免疫组化染色质量控制在鼻咽组织切片中的应用

免疫组化染色质量控制在鼻咽组织切片中的应用

鼻咽组织;免疫组织化学;标准化;质量控制

QualityControlofImmunohistochemicalStainiginSliceofNasopharynxTissues

Abstract：ObjectiveToestablishastandardempiricalprocessofimmunohistochemicalstainingandslicemakingofnasopharynxtissuescateringtotherequirementforpathologicaldiagnosisandresearchintheIntroducingthemethodsofimmunohistochemicalstainingandslicemakingofnasopharynxtissuesaswellasthelinkofqualitycontrolindetail.ResultsTheresultsshownthatmethodhasthreefeatures:stableandreliable,strongspecificity，andhighsensitivity.ConclusionThismethodcanimprovethequalityofimmunohistochemicalstainingofnasopharynxtissue.

Keywords:Nasopharynxtissue;Immunohistochemistry;Qualitycontrol

鼻咽癌是我国华南地区常见的恶性肿瘤之一，其发生的病因、发病机制以及发生发展也是我们广东医学院病理学教研室一直关注和研究的课题。由于鼻咽组织活检时不易大量取材，且组织中淋巴细胞较多，组织质地较脆，石蜡切片常出现组织碎裂、染色发白、模糊不清、细胞固缩等现象，另外淋巴细胞、网状细胞表面上的Fc受体及一些反应性淋巴细胞干扰免疫组化的结果，导致制作满意的鼻咽组织石蜡切片及其免疫组化染色较为困难，继而影响病理诊断及后续的科研工作。为此，我们摸索自己实验室的工作条件及各种抗体最佳的实验条件来制定标准化实验流程，稳定鼻咽组织石蜡切片及其免疫组化染色的质量，现报道如下。

1材料与方法

1．1材料来自广东医学院附属医院临床送检的鼻咽标本。

1．2主要仪器轮转切片机(德国,Leica)、家用高压锅(广州)。

1．3主要试剂p53、PCNA、Ecadherin等鼠抗人单克隆抗体、多克隆抗体及免疫组化染色SP试剂盒、浓缩型DAB试剂盒、抗体稀释液均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1．4组织切片的制备鼻咽组织离体时立即用生理盐水轻轻洗去组织上的血液及黏液,随后即用4%中性缓冲甲醛液固定,并及时送病理科作进一步处理。4%中性缓冲甲醛液固定不宜超过18h。脱水从低浓度乙醇到高浓度乙醇梯度脱水,级差以10%为宜，一般从60%乙醇开始30min,70%乙醇30min,80%乙醇25min,95%乙醇25min,无水乙醇Ⅰ20min,无水乙醇Ⅱ20min;二甲苯Ⅰ10min,二甲苯Ⅱ10min;58℃石蜡浸蜡，期间最好更换1次，浸蜡3h后60℃石蜡包埋制成蜡块。一次性刀片进行切片，切片厚度为2μm～3μm,40℃以下水温展片,65℃温箱烤片1h～4h。

1．5免疫组化染色方法切片烤片后脱蜡至水，然后蒸馏水洗两次，高压锅内放约5cm深的自来水，大火加热至沸腾，再将柠檬酸盐缓冲液(200ml～400mlpH)倒入搪瓷杯中，把切片置于耐高温塑料切片架上放入盛有缓冲液的搪瓷杯中，盖上锅盖，扣上压力阀，继续中火加热至喷气，从喷气开始记时1min后，压力锅离开火源，冷却至室温(稍冷后,可在自来水龙头下流水加速冷却)，取出切片，先用蒸馏水冲洗两次之后用PBS(pH～)冲洗，余下按免疫组化步骤选择不同的抗体进行染色。

2结果

鼻咽切片组织无收缩、开裂，组织结构、细胞形态清晰，鼻咽癌癌细胞及各种炎症细胞能清晰辨认，HE染色鲜艳，细胞核呈鲜明的蓝色,细胞质被伊红染成深浅不同的粉红色、桃红色，核仁呈红色，对比度良好(见图1)。免疫组化染色结果为病变组织结构完整、无脱片现象，阳性与阴性对比明显，阳性物质定位准确；背景干净、清晰，无非特异性着色(图2),组织结构与细胞轮廓完整、清晰，染色结果稳定可靠、敏感性高、特异性强、细胞核呈蓝色、适合显微照相等。

图1鼻咽癌组织(HE400)

图2Ecadherin在鼻咽慢性炎上皮的强阳性表达(SP400)

3讨论

免疫组织化学由于其具有的复杂性，在技术应用过程中存在不少问题，直接或间接地影响了最终的病理诊断，应予以重视以下几方面，才能从总体上保证鼻咽组织免疫组化染色的质量。

