流式细胞技术基本原理及应用

流式细胞仪基本原理及应用

——检测标准化，结果更准确，操作更简单当前第1页\共有85页\编于星期四\2点

提纲BeckmanCoulter公司介绍流式细胞技术基本原理FC500全自动分析型流式细胞仪介绍Gallios十色分析型流式细胞仪流式细胞技术科研应用当前第2页\共有85页\编于星期四\2点Dr.Beckman于1935年创立Beckman公司Coulter兄弟于1958年创立Coulter公司1997年两大公司合并为BeckmanCoulter一直致力于为生命科学研究提供全套的解决方案，产品涵盖临床诊断和生物医学的多个领域，包括临床生化、血凝/血球、实验室自动化、离心机、流式细胞产品、基因组学、蛋白质组学、颗粒特性分析等20多万台仪器设备在全球130多个国家地区的医院和科研院所高效运转年销售额超40亿美金，被财富杂志评为“最值得钦佩的公司”之一名列全球福布斯500强BeckmanCoulter公司介绍当前第3页\共有85页\编于星期四\2点BeckmanCoulter：世界上最主要的高端流式细胞仪技术制造商当前第4页\共有85页\编于星期四\2点贝克曼库尔特细胞组学产品线Z1/Z2细胞分析计数仪Vicell全自动细胞活力分析系统4色数字化分析型流式EpcisXL5色数字化分析型流式FC500EPICSALTRA™分选Gallios™科研型MoFloXDP高端分选MoFloAstrios高端分选QuantaSC（2007）临床型NaviosCyAnADP（科研型）1990200520092009年12月份上市当前第5页\共有85页\编于星期四\2点流式细胞技术基本原理

当前第6页\共有85页\编于星期四\2点WhatisFlowCytometry？流式细胞技术(FlowCytometry,FCM)是利用流式细胞仪对处于快速流动的细胞或生物颗粒进行多参数、快速的定量分析及分选的技术。它结合了单克隆抗体技术、激光技术、计算机技术、细胞化学和免疫化学技术。当前第7页\共有85页\编于星期四\2点FCM的技术特点测量速度快以单一细胞为分析基础多参数测量统计学意义高分辨率(CV<2%)、高灵敏度(荧光检测灵敏度≤100MESF（MoleculesofEquivalentSolubleFluorochrome），前向角散射光检测灵敏度(0.2∼0.5µm)分选纯度可达99%以上当前第8页\共有85页\编于星期四\2点细胞的相对大小（FSC-ForwardScatter）细胞的相对颗粒度和内部复杂度（SSC-SideScatter）细胞的相对荧光强度WhatCanaFlowCytometer

TellUsAboutaCell?当前第9页\共有85页\编于星期四\2点FC500流式细胞仪的检测范围细胞结构细胞大小细胞粒度细胞表面面积核浆比例DNA含量与细胞周期RNA含量蛋白质含量细胞功能细胞表面/胞浆/核的特异性抗原细胞活性细胞内细胞因子酶活性激素结合位点细胞受体当前第10页\共有85页\编于星期四\2点流式细胞仪是细胞组学的定量工具可以做以下定量：细胞相对定量（％）细胞绝对定量（细胞/µl）细胞膜蛋白表达定量（蛋白分子/细胞）可溶性蛋白绝对定量（g/ml）当前第11页\共有85页\编于星期四\2点荣获国际工业设计大奖和质量最高奖，得到国际公认获得FDA和中国SDA认证，安全性和结果可靠性得到肯定全自动5色流式细胞仪Cytomics™FC500FlowCytometer先进的光路设计高分辨20Bit数字化电子系统丰富灵活的进样系统基于Windows界面的高度人性化软件当前第12页\共有85页\编于星期四\2点FC500Flowcytometry的基本结构流路：

