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文档简介

实验五

酶联免疫吸附测定BSA抗体效价

1.目的要求(1)学习酶联免疫吸附测定的基本原理。(2)掌握酶联免疫吸附测定技术,抗体的效价测定及酶联免疫测定仪的使用。

2.基本原理免疫酶技术:酶标Ab/Ag,酶结合物的酶在免疫反应后,作用于厎物后显色,根据颜色的有无和深浅,定量测定Ab/Ag。免疫反应:一次或数次具Ag,Ab特异的免疫学反应酶促反应:只进行一次

显示出生物放大作用,灵敏度ng,pg60年代初期,Averameas&Ram等建立了免疫酶技术(immunoenzymatictechniques)

利用特殊的交联剂研制出辣根过氧化物酶---人血清白蛋白及酸性磷酸酯酶---抗体,统称为酶标记物或酶结合物,用于抗原或抗体的示踪、定位或定量测定酶联免疫吸附测定(enzyme-linkedimmunosorbentassay简称为Elisa)-----是在免疫酶技术(immunoenzymatictechniques)的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术。本法兼有灵敏度高和特异性强两方面的优点。1974年Voller等用聚苯乙烯微量反应板作为免疫吸附剂吸附抗体(抗原),再与相应的酶标记物结合操作更方便,易重复灵敏度可高达ng(10-9g)至pg(10-12g),(Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay)免疫标记技术应用各种液相和固相免疫分析方法,对体液中的半抗原、抗原或抗体进行定性和定量测定标记抗体或抗原荧光素、放射性同位素、酶、铁蛋白、胶体金及化学(或生物)发光剂镜检观察或进行自动化测定荧光显微镜,射线测量仪,酶标检测仪,电子显微镜和发光免疫测定仪等直接在细胞、亚细胞、超微结构及分子水平上,对抗原抗体反应进行定性和定位研究酶------性能稳定、经济易得、底物无色、产物显色,便于检测常用的酶:碱性磷酸酯酶、辣根过氧化物酶(horseradperoxidase简称HRP)、葡萄糖氧化酶、半乳糖苷酶等。酶标技术戊二醛法,过碘酸氧化法将酶与Ab交联在一起Ag-Ab-抗Ab-HRPTMB+H2O2产物(黄色,OD450)+H2O图一直接型Elisa

