋影响。3、DNAmethylation，也改变转录频率。

4、转录启始过程还受许多其他因子的调节，特别是那些编码分解代谢功能的操纵元，当细胞处于与某种代谢途径有关的基质中时，这类操纵元才能表达。当前第32页\共有60页\编于星期三\21点（三）转录延长

新和成的转录子达8-9个核苷酸-----进入延长期。RNA链延长既是一种由酶催化的多聚化反应，同时也是一种拓扑学反应(topologicalreaction)。1、б因子脱离复合体,提高聚合酶活性。2、RNA聚合酶的构型变化。3、拓扑变化。3、转录复合体稳定性增加。当前第33页\共有60页\编于星期三\21点（四）转录终止原核生物有2类1、内向终止。一连串AAA2、需要р因子蛋白。当前第34页\共有60页\编于星期三\21点（五）细菌中RNA合成与蛋白质合成的偶联

在同一操纵元中，一个基因的多肤链终止密码对下游基因的转录具有重要影响。即使这些基因的编码序列并不由任何终止密码隔断，其转录效率也非常低。这种上游基因的终止密码干扰下游基因转录的现象叫做遗传极性(geneticpolarity)。1、同一操纵元，上游基因的终止密码对下游基因的转录有重要影响。2、р因子蛋白。当前第35页\共有60页\编于星期三\21点（六）RNA转录后加工1、有些RNA转录后可直接参与蛋白的合成。2、有些RNA转录子含有几个RNA，需要切割和加工。rRNA转录子由RNA聚合酶3切割。前体RNA中的tRNA分子由RNA聚合酶3切割。当前第36页\共有60页\编于星期三\21点当前第37页\共有60页\编于星期三\21点三、翻译启始

（一）翻译起始复合体的结构细菌中mRNA有一个核糖体结合位点—SD序列，其同感序列为AGGAGGU，为于翻译起始点上游几个碱基位置。翻译起始复合体：70S核糖体，启始tRNA（fmet-tRNA），mRNA3种启始因子（initiationfactor）：IF-1，IF-2，IF-3，不参与延长。当前第38页\共有60页\编于星期三\21点当前第39页\共有60页\编于星期三\21点（二）mRNA的次级结构决定翻译起始1、核糖体结合位点序列都能折叠成次级结构，次级结构不打开，核糖体就不能起始。当前第40页\共有60页\编于星期三\21点（三）多顺反子mRNA的不等翻译及调节1、虽然原核生物的mRNA通常都是多顺反子结构，多顺反子编码的各种蛋白不等量和成。核糖体同RNA分子上不同顺反子的翻译起点结合的速率不同。响翻译的因素是细胞中与某些密码子相对应的tRNA的含量很低在这些密码上停留的时间较长，以待某些稀有tRNA扩散进来。2、在多顺反子翻译有时3’顺反子比5‘顺反子效率高。当前第41页\共有60页\编于星期三\21点（四）反义RNA对翻译的调节

1、大多数反式作用调节子都是蛋白质，但是某些小RNA分子也可以调节基因表达。2、可通过扩散到达把位点，与其互补来调节，形成双链区而行使功能。。

3、反义RNA（antisenseRNA）与mRNA结合：堵核糖体结合位点,或形成内切核酸酶的作用为点,形成终止子。当前第42页\共有60页\编于星期三\21点当前第43页\共有60页\编于星期三\21点第三节操纵元的调节表达在细菌中，绝大多数编码蛋白质的基因都以操纵元的形式组织在一起，许多操纵元在调节表达方面都有相似之处，但不同操纵元也都有各自不同的结构特点和调节表达方式。当前第44页\共有60页\编于星期三\21点第三节操纵元的调节表达