流动室鞘液sheath

样本流sample光路：

光源

光学收集系统电路：

光电倍增管(PMT)、光电二极管、放大器（线性、对数）

A/D转换（光信号转换为电信号之后的处理分析道数和电信号的脉冲转换）统计：计算机软件当前第13页\共有85页\编于星期四\2点流路流动室侧向及荧光信号前向散射光信号鞘液激光

样品管、鞘液管和流动室等由于鞘液的作用，待测细胞被限制在液流的轴线上——流体动力学聚焦当前第14页\共有85页\编于星期四\2点FC500的光源和光路先进的单激光激发5色系统单激光就能激发5色荧光20mW@488nmBlueair-cooledargon(氩离子激光)单激光同时激发5色荧光，确保信号来源于同一个细胞，结果准确可靠其它公司同档机器单激光只能激发4色，第5色需要安装第二根激光激发。由于有两个检测点，在鞘液压力变化、样品浓度、样品大小不均、转换采样速度时不能确保信号来源于同一个细胞而是两个细胞，信号收集发生错误当前第15页\共有85页\编于星期四\2点

双激光排列方式：共线性排列（只有一个检测点）FC500的光源和光路488nm激光633nm激光双激光共线性：信号来源于一个检测点当前第16页\共有85页\编于星期四\2点散射光测量原理RightAngleLightDetector

CellComplexitySSCForwardLightDetector

CellSurfaceArea

FSCIncidentLightSourceFSCSensorLaserSSCSensor当前第17页\共有85页\编于星期四\2点散射光的性质

波长与入射光一致，为细胞固有的物理及生理特性，可依此对未染色的细胞进行分析

--前向散射光(FSC):与细胞大小有关

--侧向散射光(SSC):与细胞内部的结构及颗粒性有关。SCFS外周全血细胞散射光双参数点图

（红细胞溶解后）当前第18页\共有85页\编于星期四\2点FC500提供两种检测角度的前向角散射光，更好通过大小区分不同细胞当前第19页\共有85页\编于星期四\2点荧光信号检测原理520nmFSCSensorLaserFluorescenceSensorPMT(FL)当前第20页\共有85页\编于星期四\2点

ATOM荧光素及荧光发生机理简介当前第21页\共有85页\编于星期四\2点FITC荧光素的激发和发射光谱Ex

488nmEm520nm异硫氰酸荧光素（FITC）每种荧光染料均有特定的激发波长,并激发后会有发射波长,流式细胞仪检测的即是它特定的发射波长.利用各种不同波长的光学滤片来收集(检测)这些光学信号当前第22页\共有85页\编于星期四\2点FC500流式常用荧光染料violetbluegreenyelloworangeredinfra-FITC520PE575ECD615PC5665LASER488PI620400-450l450-500l500-570l570-590l<390l590-620l620-750l>750lPC7770荧光素的使用：选择正确的激光器确定正确的滤光片确定所需荧光探测器（PMT）当前第23页\共有85页\编于星期四\2点LONG(700nm)(550LP)(550SP)SHORT(500nm)DichroicFiltersTransmitted<550nm>550nmDiflected90°>550nm<550nmLONG(700nm)(500LP)(500SP)SHORT(500nm)PassThroughFilters(500/50)Transmitted<500nm>500nm475-525nmWavelengthsBlocked>500nm<500nm<475nm&>525nmShortPassLongPassBandPass光学系统：滤光片（Filter）荧光激发波长根据所选的荧光素而异，可通过一组不同的光学滤片传递到各个PMT(光电倍增管中)当前第24页\共有85页\编于星期四\2点FC500的光路——固定光路，互换式滤片矩形反射光路，光路短，能量损失小，易于低强度荧光检测，并且组合滤片能保证荧光检测的特异性完全光学线路免校正客户可自由更换的滤片组合，且无须校正光路，可方便新荧光染料的使用，扩展机器的功能；当前第25页\共有85页\编于星期四\2点流式细胞仪的电路进行信号检测和分析荧光信号由光电接收器（PMT）接收，转变为电信号，可分析电压脉冲的高度、面积和宽度电脉冲信号经A/D转换成数字信号数字信号传送到计算机，进行储存、作图、统计分析当前第26页\共有85页\编于星期四\2点光电管和检测系统：PMT当前第27页\共有85页\编于星期四\2点光电管和检测系统：放大器基本原则

