感染性疾病的分子诊断

感染性疾病的分子诊断第一页，共八十五页，编辑于2023年，星期六感染性疾病：由某种病原体所致，通过不同方式引起人体发生感染并出现临床症状的疾病。病原体：病毒、细菌、原虫、支原体、衣原体、立克次体、螺旋体、寄生虫。

第二页，共八十五页，编辑于2023年，星期六常规检测方法：

免疫学方法微生物学方法受敏感性、特异性限制，不易早期诊断，并且不易提供病原体分型及耐药性方面的信息。第三页，共八十五页，编辑于2023年，星期六感染性疾病的分子诊断策略一般性策略（检出病原体）：判断有无感染是何种病原体感染常用方法：PCR＋杂交完整性策略：检出病原体分型（分类）－亚型－耐药性常用方法：杂交、PCR、基因芯片、DNA测序第四页，共八十五页，编辑于2023年，星期六感染性疾病分子诊断标志物病原体核酸分子（DNA/RNA）基因表达产物代谢物免疫应答分子细胞免疫体液免疫TT致敏T细胞淋巴因子B浆细胞IgMIgGIgAIgDIgE感染早期出现临近恢复期出现与原虫和蠕虫感染有关第五页，共八十五页，编辑于2023年，星期六二、感染性疾病分子诊断的常用方法

根据目的基因是否被放大，可分为杂交法和扩增法。信号放大技术检测方法

靶分子数目不变，而检测的探针信号放大

采用多酶、多探针或二者结合等方法来增加探针标志物的浓度使检测信号得到放大。靶分子扩增技术检测方法

靶分子（RNA、DNA或探针）的扩增PCR、替代扩增、LCR等第六页，共八十五页，编辑于2023年，星期六引物A

靶RNA

引物B

RNAcDNA

RT

3'5'5'5'3'5'3'5'3'cDNA

cDNA模板

5'5'3'3'5'3'引物B

RNAseH

RT

T7RNA聚合酶

100-1000RNA扩增子5'3'5'3'3'5'3'5'引物A

3'5'5'RNAseH

RNA

RNA

cDNA

cDNA

图8-3NASBA原理示意图

引物A5’端带有T7RNA聚合酶结合位点，3’端碱基与靶RNA3’端序列互补;引物B的碱基序列与cDNA3’端序列互补第七页，共八十五页，编辑于2023年，星期六nucleicacidsequence-basedamplification(NASBA)第八页，共八十五页，编辑于2023年，星期六NASBA的特点为操作简便，不需特殊仪器，不需温度循环。整个反应过程由三种酶控制，循环次数少，忠实性高,其扩增效率高于PCR，特异性好。

第九页，共八十五页，编辑于2023年，星期六引物A

靶RNA

引物B

RNAcDNA

RT

3'5'5'5'3'5'3'5'3'cDNA

cDNA模板

5'5'3'3'5'3'引物B

RNAseH

RT

T7RNA聚合酶

100-1000RNA扩增子5'3'5'3'3'5'3'5'引物A

3'5'5'RNAseH

RNA

RNA

cDNA

cDNA

图8-3NASBA原理示意图

引物A5’端带有T7RNA聚合酶结合位点，3’端碱基与靶RNA3’端序列互补;引物B的碱基序列与cDNA3’端序列互补第十页，共八十五页，编辑于2023年，星期六nucleicacidsequence-basedamplification(NASBA)第十一页，共八十五页，编辑于2023年，星期六NASBA的特点为操作简便，不需特殊仪器，不需温度循环。整个反应过程由三种酶控制，循环次数少，忠实性高,其扩增效率高于PCR，特异性好。

第十二页，共八十五页，编辑于2023年，星期六三、感染性疾病分子诊断的标本处理标本采集处理主要包括选择合适的标本种类、标本量、抗凝剂等及对标本进行合适的传送、保存和预处理。第十三页，共八十五页，编辑于2023年，星期六四、感染性疾病分子诊断的结果解释1.阴性结果

