凝集反应演示文稿

凝集反应演示文稿当前第1页\共有87页\编于星期四\16点凝集反应当前第2页\共有87页\编于星期四\16点免疫学教研室曾霞第五章凝集反应和沉淀反应Agglutination

andprecipitation

当前第3页\共有87页\编于星期四\16点【概念】凝集反应（agglutination）---指颗粒性抗原(细菌、细胞等)与相应的抗体，或可溶性抗原（亦可用抗体）吸附于与免疫无关的载体形成致敏颗粒（免疫微球）与相应的抗体（或抗原），在适量电解质存在下发生特异性反应，形成肉眼可见凝集现象。第一节、凝集反应的特点当前第4页\共有87页\编于星期四\16点凝集反应1896,Widal，诊断伤寒病。1900,Landsteiner:ABO血型，1930年NobelPrize。【应用】广泛用于细菌的鉴定和分型、抗原分析、测定抗体和诊断疾病等临床检验。当前第5页\共有87页\编于星期四\16点1、抗原性质：颗粒性抗原或可溶性抗原致敏颗粒二、特点2、

特异性3、

阶段性：反应分两个阶段（1）结合（2）出现凝集块当前第6页\共有87页\编于星期四\16点乳胶颗粒红细胞当前第7页\共有87页\编于星期四\16点一、直接凝集反应(directagglutination)

颗粒性抗原（红细胞、细菌、乳胶颗粒等）与抗体特异性结合，形成肉眼可见的凝集块。凝集原（agglutinogen）凝集素（agglutinin）当前第8页\共有87页\编于星期四\16点1）

玻片凝集试验：定性试验2）

试管凝集试验：半定量（效价）试验肥达试验（Widaltest）外斐试验（Weil-Felixtest）交叉配血当前第9页\共有87页\编于星期四\16点(1)玻片凝集反应定性试验1）鉴定细菌：用已知抗体作为诊断血清来诊断相应抗原，适用于从病人标本中分离得到的菌种的诊断或分型。

阴性阳性当前第10页\共有87页\编于星期四\16点抗A抗B1%血球2）ABO血型鉴定人类ABO血型鉴定试验结果示意图AB阴性阳性当前第11页\共有87页\编于星期四\16点（2）试管凝集试验半定量试验在微生物学检验中常用已知细菌作为抗原液与一系列稀释的受检血清混合，保温后观察每管内抗原凝集程度，通常以产生明显凝集现象的最高稀释度作为血清中抗体的效价，亦称为滴度。当前第12页\共有87页\编于星期四\16点方法：1）倍比稀释待检血清：1：20待检血清生理盐水ml0.50.50.50.50.50.5

稀释梯度1:401:801:1601:3201:6400.5ml0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml（2）试管凝集试验半定量试验当前第13页\共有87页\编于星期四\16点试管凝集试验当前第14页\共有87页\编于星期四\16点

++++++++++-试管凝集反应（微量法）孔底凝块观察及判定当前第15页\共有87页\编于星期四\16点（2）试管凝集试验试管号123456789血清稀释1:101:201:401:801:1601:3201:6401:1280－菌液每管0.5ml最终稀释倍数1:201:401:801:1601:3201:6401:12801:2560－凝集现象++++++++++++++++--半定量试验当前第16页\共有87页\编于星期四\16点稀释梯度1:401:801:1601:3201:640假设结果++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++-++---当前第17页\共有87页\编于星期四\16点二、

间接凝集反应（indirectagglutination）将可溶性抗原（或抗体）吸附于适当大小的颗粒性载体表面，再与相应抗体（或抗原）作用，在适宜电解质存在的条件下，出现特异性凝集现象。致敏颗粒相应抗体（抗原）——抗原（抗体）+载体常用载体：醛化红细胞、聚苯乙烯胶乳颗粒当前第18页\共有87页\编于星期四\16点1）正向间接凝集试验：测Ab,如类风湿因子2）反向间接凝集试验：测Ag,如AFP

3）间接凝集抑制试验4）协同凝集试验（coagglutination）：SPA-IgGFc段-Ag间接凝集反应类型当前第19页\共有87页\编于星期四\16点（1）正向间接凝集反应【应用】用抗原致敏载体以检测标本中的相应抗体。当前第20页\共有87页\编于星期四\16点（2）反向间接凝集反应载体待检性抗原已知抗体【应用】用特异性抗体致敏载体以检测标本中的相应抗原。当前第21页\共有87页\编于星期四\16点（3）间接凝集抑制反应【应用】诊断试剂为抗原致敏的颗粒载体及相应的抗体，用于检测标本中是否存在与致敏抗原相同的抗原；同理可用抗体致敏的载体及相应的抗原作为诊断试剂，以检测标本中的抗体当前第22页\共有87页\编于星期四\16点

