浅析细菌内毒素检测方法及常见问题

浅析细菌内毒素检测方法及常见问题第一页，共四十三页，编辑于2023年，星期日内容细菌内毒素简介细菌内毒素检测方法常见问题及解决方案第二页，共四十三页，编辑于2023年，星期日一、细菌内毒素简介主要内容

——来源

——特性

——与热源的关系

——在药检中应用第三页，共四十三页，编辑于2023年，星期日主要来源

主要来自于革兰氏阴性杆菌，当细菌死亡或自溶后便会释放出内毒素，其化学成分主要是脂多糖，这是一种大分子物质，分子量约为106，其粒径约在1~5纳米

。细菌内毒素广泛存在于自然界中。如自来水中含内毒素的量为1至100EU/ml。第四页，共四十三页，编辑于2023年，星期日主要特性（实验器材处理方法）1.耐热性一般在100℃加热1小时无影响，120℃加热4小时能破坏98％，180－200℃干热2小时或250℃干热半小时才能完全破坏。

故：注射剂的一般灭菌条件是不能破坏内毒素的。2.不耐酸碱性

内毒素可被强酸、强碱和氧化剂破坏。

故：玻璃器皿用铬酸洗液浸泡第五页，共四十三页，编辑于2023年，星期日主要特性（实验器材处理方法）3.水溶性与不挥发性

热原能溶于水，本身不具挥发性，但能随水蒸气雾滴夹带入蒸馏水中，造成污染。

故：不可用湿热灭菌法处理实验器具第六页，共四十三页，编辑于2023年，星期日主要特性（去除内毒素方法）4.滤过性

原体积很小，约在1～5nm之间，故能通过除菌滤器而进入滤液中，但不能通过石棉滤板，也不能通过半透膜。5.吸附性

能被活性炭吸附剂吸附。内毒素在溶液中带有一定的电荷，因而可被某些离子交换介质吸附。第七页，共四十三页，编辑于2023年，星期日热原=内毒素？

热原指微生物产生的某些多糖蛋白复合物等使人体发热的物质，不仅仅是细菌内毒素。

但在药检的范畴，细菌内毒素是主要的热原物质，可以说无内毒素就无热原，控制内毒素就是控制热原。第八页，共四十三页，编辑于2023年，星期日热原检查方法简介

《中国药典》热原检查方法是采用家兔升温法进行检查。将一定剂量的供试品，静脉注入家兔体内，在规定时间内，观察家兔体温升高的情况，以判定供试品中所含热原的限度是否符合规定。第九页，共四十三页，编辑于2023年，星期日热原检查法第十页，共四十三页，编辑于2023年，星期日与热源对比内毒素检查法优势方便、快捷、经济；重现性好、灵敏度高；避免抗原的产生，克服生物测定的误差；

近年来已经普遍采用细菌内毒素检查法，逐渐替代了热源法第十一页，共四十三页，编辑于2023年，星期日在药检中的应用

细菌内毒素检查作为控制药品质量的一种方法，已经广泛的被世界各国药典收载。成品检查——药品安全性检查之一

半成品（生产过程）检查——事前质控手段，避免造成药品成批报废第十二页，共四十三页，编辑于2023年，星期日二、细菌内毒素检测方法《中国药典》批准使用方法：供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。但当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。本节将着重介绍凝胶法的操作与有关原理。测定方法凝胶法

光度测定法

浊度法

显色基质法

第十三页，共四十三页，编辑于2023年，星期日鲎试剂与内毒素反应机理内毒素C因子活化的C因子凝胶B因子

凝固酶原凝固酶活化的B因子凝固蛋白原鲎凝血系统－酶联反应第十四页，共四十三页，编辑于2023年，星期日名词解释1—鲎及鲎试剂

鲎：一种古老的栖身于沿海的海洋生物，节肢动物门，在我国主要分布于浙江、福建及两广的沿海一带。鲎试剂：利用鲎血液中的变性细胞，经裂解液和机械方式促使细胞破裂而提取到的一种细胞溶解物，能与极微量的细菌内毒素形成特异凝胶反应，反应的速度和凝胶的坚固程度与内毒素浓度有关，是体外检测内毒素的敏感试剂。第十五页，共四十三页，编辑于2023年，星期日第十六页，共四十三页，编辑于2023年，星期日名词解释2—国家标准品及工作标准品国家标准品：（单位：EU/ml）自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价；工作标准品：