假阴性可能性方法的灵敏度太低方法失败目标分子2.阳性结果

假阳性可能性方法的特异性受到污染第十四页，共八十五页，编辑于2023年，星期六3.定性检测结果

有时不能提供病原体活力相关信息临床治疗病情缓解后一定时间内，在患者样本中仍可以检测出相应的病原体。有些病原体潜伏在进体内，没有临床症状。4.疾病状况的判断

检测出病原体的存在并不能说此病原体就是引起疾病的直接原因。该病原体可能是一种正常菌群

第十五页，共八十五页，编辑于2023年，星期六五、感染性疾病分子诊断的临床应用及评价用于感染性疾病治疗的监控和预测、病情发展过程的危险性评价及疾病预后等。耐药性的检测细菌的分型流行病调查第十六页，共八十五页，编辑于2023年，星期六第一节病毒的基因检测人类许多感染疾病由病毒引起，如病毒性肝炎、脑炎、流行性感冒等等，占人类传染疾病的75%左右。400多种不同病毒。病毒结构：大小：20-300nm

核心区：核酸（DNA或RNA）外周衣壳：蛋白质包膜：脂质（镶嵌有蛋白质）第十七页，共八十五页，编辑于2023年，星期六

我国是HBV高流行区，50%－70%的人受过感染，8%－10%是HBV携带者，肝炎患者中60%是慢性肝炎患者，导致肝硬变，HBV又与原发性肝癌密切相关。外壳（HBsAg):外壳蛋白成分为表面抗原核心（HBcAg)：DNADNA聚合酶

HBcAg一、乙型肝炎病毒第十八页，共八十五页，编辑于2023年，星期六Dane颗粒（完整的病毒）形态HBsAgHBcAgHBVDNADNAPol（外膜蛋白）（核衣壳蛋白）完整的乙肝病毒颗粒直径42纳米由双层外壳和一个核心组成的，核心直径为27纳米，内含DNA双链和DNA多聚酶第十九页，共八十五页，编辑于2023年，星期六（一）病毒基因组结构3.2kb双链DNA病毒不完全双连环状DNA

长链L为负链：有4个开放阅读框S、C、P、XS区编码外膜蛋白（HBsAg）

C区编码HBeAg、HBcAgp区编码DNA聚合酶

X区位编码X蛋白，可能与病毒蛋白表达有关。

短链S为正链：长短不一第二十页，共八十五页，编辑于2023年，星期六pre-s1

pre-s2S

P

C

pre-c

XHBVDNA3.2kbpre-S1pre-S1蛋白pre-S2

pre-S2蛋白S

HBsAg

pre-C

HBeAg

C

HBcAgPDNAPX

HBxAgHBV基因组结构第二十一页，共八十五页，编辑于2023年，星期六HBV基因分型HBV基因序列差异的多少，可将HBV划分为不同的基因型，至今为止已发现A、B、C、D、E、F、G、H共8种基因型：A型主要存在于白人，B型和C型主要存在于亚洲人群E型主要存在于西非F型仅见于中南美洲的土著人G型和H型很少见不同基因型序列长度不同，主要是前S1区的不同。我国流行的主要是B和C基因型，长江以北以C型为主，长江以南以B型为主，另又少量的A型、D型和混合型。西北和西南尤其是西北有较高比例的D型第二十二页，共八十五页，编辑于2023年，星期六HBV在肝细胞内的复制A(n)mRNAcccDNAHBsAg

包膜负链DNA包裹后的前基因

mRNA传染性HBV病毒颗粒传染性HBV病毒颗粒部分双链DNA逆转录酶DNA聚合酶肝细胞第二十三页，共八十五页，编辑于2023年，星期六（二）分子诊断常用的免疫学检测方法，即二对半的检测存在窗口期，不易早期诊断。1.PCR

采用普通PCR、FQ-PCR、竞争性PCR、免疫杂交PCR，可提供直接、准确的病原学诊断证据。引物是根据S、C、P、X基因中高度保守序列设计，决定扩增的特异性和敏感度。第二十四页，共八十五页，编辑于2023年，星期六扩增位置引物序列扩增片断（bp)

P、X基因5’-ATACTGCGGAACTCCTAGC-3’2785’-CCGCGTAAAGAGAGGTGCG-3’

