第三代测序技术简介

第三代测序技术简介z2011-09-2517:27:45|分类：Biology|标签：|字号大中小订阅如果有人告诉你用显微镜实时观测单分子DNA聚合酶复制DNA,并用它来测序，你一定会认为他异想天开，没有一点生物的sense。我最初就是这样认为的，然而它不仅可以实现，而且已经实现了！这个就是被称为第三代的测序技术，PacificBiosciences公司推出的“SingleMoleculeRealTime（SMRT?）DNASequencing"（单分子实时DNA测序）。我有幸在NIH听到了这个技术发明人StephenTurner博士的讲座，根据自己粗浅的理解记录整理一下。要实现单分子实时测序，有三个关键的技术。第一个是荧光标记的脱氧核苷酸。显微镜现在再厉害，也不可能真的实时看到“单分子”。但是它可以实时记录荧光的强度变化。当荧光标记的脱氧核苷酸被掺入DNA链的时候，它的荧光就同时能在DNA链上探测到。当它与DNA链形成化学键的时候，它的荧光基团就被DNA聚合酶切除，荧光消失。这种荧光标记的脱氧核苷酸不会影响DNA聚合酶的活性，并且在荧光被切除之后，合成的DNA链和天然的DNA链完全一样。第二个是纳米微孔。因为在显微镜实时记录DNA链上的荧光的时候，DNA链周围的众多的荧光标记的脱氧核苷酸形成了非常强大的荧光背景。这种强大的荧光背景使单分子的荧光探测成为不可能。PacificBiosciences公司发明了一种直径只有几十纳米的纳米孔［zero-modewaveguides（ZMWs）］,单分子的DNA聚合酶被固定在这个孔内。在这么小的孔内，DNA链周围的荧光标记的脱氧核苷酸有限，而且由于A，T，C，G这四种荧光标记的脱氧核苷酸非常快速地从外面进入到孔内又出去，它们形成了非常稳定的背景荧光信号。而当某一种荧光标记的脱氧核苷酸被掺入到DNA链时，这种特定颜色的荧光会持续一小段时间，直到新的化学键形成，荧光基团被DNA聚合酶切除为止（见图）。第三个是共聚焦显微镜实时地快速地对集成在板上的无数的纳米小孔同时进行记录。由于我对显微原理的物理知识匮乏，而

PacificBiosciences公司又没有非常强调在这方面的发明，不做进一步探讨。他们还对这一技术进行进一步的优化。第一个是把双链DNA环化反复测序。人们可以在双链DNA的两头连上发夹结构的DNAadaptor，从而使DNA环化。而DNA聚合酶就能够以环化的DNA作为模板滚环复制，反复测一段DNA序列。这种反复测序，纠正了偶尔出现的复制错误，从而使测序精度非常高。第二个是激发光中断测序法。DNA聚合酶虽然很稳定，但是在强大的激发光作用下酶也是有一定寿命的。如果把激发光中断一段时间，在这段时间内DNA聚合酶继续复制DNA，当激发光重新开启以后，人们就可以测到长DNA链后面的序列。第三代测序技术非常可怕。1、它实现了DNA聚合酶内在自身的反应速度，一秒可以测10个碱基，测序速度是化学法测序的2

万倍。2、它实现了DNA聚合酶内在自身的processivity（延续性，也就是DNA聚合酶一次可以合成很长的片段），一个反应

就可以测非常长的序列。二代测序现在可以测到上百个碱基，但是三代测序现在就可以测几千个碱基。这为基因组的重复序列

的拼接提供了非常好的条件。3、它的精度非常高，达到99.9999%。此外，它还有两个应用是二代测序所不具备的。第一个是直接测RNA的序列。既然DNA聚合酶能够实时观测，那么以RNA为模板复制DNA的逆转录酶也同样可以。RNA的