经国家标准品稀释用于试验中鲎试剂灵敏度符复核、干扰试验及各种阳性对照；第十七页，共四十三页，编辑于2023年，星期日名词解释3—细菌内毒素检查用水

凝胶法：

内毒素含量小于0.015EU/ml的灭菌注射用水；

故：灭菌注射用水≠细菌内毒素检查用水

光度法：内毒素含量应小于0.005EU/ml；第十八页，共四十三页，编辑于2023年，星期日细菌内毒素检测之凝胶法实验程序1、试验准备：试剂、仪器及用具2、选择鲎试剂灵敏度，计算样品稀释度3、鲎试剂灵敏度复核4、供试品干扰试验（新药或新方法）5、供试品细菌内毒素凝胶法检测第十九页，共四十三页，编辑于2023年，星期日实验材料及用具1、仪器名称要求天平感量0.1mg以下电热干燥箱～300℃恒温水浴箱37±1℃水银或酒精温度计～100℃±1℃漩涡混合器/计时器60min±1min2、器具器具分类器具名称反应试管玻璃试管（外径10×75mm）、试管架、小三角瓶或磨口瓶移液器具刻度吸管及洗耳球或移液器及无热原吸头其他酒精灯、脱脂棉球、镊子、剪刀、砂轮、封口膜、记号笔第二十页，共四十三页，编辑于2023年，星期日试剂1、鲎试剂：具有国家颁发的批准文号2、内毒素工作标准品3、内毒素检查用水4、75％乙醇常用英文缩写BET：细菌内毒素检查BET水：细菌内毒素检查用水MVD：供试品最大有效稀释倍数NC：阴性对照MVC：供试品最低有效浓度PC：阳性对照λ：鲎试剂灵敏度L：供试品细菌内毒素限值第二十一页，共四十三页，编辑于2023年，星期日灵敏度复核试验：每批鲎试剂用于检测前都必须进行灵敏度复核。目的是为了对试剂、检测者的操作、环境条件、水平条件进行验证。以证实操作正常无误，准确可靠和结果可信。

试验举例：内毒素工作标准品为90EU/支；待测鲎试剂灵敏度λ＝0.25EU/ml。1、制备内毒素标准溶液：取工作标准品一支，轻弹瓶壁使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈出划痕，用75％酒精擦拭后启开，加1mlBET水溶解，封口膜封住，置漩涡振荡器上混匀15min后进行稀释，步骤如下(箭头下方为加入BET水量)：90EU/ml10EU/ml1EU/ml0.5EU/ml0.25EU/ml0.125EU/ml0.0625EU/ml0.2ml1.6ml0.2ml1.8ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml第二十二页，共四十三页，编辑于2023年，星期日0.2ml0.2ml1ml1ml1ml1ml水水溶解后的标准品水水水水90EU/ml10EU/ml1EU/ml0.5EU/ml0.25EU/ml0.125EU/ml0.0625EU/ml（2λ）（λ）（0.5λ）（0.25λ）第二十三页，共四十三页，编辑于2023年，星期日2、溶解鲎试剂：若鲎试剂为0.1ml装量，则取18支，每支加入0.1mlBET水溶解；若鲎试剂装量大于0.1ml，则取若干支，按标示量加入BET水溶解，再取0.1ml分装于标准玻璃试管（10mm×75mm），将试管按如下形状排列。3、加样：每列每支加入相应浓度的内毒素标准品溶液各0.1ml，第五列加入BET水0.1ml。12λ2λ30.5λ40.25λBET水2λ2λ2λ2λλλλλ0.5λ0.5λ0.5λ0.5λ0.25λ0.25λ0.25λ0.25λ第二十四页，共四十三页，编辑于2023年，星期日反应及结果判断：加样结束后用封口膜封口，轻振动混匀，置37℃水浴中保温60±2min，将每管拿出缓缓倒转180°，凝胶不变形为“＋”，凝胶不能保持完整为“－”。当2.0λ四支管都为阳性，0.25λ四支管都为阴性时，试验成立，按下面底公式计算复核的灵敏度λc

：

λc＝lg-1(∑X/4)（X:反应终点浓度的对数值。）当0.5λ≤λc≤2.0λ时，鲎试剂灵敏度复核合格，检测时仍以标示灵敏度λ为准。第二十五页，共四十三页，编辑于2023年，星期日左侧管旋转180°凝胶不能保持完整为阴性，记为“－”；右侧管旋转180°凝胶不变形为阳性，记为“＋”。第二十六页，共四十三页，编辑于2023年，星期日举例：设待复核的鲎试剂标示灵敏度λ为0.125EU/ml:平行管数内毒素标准溶液浓度（EU/ml）NC反应终点浓度CX(lgC)0.250.1250.060.031+++--0.06-1.222++---0.125-0.9033++--/0.125-0.9034++--/0.125-0.903λc＝lg-1(∑X/4)