C基因5’-ATACCACAGAGTCTAGACTCGTGGTGGACT-3’4775’-AAGCCCTACGAACCACTGAACAAATGGCAC-3’

C基因5’-GCTTTGGGGCATGGACATTGACCCCTATAA-3’2585’-ATGGGATCCCTGGAATGCGGGTCTTCCAAA-3’

第二十五页，共八十五页，编辑于2023年，星期六

有时为了证实扩增产物的特异性，对扩增产物进行以下分析：

RLFP

斑点杂交

Southern杂交

第二十六页，共八十五页，编辑于2023年，星期六2.支链DNA信号放大技术(bDNA）原理:①捕获探针检测②靶探针1

体系③靶探针2④bDNA分子:DNA主链上结合多个侧链

第二十七页，共八十五页，编辑于2023年，星期六捕获探针固化在微孔板上靶探针1分别与捕获探针及待测核酸杂交靶探针2分别与待测核酸及bDNA杂交形成复合物：固相支持物捕获探针靶探针1CEs待测核酸靶探针2LEsbDNA复合物第二十八页，共八十五页，编辑于2023年，星期六分支链DNA信号放大技术(bDNA)第二十九页，共八十五页，编辑于2023年，星期六信号检测：bDNA可结合很多酶标探针，酶催化底物（1,2-二恶二酮，dioxetane）发光，使核酸信号放大，且发光强度与DNA量成正比。优点：放大倍数确定阳性检出率高稳定性和可重复性好操作简便，省时，易于普及第三十页，共八十五页，编辑于2023年，星期六3.基因芯片技术

标本经PCR扩增后与芯片上的特异探针进行杂交，可以检测：是否有病毒感染感染病毒的种类及亚型病毒的耐药情况特点：可同时进行大量标本的检测第三十一页，共八十五页，编辑于2023年，星期六近年来陆续上市的核苷(酸)类似物对HBV的治疗压力集中在P区。干扰素治疗对HBV的压力主要集中在前C/C区及前S区。HBV耐药突变lamivudineadefovirentecavirtelbivudine第三十二页，共八十五页，编辑于2023年，星期六YMDD

(酪氨酸-蛋氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸)

HBV对拉米夫定耐药是HBVDNA聚合酶突变所致。耐药基因位点(YMDD)位于聚合酶的C区(rtM2041或rtM204V)，分别是YMDD中的蛋氨酸(M)被异亮氨酸(I)或缬氨酸(V)所替代，形成YIDD或YVDD变异.拉米夫定作用靶位为HBVDNA聚合酶C区。有研究表明，拉米夫定与HBV逆转录酶的亲和力与位于第552位氨基酸侧链长度有关，异亮氨酸和缬氨酸取代蛋氨酸，使侧链氨基酸长度缩短，使逆转录酶dNTP结合区增大，不适于拉米夫定结合，从而诱发耐药性。第三十三页，共八十五页，编辑于2023年，星期六HBV耐药检测（YMDD突变检测方法）第三十四页，共八十五页，编辑于2023年，星期六YMDD突变检测方法1.基因测序法2.荧光定量PCR方法基本原理确定探针特定的TM值来区分是否突变常用方法覆盖突变位点荧光双探针杂交

YIDDYMDDYVDD46.91℃54.64℃50.74℃第三十五页，共八十五页，编辑于2023年，星期六（三）临床意义1.早期诊断免疫学检测敏感性：0.1µg/ml

核酸杂交检测敏感性：0.1pg/mlPCR检测：0.1fg/ml

因此，在感染早期即可通过DNA检测证实病毒的存在。第三十六页，共八十五页，编辑于2023年，星期六2.监测治疗效果:HBVDNA>107拷贝/ml提示病毒复制活跃；

HBVDNA＜104拷贝/ml治疗有一定疗效；

HBVDNA＜103拷贝/ml、HBeAg阴转、转氨酶正常为乙型肝炎临床治愈指标；3.判断病情，指导制定合理的治疗方案第三十七页，共八十五页，编辑于2023年，星期六4.病毒耐药性的检测乙肝病毒DNA聚合酶YMDD处的突变是病毒产生耐药性的重要原因，通过监测YMDD的突变情况，可以获得病毒耐药性方面的信息，指导抗病毒治疗。第三十八页，共八十五页，编辑于2023年，星期六二、流行性感冒病毒