直接测序，将大大降低体外逆转录产生的系统误差。第二个是直接测甲基化的DNA序列。实际上DNA聚合酶复制A、T、C、G的速度是不一样的。正常的C或者甲基化的C为模板，DNA聚合酶停顿的时间不同。根据这个不同的时间，可以判断模板的C是否甲基化。PacificBiosciences公司预计2010年或者2011年就会推出商业化的测序仪器。在不远的将来，如果他们能和二代测序一样集成100万个纳米微孔，那么一台仪器15分钟就能够准确地测出一个人的基因组。以后每个人的基因组测序成本将变成100美元，人人都可以消费得起。想想人类基因组计划耗资30亿美元，费时十几年，无数科学家参与其中，技术的革新意义是多么重大啊！介绍完三代测序技术之后，请允许我贩卖点私货：1、 创新创新再创新。国内多数导师为了掩饰自己idea的匮乏，极力压制学生的冒险欲望，鼓励学生对一个小的问题花无数的时间用data堆成文章。其实想做真正有挑战性的课题的想法是非常可贵的，导师一个很重要的功能是帮助学生评估他们想法的可行性，在可行的情况下尽量提供条件让他们自己去闯。从想做真正科研的学生的角度来说，让那些不能激动你的保险课题见鬼去吧，花大力气去寻找一些真正能贡献科学，贡献社会的课题，不要害怕一时的挫折，这是科研的真意！2、 不要鄙视公司。有很多人以为学院派的科研是最好的，其实真正推动科学进步的绝不仅仅是发生在学校和研究所的科研。公司同样能做非常令人晕眩的研究，经济意义，社会效益有时候恐怕远甚于学院派研究。美国的许多应用研究就是在公司里面完成的。3、 学科交叉。紧咬你的可贵想法，然后横跨各个学科，自己学或者寻合作者。光是生物背景，想要发明第三代测序技术，那就是个笑话。三代DNA测序技术的基本技术原理z2011-09-2517:15:42|分类：Biology|标签：|字号大中小订阅本文引用自xue19870214《二代dna测序技术的基本技术原理》第一代测序技术是双脱氧链末端终止法—一根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，生A，T，C，G四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得）NA序列。自上世纪90年代初，所有的DNA测序操作几乎无一例外地全部采用半自动化毛细管电泳Sanger测序法。而后来出现的高通量测序方法则首先采用以下两种方法中的一种DNA进行预处理。就1时口阳进行枝处理的两种方法此法也可见干队展测但的乌枪注（that^un navaMquanEingJ,艮」羌将大置烦机切物产生的命上小令子"段完暖到度捉贝数隹牡〔牌松池巨隹牡；=.（5后再治这坚隹粒月干K膀杆前琴化*此注是在时特定序列进行耳次测佐时堕月的方法.引蔬用谟待定停列的特#31构进行PCR打坷.m无论采用以上哪种方法处理后，我们均可以得到大量的待测序模板片一质粒或PCR产物。随后，测序仪会进行循环测序”反应。在每一轮测序反应的引物延伸步骤中，会随机引入已被四种不同颜色荧光分别标记的dNTP（ddATP、ddTTP、ddGTP、ddCTP）以终止延伸反应。这样就形成了大量末端被荧光标记的、长短不一（终止位点不同）的延伸产物。接着，再用高分辨率的毛细管凝胶电泳分离这些延伸产物，通过对延伸产物末端四种不同荧光颜色的区分，计算机软件会自蜀读出”DNA序列。不过，该方法在读取'每一个碱基信息时都有可能出错。后续操作中，比如基因组组装或者找出变异位点等就是具体情况具体解决了。一般，这种高通量测序仪一次最多只能同时进行个或384个样品测序。SangerDNA测序技术经过了30年的不断发展与完善，现在已经可以对长达1,000bp的DNA片段进行测序了，而且对每一个碱基的读取准确率高