图二间接型Elisa图三双抗体夹心型ELISA图四固相抗体竞争型ELISA未知抗原量=A(1)-A(2)每次反应后都要反复洗涤?保证反应的定量反应防止重叠反应,引起非特异现象。Pa斩rt否ia扬ll传y黑pu通ri煎fi唯ed尸,鼻in照ac钱ti服va欣te箱d泛HI援V爪an庸ti暖ge先nsan达ti滩ge忙ns着p松re羡-c饿oa思te绍d衔on殖to螺a炼n蝴EL迟IS拒A婶pl喝at识e部分谦纯化秆,灭毯活病因毒抗穴原抗原奸涂到给酶标扬板Pa屠ti荣en谢t拣se寨ru知m办wh比ic犯h欲co米nt扬ai轿ns铅a准nt催ib里od往ie偿s.糠I杜f售th盖e链pa饮ti突en绸t嘴is功H陡IV斤+,朝t镜he渐n削th呼is磨s浙er康um温w迈il剃l区co溜nt储ai婆n糊an缎ti扛bo燃di嫩es姜t阁o喇HI冤V,见a圈nd气t仅ho刻se哭a另nt僻ib祝od掉ie炕s屿wi登ll划b况in缝d原to竞t辞he编H盛IV菠a愤nt瞧ig首en都s境on摆t另he钳p庭la何te交.病人遥血清暑中含记有抗醒体。甚如果剥病人班是艾君滋病译毒+,那淘么这腿个血验清含夜有艾旺滋病五毒抗界体,葱这些路抗体冰可以肤绑定栏到病著毒抗灯原板An蛙ti革-h键um波an辛i祸mm辟un微og盾lo装bu扭li走n锯co款up寻le楚d刊to认a塌n来en泛zy渠me广.旺Th白is芝i猴s鹅th逮e料se烦co皱nd筹a鲁nt牲ib膝od灭y,肺a守nd死i淡t侵bi吃nd饶s荐to旨h提um沙an旬a斑nt惭ib擦od梯ie舟s.抗人炒免疫量球蛋昏白耦柳合酶尖。这镇是继饼抗体浩,并钻结合往人类愉抗体su苹bs储tr弄at否e茎wh朵ic呀h猎ch树an灿ge点s湖co凳lo则r煮wh恶en苦c岂le蓝av维ed芒b达y糊th检e绝en办zy禁me礼a抬tt蕉ac较he菊d烤to字t篮he态s慌ec滑on武d忠an荐ti沙bo购dy伴.基板携而改捐变颜铲色,不当裂倘解酶涉附二饱抗体HI币V(hu有ma重n垃im扑mu念no痰de盲fi联ci告en言cy半v装ir典us垄)厅de滑te荒ct葛io树npo配si服ti顺vene肚ga喇ti妥vePr谨ot访ei奴n芹pr碗ot暂ei久n加in枪te载ra堡ct怠io条n-霞--庸EL注IS琴A1.该D眼ir牢ec丑tel抹is喷adi紫ff胡er鞭en本tep特it廉op妈eCo嘱at锄w嘉it蹈h货pr遥ey截p滋ro扒te仰inIn升cu骄ba辟te羽w夕it蹦h柔ba陶it咸p讽ro顽te桶inPi罚ma区ryAban很ti挺b的ai课t熟pr腰ot久ei并n局--括--织-直接扭酶联映免疫价吸附额试验雕不同半表位外套脚与猎斗物蛋乔白孵化台与诱深饵蛋合白原发柱性抗伸体抗礼诱饵议蛋白2.汇Co亚mp友et羊it磨iv竹eel趣is夜asa北meep艘it满op倚eCo讯at精w予it行h堵ba桶it秆p鱼rIn宋cu声ba龙te虽w红it吉h谊pr庆im甩ar怠y凯an班ti赌bo乳dy辰a致nt狮i光ba垒it摊p光r厅a乱nd似v晒ar挥io毛us园c佳on御ce淹nt圆ra宅ti副on狐p映re社y静pr角ot跌ei所n(竞争色同一侄表位亚。外套恐与诱抗饵蛋阴白培养腐初级兰抗体宏抗诱锹饵蛋观白及麻不同感浓度估的猎摘物蛋起白)4.操作易方法4.孙1奖包被欧特异停性抗圾原:固奔体抗端原(庸如蛋技白质得)用耕包被材液稀奋释至幅10Oμ袜g/延ml翁,每凹浩孔加手10系0μL雷,加盖与置4盖℃过猪夜(绣37院℃术2h),次日完倾去完凹孔乖内液沫体,蹲用滴妥管取遗洗涤霉液在筑每孔塘中加器3~峡4滴驰,静荒置3mi挪n后倾逢去,行重复无3次阳,将祝反应拘板扣吗放在罗滤纸搁上,楼以除徒净液更体。4.狮2昨封闭:抬每孔港中加斥入2剑00-4膏00μL封闭护液,低加盖漏或用困封口模膜封甘板,筒置3磨7℃贱恒温供箱6刷0mi桃n,倾去哨孔内铜液体锈,按每上法锤洗涤零3次底。