(4)协同凝集试验：SPA-IgGFc段-Ag葡萄球菌SPAIgG抗体抗原【应用】用于检测未知抗原，也适用于细菌的直接检测。当前第23页\共有87页\编于星期四\16点三、间接血凝试验以红细胞为载体→抗核抗体、类风湿因子当前第24页\共有87页\编于星期四\16点反应中的红细胞是未经致敏的受检者新鲜红细胞。主要试剂材料为抗人O型红细胞的单克隆抗体反应中的标本为受检者的全血。自身红细胞凝集试验当前第25页\共有87页\编于星期四\16点自身红细胞凝集试验当前第26页\共有87页\编于星期四\16点四、胶乳凝集试验当前第27页\共有87页\编于星期四\16点当前第28页\共有87页\编于星期四\16点五.明胶凝集试验：以粉红色明胶为载体

当前第29页\共有87页\编于星期四\16点检测抗红细胞不完全抗体的一种方法

凝集反应中IgM的作用比IgG大数百倍IgG与抗原结合后，常不出现凝集反应，称不完全抗体第三节

抗球蛋白试验（Coombs试验）当前第30页\共有87页\编于星期四\16点【原理】利用抗球蛋白抗体为第二抗体达到桥梁作用，连接红细胞表面抗原结合的特异性抗体，使红细胞凝集。当前第31页\共有87页\编于星期四\16点类型：（1）

直接Coombs试验：检测红细胞上的不完全抗体。（2）间接Coombs试验：检测游离在血清中的不完全抗体抗球蛋白参与的间接血凝试验（Coombs试验）当前第32页\共有87页\编于星期四\16点（一）直接Coombs试验不完全抗体检测红细胞上抗体当前第33页\共有87页\编于星期四\16点（二）间接Coombs试验检测血清中的抗红细胞抗体Rh阳性O型红细胞当前第34页\共有87页\编于星期四\16点*输血前的配血试验：不完全抗体*血型抗原抗体的检查*新生儿溶血性贫血性疾病的诊断*溶血性贫血的研究*对细菌或立克次体的不完全抗体的检查Coombs试验应用当前第35页\共有87页\编于星期四\16点概念——可溶性抗原（如多糖、蛋白质、类脂等）与相应抗体在适量电解质存在下发生特异性结合，出现肉眼可见的沉淀现象。第四节沉淀反应(precipitation)1898，Kraus首次发现毒素-抗毒素的沉淀现象。当前第36页\共有87页\编于星期四\16点1.抗原性质：可溶性抗原沉淀反应特点2.特异性：3.阶段性：（1）Ab与相应可溶性Ag发生特异性结合（2）形成可见现象：沉淀线（环）当前第37页\共有87页\编于星期四\16点（一）液体内沉淀试验（二）凝胶内沉淀试验(琼脂糖)（三）凝胶免疫电泳试验沉淀反应类型当前第38页\共有87页\编于星期四\16点一、液体内沉淀试验以含盐缓冲液为反应介质的抗原抗体特异性结合的沉淀试验。环状沉淀絮状沉淀免疫浊度测定当前第39页\共有87页\编于星期四\16点絮状沉淀试验(flocculation)【原理】将抗原溶液与相应抗体溶液混合，在电解质存在的条件下，抗原与抗体结合出现可见的絮状沉淀。【应用】测定抗原抗体反应的最适比。【方法】1.抗原稀释法：抗原最适比例2.抗体稀释法：抗体最适比例3.方阵滴定法：抗原抗体最适比例当前第40页\共有87页\编于星期四\16点免疫浊度测定(immunoturbidimetry)

概念——是将现代光学测量仪器与自动分析检测系统相结合应用于沉淀反应，可对各种液体介质中的微量抗原、抗体和药物及其他小分子半抗原物质进行定量测定。当前第41页\共有87页\编于星期四\16点【原理】当可溶性抗原与相应的抗体特异结合在两者比例合适时，在特殊的缓冲液中快速形成一定大小的抗原抗体复合物，使反应液出现浊度。免疫浊度测定当前第42页\共有87页\编于星期四\16点1.抗原抗体的比例（关键因素）。基本原则：在反应体系中保持抗体过量，遵循海德堡曲线，避免高剂量钩状效应。免疫比浊法测定的影响因素当前第43页\共有87页\编于星期四\16点当前第44页\共有87页\编于星期四\16点2.抗体的质量：特异性强、效价高、亲和力强、抗体来源（R型抗体）等。3.反应溶液：pH6.5～8.5/磷酸盐缓冲液。4.增浊剂：PEG/吐温-20。免疫比浊法测定的影响因素当前第45页\共有87页\编于星期四\16点（1）透射比浊法（2）散射比浊法