--信号强弱差<10倍or需线性关系:使用线性放大器(如散射光,DNA分析)

--信号强弱差>10倍or需分析弱荧光:使用对数放大器(如荧光)当前第28页\共有85页\编于星期四\2点FC500采用20比特的信息量数字化信号采集分析数据

数据信息量和检测精度的对应关系3Shapiro,H.PracticalFlowCytometry,4thEd.Page206.

*LSB=leastsignificantbit,voltagedifferencebetweenchannelnandchanneln+1.

NumberofBits#ofChannelsVoltage/LSB*825639.1mV101,0249.77mV124,0962.44mV1416,384610µV1665,536153µV18262,14438.1µV201,048,5769.54µV224,194,3042.38µV2416,777,216596nVThetableshowstheattributesofanalogtodigitalconverters3.Basedonthenumberofbits,theinputsignal(orvoltage)mustincreasebythisamountinordertoaffectachangeinthechanneldisplayed.FC500当前第29页\共有85页\编于星期四\2点SampledataOn20bitFC50010MB/sec光纤传输信号，反应迅速荧光分辨率的解析度更高，细胞分群更好在荧光表达低通道处（100-101阴性细胞位置）不会出现低分辨率数据常见的信号不饱和现象220

=1,048,576channels218=262,144channelsSampledataOnother18bitAnalyzerFC500优秀的荧光检测灵敏度和分辨率当前第30页\共有85页\编于星期四\2点CAnalyzerNONEsmoothhistogramCD19FITCNOWASHFC500NONEsmoothhistogramCD19FITCNOWASH同一份样本检测，FC500的信噪比更好当前第31页\共有85页\编于星期四\2点FC500Flowcytometr的基本结构流路：

流动室鞘液sheath

样本流sample光路：

光源

光学收集系统电路：

光电倍增管(PMT)、光电二极管、放大器（线性、对数）

A/D转换（光信号转换为电信号之后的处理分析道数和电信号的脉冲转换）统计：计算机软件当前第32页\共有85页\编于星期四\2点FC500高度自动化人性化的软件系统Windows™2000系统平台多用户操作可以将每天的应用预先设置和安排

FCS3.0文件格式，可以直接打开多种结果输出形式，完全与OFFICE兼容多种图形叠加方式开放式软件，可以在任何电脑上安装使用当前第33页\共有85页\编于星期四\2点Quickset——直观的电压调节当前第34页\共有85页\编于星期四\2点QuickComp——直观的补偿调节补偿前补偿后当前第35页\共有85页\编于星期四\2点FC500丰富的上样系统——高通量标准化自动化32支试管自动上样盘（MCL)独立获取样本简单，自动检测和报告，有利于实验的标准化，减少人为误差每支试管检测前单独震动混匀，有利于均匀获取细胞，结果更准确可靠当前第36页\共有85页\编于星期四\2点FC500配套自动化标本处理系统全自动标本处理和溶血系统，灵活搭配，减少人为误差，节省人力和试剂Q-PREPTQ-PREPPREPLUSII标本处理系统上样装置与FC500完全兼容当前第37页\共有85页\编于星期四\2点FC500全自动无缝连接的流水线系统无人值守标准化操作杜绝污染速度快模式一模式二当前第38页\共有85页\编于星期四\2点独家的可升级多平台自动上样系统FC500MPL24孔96标准孔和深孔反应板40支试管(12x75mm)可以固定体积上样检测可以减少高通量工作需要的烦杂的取样过程将您的注意力从操作中解放出来，而集中于思路的创新FC500是一款单平台既能96孔板又能40管常用试管上样的流式细胞仪当前第39页\共有85页\编于星期四\2点FC500智能化的体现FC500面板LED显示屏能随时自动显示各色荧光的强弱，激光开启状态，上样速度，鞘液、废液水平当前第40页\共有85页\编于星期四\2点FC500特点1根激光5色荧光分析，获取高可信度多色数据

