口蹄疫液相阻断

演示文稿口蹄疫液相阻断当前第1页\共有18页\编于星期五\5点（优选）口蹄疫液相阻断当前第2页\共有18页\编于星期五\5点一、液相阻断ELISA基础知识液相阻断ELISA（LB-ELISA）通途：1、检测口蹄疫感染，广泛用于国际贸易中，是OIE指定方法之一；2、监测牛、羊和猪等偶蹄动物血清中口蹄疫免疫效价，评价口蹄疫疫苗免疫效果。当前第3页\共有18页\编于星期五\5点BL-ELISA原理图待检血清与病毒抗原混合液捕获抗体检测抗体病毒酶结合物显色液阳性不显色阴性显黄色当前第4页\共有18页\编于星期五\5点BL-ELISA反应原理：将预先滴定好的病毒抗原与被检血清首先在液相中反应，然后将抗原抗体复合物转移到包被了口蹄疫特异性抗体的ELISA板中，没有完全被血清抗体阻断的病毒抗原被ELISA板中的抗体捕获，再通过酶结合物与底物显色。按照实验孔呈现颜色与抗原对照（未加血清）孔呈现颜色相比较判定结果。抗体滴度以阻断50%病毒抗原的血清稀释度表示。当前第5页\共有18页\编于星期五\5点二、实验前准备1、使用前，试剂盒所有组份应回复到18-26℃，试剂要混合均匀，每个样品使用一个吸头。2、浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水25倍稀释。当前第6页\共有18页\编于星期五\5点三、实验操作步骤1、抗原抗体反应布板当前第7页\共有18页\编于星期五\5点图2

96孔酶标板检测20份样品布局图S11:32S2S3S4S5S6S7S8S9S10+1:32-1:41:641:641:81:1281:1281:2561:256S1

1:32S12S13S14S15S16S17S18S19S201:512病毒抗原1:641:10241:1281:20481:2561:4096当前第8页\共有18页\编于星期五\5点1.1稀释病毒抗原：用配制好的洗涤液在孔外6倍稀释病毒抗原。1.2待检血清稀释：在血清稀释板上，使用洗涤液连续2倍稀释每份被检血清，每份血清稀释2-8孔，根据检测用途而定。使每孔最终量都为50vl。1.3稀释阳性对照，参照步骤1.2，连续2倍稀释，从1：16-1：1024。1.4稀释阴性对照，参照步骤1.2，连续2倍稀释，从1：2-1：4。当前第9页\共有18页\编于星期五\5点1.5血清稀释板加样：使用稀释好的病毒抗原加样，其中预设的4孔病毒抗原对照孔按100vl/孔加入，其余待检血清、阴阳性对照按50vl/孔加入。加样完毕，所有样品孔和因阳性对照孔稀释度翻倍，变为图1图、2所示。1.6将加好样的血清稀释板封板，置于37℃反应2h。当前第10页\共有18页\编于星期五\5点2、样抗原抗体混合液及病毒抗原对照从血清稀释板上按次序转移到包被板上50vl/孔，封板，37℃反应30Min。3、洗涤液洗版5次，拍干。加抗体溶液50vl/孔，封板，37℃反应35Min。4、同上洗板5次，拍干。加酶结合物50vl/孔，封板，37℃反应35Min。当前第11页\共有18页\编于星期五\5点5、同上洗板5次，拍干，50vl/孔加入底物溶液（显色液A和B按1：1混合），37℃避光温育15min。6每孔再加50vl终止液终止反应，立即在450nm波长下读取OD值。当前第12页\共有18页\编于星期五\5点当前第13页\共有18页\编于星期五\5点四、结果分析1、实验成立条件病毒抗原对照OD值应在2.0±1范围内。阳性对照抗体效价应在1：1024±1滴度范围内。阴性对照抗体效价应＜1：8.如果实验无效，实验中的操作值得怀疑，最好重新作一遍。当前第14页\共有18页\编于星期五\5点2、结果判定抗原对照4孔，弃去1个最高和最低值，计算剩余2孔的平均OD值，再除以2，即50%对照值，该值即为临界值，表示阻断50%反应的对照OD450值。备检血清OD450值＞临界值，判为阴性；备检血清OD450值≤临界值，判为阳性；当前第15页\共有18页\编于星期五\5点每份血清系列滴度稀释中，阳性孔的最高稀释倍数即为该备检血清的抗体效价。若临界值处于2孔之间，抗体效价取相邻阳性孔和阴性孔稀释倍数的反对数中间值，如果处在1：64和1:128之间，则该份血清抗体效价是1：90。定性检测时，两个孔只有一个孔为阳性，则抗体滴度为1：128，2孔均为阳性，则抗体效价＞1：128.当前第16页\共有18页\编于星期五\5点抗体效价≥1：128，判为阳性；抗体效价≤1：64，判为阴性；抗体效价在1：64-1：128之间，判为可疑；可以血清需要复检，复检抗体效价≥1：128，判为阳性；抗体效价≤1：64，判为阴性；当前第17页\共有18页\编于星期五\5点五、注意事项1、实验前必须认