终点散射比浊法、固定时间散射比浊法、速率散射比浊法（3）免疫乳胶比浊法免疫比浊法分类当前第46页\共有87页\编于星期四\16点二、凝胶内沉淀试验【原理】将可溶性抗原与相应抗体分别放入凝胶内进行扩散，两者在比例合适的位置形成肉眼可见的沉淀线或沉淀环。【方法】1.单向琼脂扩散试验

2.双向琼脂扩散试验最常用凝胶：琼脂糖当前第47页\共有87页\编于星期四\16点1.单向琼脂扩散试验【平板法】又称单向辐射状免疫扩散（SRID）。沉淀环直径或面积大小与抗原量呈正相关，同时还和分子量和扩散时间有关。环的直径与抗原含量成正相关沉淀环1965年，Mancini建立。当前第48页\共有87页\编于星期四\16点计算方法：①Mancini曲线：适用于大分子抗原和长时间扩散（>48h）C/d2＝K②Fahey曲线：适用于小分子抗原和长时间扩散（24h）

logC/d＝K当前第49页\共有87页\编于星期四\16点

T1为16～24h；T2为24～48h；T3为48h以上,可见T3为直线，T1为反抛物线

t1为16～24h；t2为24～48h；t3为48h以上,可见t1为直线，t3为反抛物线Mancini曲线Fahey曲线当前第50页\共有87页\编于星期四\16点已知含量的Ag标准品Fahey曲线，使用半对数纸画曲线，浓度的对数与沉淀环直径呈线性关系。Fahey曲线的绘制当前第51页\共有87页\编于星期四\16点【应用】曾用于IgG、gM、IgA、C3、C4、转铁蛋白、抗胰蛋白酶、糖蛋白和前白蛋白等多种血浆蛋白。采用SRID需具备以下条件：①仅针对某待测抗原的单价特异抗血清；②已知含量的标准品；③待测样品含量在1.25μg/ml以上当前第52页\共有87页\编于星期四\16点SRID影响因素1、抗体质量2、标准曲线，质控血清3、结果与真实含量不符单克隆抗体；多克隆抗体；可出现假性降低与增高4、双环现象不同扩散率抗原性相同的两个组分当前第53页\共有87页\编于星期四\16点2.双向琼脂扩散试验【平板法原理】将抗原和抗体分别放入凝胶的对应孔中，让两者自由扩散，当两者比例合适发生结合时形成白色沉淀线。是抗原抗体鉴定的最基本方法之一当前第54页\共有87页\编于星期四\16点当前第55页\共有87页\编于星期四\16点1、检测抗原/抗体存在与否及估算其相对含量

2、分析抗原或抗体相对分子量【应用】沉淀线的位置：相对含量

、分子量

当前第56页\共有87页\编于星期四\16点Ag>AbAg=AbAg<Ab当前第57页\共有87页\编于星期四\16点3、分析抗原的性质当前第58页\共有87页\编于星期四\16点吻合——完全相同当前第59页\共有87页\编于星期四\16点相交——完全不同，有多种成分当前第60页\共有87页\编于星期四\16点相切——部分一致当前第61页\共有87页\编于星期四\16点4、抗体效价滴定1:4Ag1:21:81:161:321:64Ab常规方法，出现沉淀线的最高抗体稀释度为该抗体的效价。当前第62页\共有87页\编于星期四\16点5.抗原或抗体纯度的鉴定沉淀线的数目纯度当前第63页\共有87页\编于星期四\16点优点：1.加快反应的速度。2.提高了灵敏度。3.增加了分辨率。