制作优质石蜡切片是做好鼻咽组织免疫组化染色的基础取材时鼻咽组织上的血液及黏液将影响固定液的渗透和干扰免疫组化染色的结果，而且鼻咽组织由于组织中淋巴细胞比较丰富和致密，间质成分较少是难以制作优质石蜡切片的主要原因，所以组织固定的好坏是影响免疫组化结果的关键因素。因此有条件时，鼻咽组织离体时立即用生理盐水洗去组织上的血液和黏液，并用4%中性缓冲甲醛液固定；或者用4%中性缓冲甲醛液固定后及时送病理科做进一步处理：即轻轻晃动瓶内固定液,利用原有固定液洗去鼻咽组织上的血液及黏液,再换一次4%中性缓冲甲醛液固定。乙醇脱水尽可能从较低浓度起始，以免组织过度收缩。常温下二甲苯透明时间≤30min，不然组织变脆。制片严格按操作程序进行，否则是免疫组化产生假阳性、假阴性或脱片的主要原因。

鼻咽组织蜡块的管理因为要考虑患者的经济负担，经病理确诊后的病例做免疫组化染色不普遍，鼻咽组织做免疫组化染色绝大部分是教师或研究生的研究课题需要。为了档案资料的齐全和避免医疗纠纷，＜2mm组织的蜡块一般不允许再切片。教师或研究生选择做免疫组化的鼻咽组织蜡块要通过观察HE染色切片的组织形态的基础上来决定，根据诊断来选择，不要选择组织坏死和出血多的蜡块，所有需要做免疫组化的鼻咽组织切片均由有经验的专业技术员切片，以防组织蜡块切削过多。切片完毕后组织蜡块要及时封蜡归档，力求科研工作有延续性和档案资料的完整性。

免疫组化切片的质量控制要求免疫组化染色使用的玻片必须用饱和的重铬酸钾浓硫酸液浸泡3d以上，捞出后用自来水彻底清洗干净，再经95%乙醇过一遍，晾干后涂防脱片剂烘干备用。裱片时切片片膜不能留有气泡，烤片时温度过低、时间过短，则易脱片，温度过高、时间过长则对抗原有破坏，烤片后用专用二甲苯、乙醇脱蜡至水洗，脱蜡要彻底。我们曾采用微波加热等方法进行抗原修复，但效果不如高温高压抗原修复法理想。另外高温高压加热时间的长短很重要，从组织切片放入缓冲液到高压锅离开火源的总时间控制在3min内，时间过长，可能会使染色背景加深。柠檬酸缓冲液不能重复使用，且容量必须保证所有切片都能浸泡到，整个染色过程不要让切片干涸。显色在镜下控制，时间约3min～7min，在阳性明确的部位着淡黄色即终止显色，此时显色程度较佳，能有效地避免背景着色。苏木素复染后要充分返蓝，否则背景呈紫红色(见图3)。

图3苏木素复染未充分返蓝、背景呈紫红色

增强特异性着色、降低非特异性染色是免疫组化的质量保证抗体是免疫组织化学最核心的试剂，其质量直接影响免疫组织化学的结果判断继而影响诊断，由于鼻咽组织中的淋巴细胞、网状细胞会产生非特异性染色。因此要选择特异性强、效价高的一抗，新购进的抗体储存在4℃冰箱并进行预实验，摸索出最佳实验条件。抗体的稀释包括特异性一抗、中间联结抗体及标记抗体，其稀释度与抗体的浓度、质量及有效期、孵育时间和采用的方法等。防止失效的抗体进入实验室，此外要选择病变典型的做免疫组化染色对照，一定要每一批免疫组化均设有已知阳性对照和用PBS代替一抗的空白对照。

免疫组织化学结果的判读结果的判断免疫组化切片应是阳性标记强而非特异性染色淡或无,两者形成鲜明的对比,阳性表达必须在细胞或组织特定的部位,细胞边界清楚;每批染色都要有阳性对照、阴性对照和自身对照才能对染色结果作出正确判断。判断标准常根据阳性细胞的百分比或阳性细胞的染色深度来判断,其颜色深浅反映抗原量的多少。免疫组化染色结果还要结合组织形态学判断是真正的阳性染色而非其他着色。阳性反应分布总是有规律、局限、定位准确和一定形态特征的,如细胞膜着色呈圆形;典型的细胞核着色为均质状,核仁和染色质呈颗粒状着色。

免疫组织化学阳性库的建立为了保证阳性对照的可靠性，在日常工作中要收集各种抗原的阳性组织和阳性切片，逐步建立阳性对照切片库及相应的电子档案库。如预期结果为阴性或病理形态诊断与免疫组化结果相反时，必须要有阳性对照才能作出正确的病理诊断，阳性对照能说明染色技术和阴性结果的可靠性，不是由于标本处理不当导致的抗原丧失、方法错误、技术不熟练等造成的假阴性。鼻咽组织免