达99.999%。在高通量基因组鸟枪法测序操作当中，使慰anger测序法的费用大约为0.5美元/1,000个碱基。原文检索：JayShendure&HanleeJi.(2008)Next-generationDNAsequencingitureBiotechnologj26(10):1135-1145.在第一台全自动测序仪出现之前使用最为广泛的测序方法就是Sanger在20世纪70年代中期发明的末端终止法测序技术Sanger也因此获得1980年的诺贝尔化学奖5］.他的发明第一次为科研人员开启了深入研究生命遗传密码的大门第二代测序技术是焦磷酸测序*一由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应，适于对已知的短序列的测序分析。3 口3 口N夫分卫岷尾机切用成y片船b DN快分子杨随机切粕成小片段制成pcilony芯片¥...右拓制成pcilony芯片¥...右拓WGA饱CG焰CGHSA…占模槌5—、QTGAT i□引翎...CTGArtl-..CTGATCTA-^-...CTGiffCTAT理目习..CTGArCWfiCI七九dNTP£-..CTGATCW<3CTC：.荧元标记的ddNTP■■CTG^GWCCTCG^芯H侑辑湫声［每个芯片可以获得长壹卜过芯H侑辑湫声［每个芯片可以获得长壹卜过I；叩的序舛〔苍叛地泌读聚一吊诚基悟息)H-AMAAAS(1Tr^-.F«3算三括耳基是付幻密：专快凯Ssfm,温泮活&一代口NA：,.存疫术工停流程函，沱，S31S^S^3e-7-.iS.百无戛因由口NU蚯的匚可*..弓小片段分于-些薯盘务小片祈口村点喧克孕人商贮此■4；6=町^柬.大表料函中.最后落养大场轩葫!1取屈桂.既行跚序.桩一个凋序反应用在只有凡械丹的反应炸系中芫吸.■:.•.序后麻遗一抵灵任盾不一此京村咤.•己与荧光皂忙成盘走酒乏克堑一个姑％互五产tt末点艾光虹至里行技兄来■取DNA序孑..鸟些"歹芯.=.如W活.百立挥堇因距CINAT厂只笔W小甘氐DNA分子标后在这些小片WD!^.升子佻末戒长果上有沔礼生乂簸后用嬉也小片版DbP■分于乏.茗技。的西片.垂一个M-.-y1=t：^=-个小片云UM%分子EC*务个喝里.停S这栏Mb。”集曾在一袒叨再石了芯户.这拦一次二序厘古学苛以向厂穴立弟的k■凸方蹴气噩.手.户运与mv：::亍流中一斥酒迂互至一个芷监反底卢格末f艾光敬古洼斤沮二来添我土UMA净歹..S3［上述那用气就我用完服三序完“polony芯片(Polonyisacontractionof"polymerasecolony,"asmallcolonyofDNA.):该方法是由瑞士日内瓦雪兰诺制药研究中心的EricKawashima俄罗斯科学院的AlexanderChetverin和当时在美国哈佛大学的密特拉共同开发的。他们制作出了可排列在载玻片或凝胶分子层上的一个个独立的聚合酶群落，成为polony，每一个聚合酶群落里都含有一个DNA模板分子，通过PCR反应就可以获得大量的模板。这些扩增后的聚合酶群落就像菌落一样一个个散布在载玻片或凝胶分子层上，成polony芯片。每一个polony直径约为1pm，一个芯片上可以承载数十亿个聚合酶群落(即“高通量性”)。两代测序方法，测序序列都是在荧光或者化学发光物质的协助下，通过读取NA聚合酶或DNA连接酶将碱基连接到DNA链上过程中释放出的光学信号而间接确定的，除了需要昂贵的光学监测系统还要记录、存储并分析大量的光学图像，这都使仪器的复杂性和成本增加，依赖生物化学反应读取碱基序列更增加了试剂、耗材的使用。JayShendure&HanleeJi.(2008)Next-generationDNAsequencing.NatureBiotechnology,26(10):1135-1145.JonathanMRothberg&JohnHLeamon.(2008)ThedeVopmentandimpactof454sequencing.NatureBiotechnology,26(10):1117-1124.而第三代测序技术则是基于纳米孔的单分子读取技术，这种方法读取数据更快、有望大大降低测序成本，改变个人医疗的前景。第三代测序技术的基本原理是新型纳米孔测序法(nanoporesequencing，它采用电泳技术，借助电泳驱动单个分子逐一通过纳米孔来实现测序的。由于纳米孔的直径非常细小，仅允许单个核酸聚合物通过，因而可以在此基础上使用多种方法来进行高通量检测。此外，纳米级别的孔径保证了检测具有良好的持续性，所以测序的准确度非常高。对于长达,000个碱基的单链DNA分子、RNA分子或者更短的核酸分子而言，根本无需进行扩增或标记就可以使用纳米孔测序法进行检测，这使得便宜、快速地进彳DNA测序成为可能。如果对现有纳米孔测序法进行进一步发展和改进，那么它将有望成为第三代测序技术(也可称为下、下一代测序技术)，从而帮助人们实现4小时内只花费1,000美元完成二倍体哺乳动物基因组测序这一目标。如果纳米孔测序技术能够成功，那么它将是非常好的一种新的测序技术，因为它具有以下优点品准备极其简单；不需要借助碱基、多聚酶、连接酶等就能进行测序，而且测序的长度可以达到0,000~50,000nt因此，一个成功的纳米孔测序仪其测序费用应该非常低廉，极有可能达到H设定的只用1,000美元就能完成个人基因组测序的目标。同时纳米孔测序仪本身不会太贵。如果能在一个测序芯片上整合00个纳米孔以及相应的微流体系统和电子探针系统，那么对一个人类基因组进行六倍覆盖率的测序也只需要一天的时间。不过，纳米孔测序技术还是面临着很大的问:如，如何减慢DNA通过纳米孔的速度，使每一个碱基通过纳米孔的时间从微秒级上升至毫秒级