一、操纵元调节表达的一般模型诱导操纵元:在诱导型操纵元中，有些操纵元的操作子通常与一种抑制蛋白结合，所以在正常情况下并不表达，只有当某种诱导物(一种小分子化合物)与抑制蛋白(反作用子)结合后，抑制物的构型发生变化并脱离操作子，操纵元才能转录。抑制操纵元抑制型操纵元只有一种，即负控制抑制型操纵元。这种操纵元一般都能转录，当一种小分子的辅抑制物与一种抑制物蛋白结合后，这种复合体再结合到操作子上而抑制转录过程。

当前第45页\共有60页\编于星期三\21点一般来说,抑制型操纵元编码小分子化合物和成有关的酶。诱导型操纵元编码一些与分解代谢有关的酶。操纵元的突变研究。当前第46页\共有60页\编于星期三\21点二、乳糖操纵元的负控制和正控制诱导表达

乳糖操纵元(lacoperon)含有三个结构基因，它们分别编码与乳糖的吸收和分解有关的酶类。在这三个结构基因的上游依次为操作子、启动子、CAP蛋白结合位点以及一个编码抑制蛋白的结构基因即所谓的调节基因。当前第47页\共有60页\编于星期三\21点由lac操纵元编码的酶的合成既可以被诱导也可以被抑制。如果将大肠杆菌细胞在只以葡萄糖作为碳源和能源的培养基中培养，其细胞中乳糖渗透酶的活性都很低。如果将这些细胞再转移到含有乳糖的培养基上，则乳糖渗透酶的活性在20分钟内可增加一千倍。如果将细菌从含有乳糖的培养基转移到含有葡萄糖的培养基上，乳糖渗透酶合成则迅速被关闭或被抑制。lac操纵元控制表达有两种方式，第一种方式是当培养基中存在乳糖时，抑制蛋白脱离操作子，这就是所谓的抑制蛋白的负控制诱导;第二种方式是由CAP蛋白与DNA结合所调节的正控制诱导。当前第48页\共有60页\编于星期三\21点三、色氨酸操纵元与弱化反应attenuation

细菌基因组中存在数种与氨基酸合成有关的操纵元，其转录既可以受氨基酸自身的抑制，也可以受有关氨基酸衍生物的抑制，所以只要培养基中有足量氨基酸存在，这些操纵元就无须表达。色氨酸本身并不是一种诱导物，而是一种辅抑制物，即它活化一种特殊的抑制物，从而阻止色氨酸操纵元的转录。当前第49页\共有60页\编于星期三\21点弱化作用(attenuation)：当色氨酸含量丰富，载有色氨酸的氨酞tRNA浓度高时，由前导序列中可读框编码的RNA能够正常翻译，从而抑制trp操纵元的其他部分转录，所以就把这种现象叫做。而把这段能中止RNA转录的区域叫做弱化子或弱化基因(attenuator)。当前第50页\共有60页\编于星期三\21点Trpoperon结构当前第51页\共有60页\编于星期三\21点四、核糖体蛋白操纵元与翻译自动调节

在大肠杆菌中，70s核糖体由55种不同蛋白质组成，其中大亚基有31，编码这些蛋白质的基因连锁在几个不同的操纵元中。现在知道，大肠杆菌中所有核糖体蛋白都是等量合成，但其合成的调节机制目前还不很清楚。当前第52页\共有60页\编于星期三\21点所有核糖体蛋白成分都不是来自同一操纵元，编码rRNA的基因和核糖体蛋白的基因分散在细菌染色体的不同区域。协调蛋白质和rRNA合成的机制是，在核糖体形成过程中，某些核糖体蛋白结合到rRNA的某些特定区域，当rRNA上的结合位点全部被占用后，游离的核糖体蛋白就结合到自身的mRNA3端的有关位点上，阻止其mRNA进一步翻译。因此，这些核糖体蛋白又调节其自身mRNA的翻译.当前第53页\共有60页\编于星期三\21点当前第54页\共有60页\编于星期三\21点五、转录的总体控制stringentresponse严谨反应：将在营养丰富的完全培养基中培养的细胞转移到营养医乏的培养基中培养，细菌细胞对这种环境压就会作出反应，