2种角度前向散射光检测功能，更准确定位目的细胞,20Bit高分辨电子系统，更精确解读荧光信号

3种图形显示及更强大的分析工具：各种2维平面图，三维立体图，独特的PRISM浓缩柱形图，无限制的直方图叠加功能

4种进样方式：单一试管，32管自动上样，24/96

微孔板，40管自动上样，具有目前最丰富的进样模式

55X5ADC正反全矩阵高精度补偿及离线补偿系统，自动化的电压补偿调节功能，强大的批量处理分析功能当前第41页\共有85页\编于星期四\2点检测的一般步骤设置检测方案（PROTOCOL)染色标本（同型对照，补偿管，待测样本）同型对照管调电压电压不变，补偿管调补偿电压不变，补偿不变，上检测管检测后直接阅读结果当前第42页\共有85页\编于星期四\2点电压调节－利用同型对照：设置背景

电压volts

增益Gain设定阴性和阳性信号强度的临界点当前第43页\共有85页\编于星期四\2点荧光补偿FITCPE受激光照射后FITC和PE分子发射光谱相互干扰当前第44页\共有85页\编于星期四\2点荧光补偿的调节FL2-%FL1FL-1(FITC)FL-2(PE)FL1-%FL2当前第45页\共有85页\编于星期四\2点QuickComp——直观的补偿调节补偿前补偿后当前第46页\共有85页\编于星期四\2点补偿调节－利用单标样本，来消除荧光交叉原则：单管单色标记交叉调节确认电压单标记管自动计算CROSSOVER验证管当前第47页\共有85页\编于星期四\2点补偿调节-最精确的全矩阵软件

利用软件进行全矩阵颜色补偿（任何两个荧光检测通道之间都可以进行补偿）当前第48页\共有85页\编于星期四\2点数据分析DotPlot（双参数点图）Histogram（单参数直方图）

Region（门）

Statistics（统计结果）参数当前第49页\共有85页\编于星期四\2点50Gallios最新产品多种专利技术和优化设计全球用户的一致认可，全球销售逾千台真正支持当前流式发展趋势多参数（几十个）小颗粒检测弱荧光表达稀有细胞自动化高通量上样全自动十色Gallios流式细胞分析系统当前第50页\共有85页\编于星期四\2点激光器的独特设计创新的卡槽式设计

微马达自动固定激光，真正固定光路，无需调整维护，即开即用灵活开放的平台，用户可自行升级更换新波长的激光，如561nm、375nm，保证未来的应用不受限每根激光有单独开关，延长激光使用寿命51当前第51页\共有85页\编于星期四\2点多色的灵活配置405nm638nm488nm2Lasers6colors(5+1)2Lasers8colors(5+3)3Lasers10colors(5+3+2)当前第52页\共有85页\编于星期四\2点多色检测优势观察混合样本中不同细胞亚群之间的数量变化和功能联系减少批次操作的变异误差准确识别细胞亚群以及评价细胞功能提高检测效率节约珍贵稀有样本增加灵敏度和分辨率当前第53页\共有85页\编于星期四\2点光胶耦合石英杯提高光收集效率77%利用光纤高效传输荧光到PMT18o