电泳分析＋沉淀反应第六节免疫电泳技术（immunoelectrophoresistechnique）当前第64页\共有87页\编于星期四\16点免疫电泳技术类型对流免疫电泳（CIEP）：双向扩散+电泳火箭免疫电泳（RIE）：单向扩散+电泳免疫电泳（IE）：区带电泳+免疫双扩散免疫固定电泳（IFE）：区带电泳+免疫沉淀当前第65页\共有87页\编于星期四\16点一、对流免疫电泳(counterimmunoelectrophoresis,CLEP)【原理】定向加速电泳+双向免疫扩散抗原：置阴极，通电后向阳极泳动抗体：解离少，分子量大，加上电渗作用，负极泳动。pH>8.4当前第66页\共有87页\编于星期四\16点结果分析：无沉淀线出现则表明无相应的抗原。沉淀线位于抗原抗体孔中间，说明两者比例较适合。沉淀线偏向抗原孔一方，表示抗体浓度＞抗原，反之，则是抗体浓度＜抗原浓度。对流免疫电泳当前第67页\共有87页\编于星期四\16点（1）简便、快速、敏感度较双扩提高8～16倍，可测蛋白质浓度达ug/ml。（2）要求抗原、抗体比例严格，尽可能使用高效价免疫血清，必要时对待检样品采用不同稀释度（3）不适宜抗原抗体都是球蛋白的检测。（4）由于电渗的缘故，目前已不推荐使用。【CIEP方法评价】当前第68页\共有87页\编于星期四\16点二、火箭免疫电泳（rocketimmunoelectrophoresis,RIE）【原理】电泳+单扩定量检测技术含抗体的凝胶加入抗原若抗体浓度保持不变，峰的高度与抗原量呈正比，抗原含量越高，火箭峰越长；反之亦然。当前第69页\共有87页\编于星期四\16点（1）

定性：直接观察、染色（2）定量：根据峰高-浓度标准曲线计算（3）为提高灵敏度，可加入少量125I标记的标准抗原共同电泳，则可在含抗体的琼脂中形成不可见的火箭峰，采用放射自显影技术。根据自显影火箭峰降低的程度（竞争法）可计算出抗原的浓度。【结果判定】

当前第70页\共有87页\编于星期四\16点1.琼脂（无电渗或电渗很小的）影响火箭形状不规则。2.电泳终点时间的确定。3.标本数量多时应先通电后加样,防止宽底峰形.4.IgG定量时，可用甲醛与IgG上的氨基结合（甲酰化），抵消了电渗作用。【影响因素】由于电渗的缘故，目前已不推荐使用。当前第71页\共有87页\编于星期四\16点免疫电泳（immunoelectrophoresis,IE）【基本原理】区带电泳+免疫双扩散沉淀弧当前第72页\共有87页\编于星期四\16点1.Ag分离2.槽内加入抗血清（Ab）当前第73页\共有87页\编于星期四\16点沉淀弧3.Ag-Ab扩散和沉淀当前第74页\共有87页\编于星期四\16点当前第75页\共有87页\编于星期四\16点-+免疫电泳示意图当前第76页\共有87页\编于星期四\16点【方法评价】（1）分辨率高（2）仅定性（3）耗时（18~24h）、结果不易分析（4）沉淀线的数目和分辨率受许多因素影响。（5）目前大量应用于纯化抗原和抗体成分的分析及正常和异常体液蛋白的识别等方面。当前第77页\共有87页\编于星期四\16点四、免疫固定电泳（immunofixationelectrophoresis，IFE）

【原理】区带电泳+免疫沉淀类似免疫电泳，不同之处是将抗血清直接加于电泳后蛋白质区带表面，或将浸有抗血清的滤纸贴于其上，抗原与对应抗体直接发生沉淀反应，形成的复合物嵌于固相支持物中。当前第78页\共有87页\编于星期四\16点四、免疫固定电泳（immunofixationelectrophoresis，IFE）

【原理】区带电泳+免疫沉淀将未结合的游离抗原或抗体洗去，则仅保留被结合固定的某种蛋白。因不同抗原电泳移动距离不同，染色后通过着色带了解到某一抗原的存在。区带电泳支持物选用滤纸、醋纤膜、琼脂或聚丙烯酰胺皆可。当前第79页\共有87页\编于星期四\16点待检蛋白电泳贴浸有抗血清的滤纸抗原与对应抗体反应沉淀漂洗染色某一抗原的存在?

当前第80页\共有87页\编于星期四\16点

左图为IgGκ型,

中图为IgGλ型，右为正常

SPGAMκλSPGAMκλSPGAMκλ免疫固定电泳示意图当前第81页\共有87页\编于星期四\16点【IFE方法评价】（1）周期短:

整个操作过程仅需1.5一2h，（免疫电泳需要过夜孵育）（2）敏感性高：能检测到50一150mg/dl含量的单克隆蛋白。（免疫电泳：1g/dl。）（3）分辨清晰:利用非常短的电泳移动