4.斥3华加待辟测血拣清(杠内含竭抗体趣)、垦阴性廉血清译(无上抗体颤)及禾稀释她液(PB翻S/Tw谎ee之n):待测乌血清寨按倍劈燕比法究用稀用释液炭稀释湿(1敌:1她00背、1纪:2概00德等)堤,阴诵性血史清也控稀释冰成1品:1促00枕,取摧不同高稀释颈度的降待测财血清霜,阴汁性血乘清及栋稀释搜液(PB崖S/Tw散ee泉n)各1OO斜μL加至泳相应打的凹毫孔中换,加职盖或躺封板钳,置广37倾℃恒需温箱踏1h,使抗腔体与山固相恩抗原泼进行牢特异田性结唐合,兄反复撑洗涤么3次隔。12345678PB妙S/Tw米ee唯n1:宴10录0阴惨性血桑清1:1,母00融01:5,覆00熟01:10僻,0喊001:20莫,0租001:50圣,0谱001:10愉0,例00督0阳性血娃清4.讽4附加酶舅标抗溜体:按铺说明滥书要辰求用狗稀释并液稀扣释HR营P-抗体撇(抗升抗体巨),返每孔肌加l0登0μ旱L,封板同后置淹37花℃温载育lh,按上躁法至苏少洗缺涤5家次,秒最后土用蒸话馏水话洗涤毛2次凯,扣贞在滤寺纸上妹吸干袭水分贞。4.族5帖显色:悼每孔残加入OP缓D应用张液1OO镜uL、反应去板置付室温摄暗处际5~飘30mi品n。当显猴示橙凑色时引应及锤时终猎止反寨应。4.因6词终止糕反应:每奴孔加雁入5Oμ剧L滨2m同ol策/L找H2SO4。稳定园3~肉5mi活n即可胡比色永测定民。4.仙7犹检测:忘用酶婚联免垮疫测砌定仪谅,以PB狗S/Tw车ee校n孔为遥对照讽、测踪蝶波长临为49O旱nm时各兰孔光快吸收沾(A)。计算谷阳性苦血清垄与阴柔性血撞清A值之伏比(Po第si扒ti膝ve激/n塑eg揉at辅iv职e,券P/胞N)仰,当P/档N≥嗽2.质1时为文阳性赌,P/吸N<亚2.公1而≥穿1.胞5为征可疑挡,P/全N<制1.祝5为阴相性。暗用目脂测法周则以恰较阴柴性对影照深斤色的检最高根稀释低度作语为抗姑体效听价。用“恰+”驻“-张”表饿示,捉超过立规定舟吸收谨值(循0.吉2-面0.专4)谅的标段本均升属阳嘱性。注意偏事项(1周)聚丑苯乙脖烯微滋量反奏应板她应选述择高非质量越、非悼特异隐性吸悔附小吓的产满品。荣包被使物应瓶具有亲较高若的纯矩度,谈其浓声度一调般在为1~墙10月0μg之间旗,在眨偏碱孤条件西下易钉吸附廊于反以应板采的凹屈孔中天,4小℃放权置过讨夜较祥理想追,若凝暂时职不用顺,可娇加入某终浓铲度为照0.脉02键%Na轰N3,4路℃贮存松,也晶可倾屋去包滑被液维,干淋燥后挥置硅言胶干料燥器表中,及室温删存放快3个含月以诊上不予影响牧测定小效果沃。(2尺)反晋应各宵步均悠应充顿分洗颜涤,翼以除稿去残题留物呀,减手少非悄特异喊性吸陈附。傻为使辞结果群重复常应固晃定洗壶涤次随数及争放置住时间皂,切眉忌相蛇互污功染。(3距)为桥使显滤色反静应便萄于比酸较,撇显色迁后置稠室温接暗处伍的时睬间应宅一致牛,终眨止反律应3京~5mi瓣n后应嘉立即谦比色疏。必触要时搅可设能阳性渗对照精,以牲固定据显色出及终恰止时丸间。(4润)待毯测抗城体或旦抗原药与酶赏标抗泄体应早具有断相同印的免者疫特丽异性寺,否挽则无什法结贼合。自动波酶标赖仪(El物x8区00断UV)使用虫程序1开机移,进示行Sy许st盾em酷s倡el类f-粒te而st攻…2按“DE塌FI蝇NE绞”键,坊进入照“SE蝇LE搜CT悉A驻SS站AY夺N反UM委BE拥R”来,用“NU双ME虑RI舟C”或“OP必TI得ON界”键输续入测香试号衡(注浅:as允sa碍y买01为qu永ic谊k抓re垃ad失,最大澡测试验号为炎55钻);翁按“EN贼TE观R”键修躬改测劳试的太“NA取ME恐”;再按竹“EN笑TE武R”键进嗓入下有列菜筹单:按“ME仪TH删OD挽”键选件择测涌试的要波长全类型干(Si徐ng灰le或Du好al富)、波长吼大小葱(3暴40给、4失05斧、45捐0、49鬼0或穴63蛇0nm牛)、微孔它板类命型(96凳孔、4屿8孔希或2症4孔患)。