全反射收集光路减少光损失TheBoulevard高效的光收集系统

——保证多色分析的荧光灵敏度紧凑式设计缩短光信号传输距离光损失最小的反射角度用户自由插拔式光学滤片，更换后无需调节光路，保证新染料和应用不受限当前第54页\共有85页\编于星期四\2点独家提供仪器内部温控确保仪器始终处于工程师安装调试时的最佳状态保证实验准确性和重复性平均荧光强度变化在2%以内Gallios平均荧光强度变化超过25%没有温控的仪器当前第55页\共有85页\编于星期四\2点FSCW2SSCFSCW2W2可应用于血小板微颗粒，内皮微颗粒，红细胞微泡，以及细菌的检测独有的『多角度前向角散射光』检测功能FSC对于流式检测至关重要，影响圈门和统计针对不同类型样本，独家提供三种前向角散射光检测角度1-8°低角度：适用于分辨8-40um的颗粒1-19°宽角度：适用于分辨0.5-10um的颗粒W2增宽型大角度：相差0.1um的细胞颗粒以及背景噪音区分开

当前第56页\共有85页\编于星期四\2点微颗粒（microparticles，MPs）近年研究热点之一微颗粒是细胞激活或凋亡时从质膜脱落的一些膜性小囊泡，有促凝、促炎症和调节内皮功能的作用研究表明，微颗粒与血管生成的关系密切，在高血压、糖尿病、缺血性疾病以及肿瘤的发展中发挥了重要作用微颗粒水平增加见于多种疾病，如血栓症（血小板微颗粒）、充血性心力衰竭（内皮微颗粒）、妇女先兆子痫（合胞体滋养层细胞微颗粒）当前第57页\共有85页\编于星期四\2点微颗粒（microparticles，MPs）当前第58页\共有85页\编于星期四\2点真实有效的分析速度和信号处理能力40MHz数字化采样频率最大上样速度>25000个细胞/秒（90%产率），大大节省检测时间和宝贵样本可检测高度、面积、宽度、时间、比率参数GalliosOtherCytometerDataRate%Yield当前第59页\共有85页\编于星期四\2点SampledataOn20bitGallios10MB/sec光纤传输信号，反应迅速荧光分辨率的解析度更高：20比特细胞分群更好，检测、圈门和统计更准确，尤其适于分析分选含量稀有、微弱荧光表达差异或荧光连续表达的细胞群体220

=1,048,576channels218=262,144channels数据分辨率和信号精度最高SampledataOnother18bitAnalyzer当前第60页\共有85页\编于星期四\2点©QueenMary,UniversityofLondon2005R：阳性细胞数N：需要获取的细胞总数P：阳性率CV：变异系数单个样本处理和储存信息量：2400万细胞科学试验要求良好的准确性和重复性，统计上一般要求平行试验的数据结果的变异系数CV<5％，流式细胞仪单次上样处理和保存数据信息量要求更高，以便精确圈定分析分选区域尤其适合低含量稀有细胞群体（树突细胞、抗原特异性T细胞、Treg、各种干细胞、各种实体组织来源细胞等），轻松实现万分之一以下含量的细胞检测不同含量目的细胞需要获取的细胞总数当前第61页\共有85页\编于星期四\2点自动或手动模式，无需机械式安装调试单管进样或32管连续进样（88管/小时），真正实现Walkaway

每支试管检测前单管震动混匀功能，避免整盘振荡多次混匀对细胞形态、完整性和活性的影响全方位的条码扫描识别功能（转盘号、管号、单管条形码），方便高通量大样本信息录入可随时暂停/旋转以方便添加刺激剂等样本间自动清洗，交叉污染<0.1%最小死体积20ul减少操作者和样本接触(生物安全)轮盘式高通量标准化自动化上样系统当前第62页\共有85页\编于星期四\2点长效稳定供液设计支持长时间样本分析

液流车系统外接大容量鞘液桶不间断补液，保证内置鞘液盒液面恒定，消除液面下降引起系统压力变化对检测的影响外接大容量废液桶内置清洗液桶当前第63页\共有85页\编于星期四\2点定时自动开关机、清洗维护及远程诊断功能当前第64页\共有85页\编于星期四\2点简单直观的应用方式实时补偿/脱机补偿/自动补偿当前第65页\共有85页\编于星期四\2点PRISM浓缩柱形图真正支持多色分析