流行性感冒病毒(Influenzavirus)，是引起流行性感冒的病原体;分为甲(A)、乙(B)和丙(C)3个型别;根据病毒颗粒表面血凝素(Haemagglutinin

，HA)和神经氨酸酶(Neuramiridase，NA)的抗原性，甲型流感病毒又可分为不同的亚型。甲型流感病毒易发生变异，致病力强，1918年发生在西方国家的大流感杀死了几千万人，即是由甲型流感病毒引起。

Thereare16differentH

antigens

(H1toH16)andninedifferentNantigens(N1toN9).第三十九页，共八十五页，编辑于2023年，星期六第四十页，共八十五页，编辑于2023年，星期六（一）流感病毒基因组结构

单链RNA病毒，RNA为负链；有8个RNA片段或7个RNA片段；所有RNA片段5’末端和3’末端高度保守；两种不同亚型病毒感染宿主时，会生成基因重配的新病毒；RNA基因在复制过程中常会发生点突变。

第四十一页，共八十五页，编辑于2023年，星期六（二）分子诊断方法

可采用RT-PCR、FQ-PCR检测流感病毒RNA。引物常按流感病毒保守的非结构基因（NS）的序列进行设计。为证实PCR扩增产物的特异性或提高检测的灵敏度，可用限制性内切酶分析法、斑点杂交法、Southern印迹法进行扩增产物的分析。

第四十二页，共八十五页，编辑于2023年，星期六扩增位置引物序列扩增片段大小NS基因

5’-AAGGGCTTTCACCGAAGAGG-3’190(bp)5’-CCCATTCTCATTACTGCTTC-3’

NS基因

5’-ATGGCCATCGGATCCTCAAC-3’241(bp)

5’-TGTCAGCTATTATGGAGCTG-3’

第四十三页，共八十五页，编辑于2023年，星期六（三）临床意义流感病毒的诊断过去主要靠鸡胚羊膜腔培养和血清学血凝抑制试验，这些方法比较费时，灵敏度低，难以作出早期诊断。

PCR法敏感、特异、简便、快速，并且可用于流感病毒的分型和流行病学调查。

第四十四页，共八十五页，编辑于2023年，星期六三.人类免疫缺陷病毒（HIV)HIV，humanimmunodeficiencyvirusAIDS，acquiredimmunodeficiencysyndromeHIV为艾滋病的病原体。现已发现引起艾滋病的病毒有HIV-1、HIV-2、HIV-3三种。1998年底艾滋病感染者和艾滋病患者总数为3.340万，已死亡1.390万，是全球十大主要死因之一。第四十五页，共八十五页，编辑于2023年，星期六最外层为囊膜，双层脂蛋白，是病毒识别攻击宿主细胞所必不可少的；其内为核衣壳。第四十六页，共八十五页，编辑于2023年，星期六第四十七页，共八十五页，编辑于2023年，星期六2.基因组结构逆转录病毒，两个拷贝的单股正链RNA；每个RNA长约9.7Kb，有5’帽，3’端有多聚尾；

HIV是一种高度变异的病毒；含有gag、env和pol三个基因以及6种调控基因tat,vif,vpr,vpx,nef,rev。

第四十八页，共八十五页，编辑于2023年，星期六①gag基因编码病毒的核心蛋白；②pol基因编码病毒复制所需要的酶类（逆转录酶、整合酶和蛋白酶）；③env基因所编码病毒包膜蛋白，是HIV免疫学诊断的主要检测抗原。④调控基因编码辅助蛋白，调节病毒蛋白合成和复制。

第四十九页，共八十五页，编辑于2023年，星期六（二）分子诊断方法抗体的检测：酶联免疫吸附法（ELISA）和免疫荧光检测法（IFA）；感染2周后才能逐渐产生病毒抗体；抗原的检测：酶联免疫吸附法（ELISA）检测P24抗原，灵敏度低第五十页，共八十五页，编辑于2023年，星期六1.病毒载量检测感染者体内HIV的定量检测，对病情判断和治疗效果检测极有价值。目前常用三种技术：