按“MA扣P”键选妖择阅增读方梳式(Au妥to或Ma杯nu番al这)异、阅读瓜方向丙(Do挑wn或Ac帖ro些ss新)、重复晋方向春(Do美wn或Ac鸦ro味ss猎)、阅读阴起始沙位置粪(输尺入编炼号)灶、空震白Ma街p(Ai捐r、F冰ul闭l、柏Co槽ns监t、乞Co嫁lu茂mn接、P绸-D筒ow草n、仁P-催Ac梁ro阵ss棋)。3按“RE选AD乳”键,群酶标灿板推扇进入堂仪器济,开越始读志数并踪蝶计数泉,打稳印机左输出古数据惊。4扇按“MA港IN水M戒EN差U”键回傲到主谢菜单屡,关羊闭电奶源。酶标秤板的耀清洗推:采用EL庙x5椒0T肯M型微完孔板秃洗板五机,巴注射启泵驱给动的赴液体束输送江,条姓状单红排清室洗或那全板丑清洗了解摆转膜该电泳配原理讽的应里用及乒操作We铸st晃er饱n伟Bl桑ot营ti老ng堵o其rim再mu连no饼bl罩ot粒ti愤nga疤sp犬ec教if述ic加p疾ri蝴ma韵ry挖a伴nt暮ib伙od筐y19剩79腰,To托wb炕in19烤75后,So礼ut戏he优rn比,蓄So吹ut慢he诵rn舱b同lo炭tt字in暮g19某77道,Al次wi犁ne,净No替rt克he怠rn晓b扬lo倚tt谎in掏g19狠79务,To扔wb愈in,We眼st摘er业n论Bl丢ot砖ti从ng19逼82淹,Re某ih庆ar愈t,么Ea我st摸er霉n县bl圣ot坝ti赶ng旦,双向悟蛋白虽质印如记We呢st谣er幕n顿bl欠ot夜ti起ng家:听A撕nt慎ib挣od钞ie概s贤ca苗n框be酷u泄se导d畏to反d恼et侧ec欣t盆sp鞭ec臣if角ic馅p奔ro谜te架in比sAl叠te型rn胸at录e任de毫te忠ct炎io炭n翁me蓝th刷od充–膏S炭ec屠on信da丹ry益a练nt驼ib区od厦ie蒜sMe揪me裂br梦an带e:吸附抽生命缝大分邻子的蛮固体党材料NC体,ni苏tr竞oc括el堵lu嚼lo匆se硝酸解纤维交素膜尘0混.4享5um结合鄙率:毕80ugPr聪/c惰m2便宜耳,可提简单目快速彻封闭素非特驴异性带抗体壳的结址合ND叨M,潮n窄yl帆on盲-de乔ns介edme造mb朵ra蚂ne尼龙针膜结合醒率:捐48六0ugPr肾/c苦m2DB阶M,di纱az如ob币en锡zy初lo年xy如me病th信yl重氮巨苄氧皆甲基困膜湿法叙转移绿蛋白萝质:蜜将ge顺l和me象mb帅ra弟ne夹在bl戚ot怕te州r更pa还pe贩r中,滤浸在蜻转移为装置梯的bu犯ff很er中,技通电告45mi悲n或ov型er集n循ig竖ht可完铜成。Tr猴an蜡sf验er尤B顿uf愤fe亿r塑(5炕00克m搁l,春p置H尿8.舱3)gl此yc女in童e1.止45溉0逼g态(3仁9mM)Tr俊isba通se役2歌.9副00峡g劲(夏48mM)SD晶S珍0.嫌18圈5骡g限(0事.0项37蒙%)Us孕in携g偏th仰e森Se滨mi殖-D朗ry登T罚ra著ns吹fe茶r昂Un埋itRe般mo加ve谁t狼he脱s称ta许ck技in划g储ge烦l宁fr伟om杠t廉he门g埋el围.去除车堆积可凝胶贤的凝围胶。2.句Cu腊t倚pi栋ec利es莫o杜f决bl测ot镰te现r傲pa狠pe壳r闻to浪t钱he沉s双iz准e费of毒t燃he并g杜el俊.no燃te伴:姑th记e腐bl袍ot素te蚀r起pa弯pe贴r究(a凉nd蚂t叨he祥m遥em迈br剧an踪蝶e)步n喊ot班b坚e南la淹rg娇er筒t无ha洗n如th惜e炼ge租l.得L锣ar泡ge躬r束pi前ec饰es贸m德ay冒m鸣ak物e观co题nt至ac叫t功ar椅ou部nd悄t卸he并g桶el汤,浴an讲d奶al悼lo适w手th规e鹿cu维rr友en逮t纤an作a妥lt慎er曲na蚕te脚r湖ou他te嗓,生th穿er晓eb通y歉ma轻ki宗ng礼t零ra地ns恨fe州r护i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