一张图上显示多达1024个表型组合结果（十色分析，210分析组合）将实验所分析的所有细胞数据结果简单地浓缩在一张直方图上能直接读出各种阴性或阳性组合的结果清晰直观且便于数据的保存颜色点图组合2122332346245102561526721271045210当前第66页\共有85页\编于星期四\2点支持最全面的生命科学研究内容细胞生理功能研究（死活鉴定、细胞内pH值、细胞内钙流、膜电位、酶活性）免疫功能研究（包括淋巴细胞亚群分析、细胞绝对计数、细胞活化、细胞因子、调节性T细胞、树突细胞、抗原特异性T细胞、Th17细胞等）造血干细胞计数血小板疾病及活化血小板检测HLA-B27强制性脊柱炎筛查白血病及淋巴瘤免疫分型、残留白血病检测器官移植的配型及免疫状态监控AIDS诊断及治疗监控肿瘤相关研究（肿瘤相关基因表达、抗肿瘤药物作用机制及多药耐药、放化疗以及生物治疗疗效的研究、循环中肿瘤细胞等）药物筛选，抗体研发，疫苗评估干细胞研究（干细胞的分离、鉴定、功能分析等）细胞周期和DNA倍体分析、DNA含量测定、细胞周期蛋白细胞凋亡及凋亡相关蛋白磷酸化蛋白的检测及信号传导通路的研究细胞治疗……当前第67页\共有85页\编于星期四\2点流式细胞仪应用举例

当前第68页\共有85页\编于星期四\2点一、稳定细胞株的筛选GFP转染后转染细胞（蓝色）与空载体转染细胞（红色）的对比，转染效率73％1、靶基因转染至目的细胞2、检测报告基因-荧光蛋白（GFP,YFP,Dsred）转染效率3、阳性细胞的无菌分选当前第69页\共有85页\编于星期四\2点二、细胞周期/DNA含量的分析常用染料：

PI7-AADHochest33342G0/G1SG2/M肿瘤细胞判断标准：DNA指数大于1.1或小于0.9S期比例大于15%S+G2期比例大于20%对抗肿瘤药物机制及疗效评价当前第70页\共有85页\编于星期四\2点分析单细胞群体，去除粘连细胞FSSSAWAH利用脉冲高度，面积，宽度三参数去除粘连细胞当前第71页\共有85页\编于星期四\2点细胞周期分析/DNA含量分析第三方软件分析周期Multicycle，ModFit等等决定cellcycles数 排除细胞碎片（debris）执行分析

分析数据信赖度分析（Confidenceanalysis）可信区间六种信赖度模式总结当前第72页\共有85页\编于星期四\2点DNA与蛋白同时检测Anti-CyclinA2-FITC7-AAD对照ThapsigarginPaclitaxelG039%M1.5%G05.3%M62%G028%M1.2%当前第73页\共有85页\编于星期四\2点CellproliferationCFSE在细胞分裂增殖过程中，它的荧光强度会随着细胞的分裂而逐级递减，标记荧光可平均分配至两个子代细胞中，因此其荧光强度是亲代细胞的一半。Brdu是5-溴脱氧尿嘧啶核苷代替胸腺嘧啶在DNA合成期（S期），活体注射或细胞培养加入，而后利用抗Brdu单克隆抗体，同时结合PI/7AAD双重染色.当前第74页\共有85页\编于星期四\2点凋亡启动细胞内Ca2+

动员★Caspase激活脱水致细胞皱缩核染色质凝缩★线粒体膜电位丧失★细胞膜PS外翻★核碎片形成★DNA被切割成低分子量片段细胞内酸化凋亡小体形成凋亡启动