RT-PCR最低检测限50拷贝/mlbDNA最低价测限50拷贝/mlNASBA最低检测限20拷贝/ml第五十一页，共八十五页，编辑于2023年，星期六PCRRNA逆转录cDNA整合到宿主基因组中复制，以被感染细胞DNA为模板PCR扩增；

HIV为高变异病毒，不同患者体内分离的病毒基因结构有差异，引物设计应根据各编码区的保守序列设计；灵敏度高，特别是用于无症状HIV感染者。

第五十二页，共八十五页，编辑于2023年，星期六扩增位置引物序列扩增片断（bp)

gag基因5’-GAACTTTAAATGCATGGGTAAA-3’3425’-CCAGTAGGAGAAATCTATAAAA-3’

gap基因5’-ATAATCCACCTATCCCAGATAGGAGAAATC-3’1155’-TTTGGTCCTTGTCTTATGTCCAGAATCC-3’

pol基因5‘-TAGAATTCCTCAGATCACTCTT-3’3605’-GCAAGCTTATGGGCCATCCATTCC-3’

第五十三页，共八十五页，编辑于2023年，星期六2.病毒表型和耐药检测HIV表型主要依据逆转录酶和蛋白酶基因突变的检测最常用的耐药检测方法是基因型检测方法,即查找与病毒耐药有关的基因突变。检测病毒逆转录酶（RT）和蛋白酶（PI）基因的序列，然后把这些结果与已知的没有发生突变的HIV（称为野生株）基因序列进行比较，与之不同的基因序列就认为发生了突变。检测出的任何突变都有可能导致形成HIV耐药性，但具体结果的解释必须要有非常有经验的专家和医师来进行。第五十四页，共八十五页，编辑于2023年，星期六（三）临床意义1.原位杂交：可以显示病毒感染的部位；2.PCR：可对无症状的感染者进行早期诊断；3.病毒载量检测：在临床进展情况的判定及疗效观察上极有价值。第五十五页，共八十五页，编辑于2023年，星期六第九章：细菌感染的分子生物学检验概述正常菌群：存在于人体表及与外界相通部位的细菌；条件致病菌：正常菌群与人体平衡破坏，引起疾病的一类细菌；病原菌：具有毒性和侵袭力的细菌，造成人体感染；第五十六页，共八十五页，编辑于2023年，星期六病原菌的诊断方法：①直接涂片法②生化试验③血清学试验④分离培养⑤动物实验⑥分子生物学：灵敏、特异，可进行早期诊断、分型、耐药性检测；不能确诊或进行分型、耐药性的检测，或费时等第五十七页，共八十五页，编辑于2023年，星期六

全世界1/5人口感染，每年约300万死于结核，中国占70%，免疫低下个体特别是HIV感染者更易于感染结核分枝杆菌。结核分枝杆菌为革兰氏阳性菌，细长略带弯曲，分枝状，有荚膜，抗酸染色阳性，对多种抗生素有抵抗力。一.结核分枝杆菌第五十八页，共八十五页，编辑于2023年，星期六形态

第五十九页，共八十五页，编辑于2023年，星期六(一)基因组结构

1.TBH37Rv株基因组是环状双链DNA，共有4411529bp;2.共有4033基因，功能已知的有1734个,1694个可能为新基因;3.基因组中有许多药物抗性因子的编码序列，包括水解酶或者药物修饰酶。

第六十页，共八十五页，编辑于2023年，星期六第六十一页，共八十五页，编辑于2023年，星期六第六十二页，共八十五页，编辑于2023年，星期六（二）分子诊断方法

普通PCR、FQ-PCR、竞争性PCR、免疫杂交PCR

扩增靶序列：

65KDa抗原基因（细菌细胞壁上蛋白）

MPB蛋白基因（结核杆菌复合群特有）

rRNA基因（种属鉴定）

ISDNA6110插入序列第六十三页，共八十五页，编辑于2023年，星期六靶序列引物序列扩增片断（bp）

IS6110插入5‘-CCTGCGAGCGTAGGCGTCGG-3’3175’-TCAGCCGCGTCCACGCCGCCA-3’