＝lg-1｛［（-1.22）＋（-0.903）＋（-1.22

）＋（-1.22

）］/4｝＝0.104（EU/ml）

λc在0.5λ～2.0λ范围内，符合规定。第二十七页，共四十三页，编辑于2023年，星期日方法学验证—供试品干扰预试验目的：

确证产品对方法是否存在干扰（抑制或增强），得到供试品的最大不干扰浓度或最小不干扰稀释倍数，为正式干扰实验提供依据。影响因素：

—新药检查方法建立；

—鲎试剂批号或来源的改变；

—检品生产工艺，配方，成分的改变；

—检品关键成分来源的改变；第二十八页，共四十三页，编辑于2023年，星期日

方法学验证—供试品干扰预试验供试品溶液的最大稀释倍数的计算

MVD＝CL/λL:供试品的内毒素限值；

C：供试品溶液的浓度；当L以EU/ml表示时，C为1ml/ml;当L以EU/mg或EU/u表示时，C的单位为mg/ml或u/ml(注意：当L以EU/ml表示时，C的值不是样品的浓度，就是1)。第二十九页，共四十三页，编辑于2023年，星期日

方法学验证—供试品干扰预试验内毒素限值(L)的确定

药典附录有相应计算公式，即当今世界各国普遍采用的细菌内毒素计算公式，即：L=K/M，式中K为按规定给药途径，人每公斤体重每小时可以接受的不产生任何不良反应的细菌内毒素剂量（亦称致热阈），它基本上是一固定值，药典上对每一给药途径的K值都有具体的规定。M为按规定的给药途径，人每公斤体重每小时给药的最大剂量。这一个值的确定实际上才是计算限值的关键。

第三十页，共四十三页，编辑于2023年，星期日方法学验证—供试品干扰预试验（1）原则上一般根据药品使用说明书或国家药典委员会编制的《临床用药须知》来确定最大剂量。如儿童用药剂量大于成人用药剂量，则以儿童剂量为准。（2）为保证安全用药，对于抗感染、抗肿瘤、治疗心血管疾病等重症用的药品、需联合用药的药品药品，可根据计算值适当调整，严格至计算限值的1/2或1/3。第三十一页，共四十三页，编辑于2023年，星期日方法学验证—供试品干扰试验

目的：验证预干扰中确定的浓度或倍数下的供试品对于鲎试剂与内毒素的反应有无干扰作用。试验方法：须选择两家以上的鲎试剂进行试验

编号内毒素浓度/配制内毒素的溶液稀释用液稀释倍数所含内毒素的浓度平行管数A无/供试品溶液———2B2λ/供试品溶液供试品溶液12482λ1λ0.5λ0.25λ4444C2λ/检查用水检查用水12482λ1λ0.5λ0.25λ4444D无/检查用水———2第三十二页，共四十三页，编辑于2023年，星期日方法学验证—供试品干扰试验结果判定：如果有供试品和无供试品测得的鲎试剂灵敏度（λc）均在0.5λ-2.0λ范围内时，则认为供试品在该浓度下不干扰试验，否则需要对供试品做适当处理。

干扰的排除：

—对供试品进行更大倍数的稀释；

—选择灵敏度更高的鲎试剂；

—其他适宜的方法如过滤、中和、透析或加热处理等排除干扰。

第三十三页，共四十三页，编辑于2023年，星期日供试品细菌内毒素凝胶法检测

检测方法：

结果判定

阴性阳性阳性阴性编号内毒素浓度/配制内毒素的溶液平行管数A无/供试品溶液2B2λ/供试品溶液2C2λ/检查用水2D无/检查用水2注：A无干扰浓度供试品溶液；B供试品阳性对照；C阳性对照；D阴性对照。第三十四页，共四十三页，编辑于2023年，星期日三、常见问题及解决方案1、实验前未复核鲎试剂产品的灵敏度

鲎试剂灵敏度的改变或质量不符合要求，会影响实验结果，因此实验前应复核鲎试剂产品的灵敏2、实验器具的洁净度不符合要求

一般用硫酸清洁液浸泡，用自来水冲洗干净，再用新鲜蒸馏水冲洗三道，并干热（250℃）恒温1h即可。实验用的玻璃器具必须严格无菌无热原，建议不要使用一次性塑料制品。第三十五页，共四十三页，编辑于2023年，星期日3、实验条件达不到要求

实验室要求洁净，无尘埃空气流通，若是空调室，应备有一台超净工作台。

4、温度不符合要求

实验室温度为25±2℃较好，恒温水浴箱温度为37±1℃为宜。5、忽视样品本身干扰

第三十六页，共四十三页，编辑于2023年，星期日

供试品若经干扰试验证实存在干扰因素，可采用适宜的方法来消除干扰。消除干扰的一个重要原则是不能影响供试品中的内毒素生物活性。

(1).供试品稀释法

MVD=CL/λ

鲎试剂灵敏度(λ)越高(数值越小)，供试品的稀释倍数越大，干扰越小。第三十七页，共四十三页，编辑于2023年，星期日(