16SrRNA5’-GGTGGTTTGTCGCGTTGTTC-3’4635’-TGCACACAGGCCACAAGGGA-3’

DNA重复序列5’-CGTGAGGGCATCGAGGTGGC-3’2455’-GCGTAGGCGTCGGTGACAAA-3’

第六十四页，共八十五页，编辑于2023年，星期六TB耐药检测利福平耐药-RNA聚合酶rpoB基因异烟肼耐药-katG基因链霉素耐药-S12的rpsL基因

16SrRNA的rrs基因喹诺酮的耐药-DNA解旋酶的gyrA和gyrB基因水解酶或药物修饰酶（β-内酰胺酶、氨基糖苷乙酰基转移酶和药物外排系统等）第六十五页，共八十五页，编辑于2023年，星期六细菌耐药基因的检测

细菌耐药性的产生导致治疗失败、感染复发、增加昂贵抗生素的使用。机理：由于细菌基因组的变异，导致

1.细菌细胞外膜通透性改变；

2.产生灭活酶和钝化酶，如-内酰胺酶；

3.药物作用靶位改变；

4.代谢途径改变；第六十六页，共八十五页，编辑于2023年，星期六（三）临床意义1.准确、快速、早期诊断TB2.区分TB与其它分枝杆菌3.疫情监控和抗痨治疗疗效的评价

第六十七页，共八十五页，编辑于2023年，星期六二、淋球菌

淋球菌是淋病的病原菌，人是淋球菌的唯一自然宿主。淋病在我国性传播疾病种中，发病率居首位。淋球菌耐药菌株的出现和流行对淋病的控制带来很大困难。传播途径：1.直接性接触感染

2.间接接触感染

第六十八页，共八十五页，编辑于2023年，星期六第六十九页，共八十五页，编辑于2023年，星期六（一）基因组结构

1.染色体分子量980M，可编码约5000个基因，GC含量为50%；

2.无操纵子结构

3.含有1至数个质粒（2.6MDa，24.5MDa），通过质粒介导耐药性在不同菌株间的转移；

第七十页，共八十五页，编辑于2023年，星期六第七十一页，共八十五页，编辑于2023年，星期六（二）分子诊断1.PCR:

扩增的靶序列：编码外膜蛋白Ⅲ的结构基因，或16SrRNA基因、CPPB基因（同时存在于染色体及质粒上）

第七十二页，共八十五页，编辑于2023年，星期六靶序列引物序列扩增片断（bp）

CPPB基因5’-GTTTGGCTGGTTGATTCAAG-3’6335’-GCAAGATTTCCGATTTGGCG-3’

外膜蛋白Ⅲ5’-TAAAGCAAGCCAAGGTCGCG-3’4945’-TTTTCACATCTACGCGGCGG-3’

5’-CCGAAGCTCAAGACAACCTC-3’

181第七十三页，共八十五页，编辑于2023年，星期六2.LCR（Ligasechainreaction

）连接酶链反应(Ligasechainreaction，LCR)，是一种新的DNA体外扩增和检测技术，主要用于点突变的研究及靶基因的扩增.

第七十四页，共八十五页，编辑于2023年，星期六原理：在PCR反应体系中加入二对引物，加热(94～95℃)使DNA变性，双链打开，然后降温退火(65℃)，引物与模板DNA结合并留下一缺口，如果引物与模板完全互补，DNA连接酶即连接封闭缺口，PCR反应接着进行，扩增出大量的目标DNA.若有点突变，引物不能与模板精确结合，缺口附近核苷酸的空间结构发生变化，连接酶不能封闭缺口，PCR反应不能进行，无扩增产物生成，据此可判断模板DNA中有无突变.第七十五页，共八十五页，编辑于2023年，星期六第七十六页，共八十五页，编辑于2023年，星期六（三）临床意义

1.分子诊断技术具有灵敏性高、快速、特异性好的优点，可检测极微量的淋球菌。2.应用于以下几方面：对菌株进行分型和耐药性分析。抗生素治疗效果的观察。进行流行病学分析。对疑似病例的诊断和鉴别诊断。第七十七页，共八十五页，编辑于2023年，星期六