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文档简介
关于生物制药酶类药物第1页,课件共72页,创作于2023年2月第一节药用酶类的概述第2页,课件共72页,创作于2023年2月关于酶,你已经知道了哪些知识?还想知道哪些知识?第3页,课件共72页,创作于2023年2月酶的分类第4页,课件共72页,创作于2023年2月“绿色健康,“酶”力无限医药、洗涤剂、纺织、淀粉制糖、发酵、酒精、食品(包括果蔬汁、啤酒酿造、谷物食品、蛋白水解、和功能食品以及食用油脂)、饲料、皮革、造纸和化工等工业领域
第5页,课件共72页,创作于2023年2月淀粉酶类与淀粉糖业第6页,课件共72页,创作于2023年2月果汁生产与果胶酶乳制品与凝乳酶第7页,课件共72页,创作于2023年2月酶蛋白成为药物应具备的条件在生理pH下,具有最高活性和稳定性对基质具有较高亲和力(低Km值)血清中半衰期较长纯度高免疫原性低或无免疫原性不需要外源辅助因子第8页,课件共72页,创作于2023年2月第9页,课件共72页,创作于2023年2月第10页,课件共72页,创作于2023年2月酶类药物在疾病治疗方面的应用酶名来源用途淀粉酶胰脏、麦芽、微生物治疗消化不良,食欲不振蛋白酶胰脏、胃、植物、微生物治疗消化不良,食欲不振,消炎,消肿,创愈,降压脂肪酶胰脏、微生物治疗消化不良,食欲不振纤维素酶霉菌治疗消化不良,食欲不振溶菌酶蛋清、细菌治疗各种细菌性和病毒性疾病尿激酶人尿治疗心肌梗塞,结膜下出血,黄斑部出血链激酶链球菌治疗血栓性静脉炎,咳痰,血肿,下出血,骨折青霉素酶蜡状芽孢杆菌治疗青霉素引起的变态反应L-天冬酰胺酶大肠杆菌治疗白血病超氧化物歧化酶微生物,植物,动物预防辐射损伤,治疗红斑狼疮,皮肌炎,结肠炎凝血酶动物,蛇,细菌,酵母等治疗各种出血病胶原酶细菌分解胶原,消炎,化脓,脱痂,治疗溃疡右旋糖酐酶微生物预防龋齿胆碱酯酶细菌治疗皮肤病,支气管炎,气喘溶纤酶蚯蚓溶血栓弹性蛋白酶胰脏治疗动脉硬化,降血脂核糖核酸酶胰脏抗感染,祛痰,治肝癌尿酸酶牛肾治疗痛风第11页,课件共72页,创作于2023年2月第12页,课件共72页,创作于2023年2月第13页,课件共72页,创作于2023年2月第14页,课件共72页,创作于2023年2月栓溶酶类与心血管疾病第15页,课件共72页,创作于2023年2月凝血酶第16页,课件共72页,创作于2023年2月健美生消化酶—帮助肠胃蠕动【产品规格】90片/瓶【食用方法】成人每日3片,随主餐服用【成分(每片含)】1)消化蛋白质:木瓜蛋白酶50毫克、菠萝蛋白酶30毫克;2)消化脂肪:脂肪酶30毫克;3)消化碳水化合物/淀粉:淀粉酶50毫克;4)消化乳制品:乳糖酶30毫克;5)消化纤维:纤维素酶15毫克。另含:能抑制过多胃酸的葡萄糖酸钙,能缓解反胃薄荷叶和茴香【适用人群】·消化不良者·肠胃疾病患者·大病初愈者消化酶类第17页,课件共72页,创作于2023年2月第二节酶类药物的制造过程一、原料的选择1.不同酶的用料选择乙酰化酶(鸽肝)、凝血酶(牛血)、透明质酸酶(羊睾丸)、溶菌酶(鸡蛋清),超氧化物歧化酶(血、肝)第18页,课件共72页,创作于2023年2月2.注意不同生长发育情况及营养状况3.原料来源丰富4.从简化提纯步骤着手5.如用动物组织作原料,应在此动物宰杀后立即取材。第19页,课件共72页,创作于2023年2月二、微生物酶制剂高产菌株的选育菌种是工业发酵生产酶制剂的重要条件。优良菌种不仅可以提高酶制剂产量和发酵原料的利用率,而且还与增加品种,缩短生产周期,改进发酵和提炼工艺条件等密切相关。优良菌种获得的三种途径:(1)从自然界分离筛选;(2)用物理或化学的方法处理,诱变;(3)用基因重组与细胞融合技术。第20页,课件共72页,创作于2023年2月三、微生物酶制剂生产的发酵技术(一)培养基1.碳源(甘薯、玉米、麸皮、米糠)2.氮源(豆饼、花生饼、菜籽饼、硫酸铵、尿素)3.无机盐4.生长因子和产酶促进剂第21页,课件共72页,创作于2023年2月(二)培养方法1.固体培养法固体培养法也称麸曲培养法,该法是利用麸皮或米糠为主要原料,另外视需要添加其它谷糠、豆饼等,加水拌成含水适度半固态物料作为培养基。2.液体培养法液体培养法是利用液体培养进行微生物的生长繁殖和产酶。根据通气方法的不同,又分为液体表面培养和液体深层培养。深层通气培养是目前应用最广的方法。第22页,课件共72页,创作于2023年2月3.影响酶产生的一些因素除培养基,发酵工艺参数对产酶的影响也十分明显。(1)温度(2)pH(3)通气(4)搅拌第23页,课件共72页,创作于2023年2月(5)泡沫发酵过程中,由于发酵液受到强烈的通气搅拌,培养基中某些成分的变化及代谢中产生气体,会形成较多的泡沫,而且气泡不易消失,是由于培养基中蛋白质分子排在气泡表面形成一层吸附膜,聚集成泡沫层之故。消泡剂:天然油类,醇类,脂肪酸类,胺类,酰胺类,磷酸酯类,金属皂类,聚硅氧烷等。第24页,课件共72页,创作于2023年2月(6)添加诱导剂和抑制剂诱导酶抑制剂(表面活性剂)第25页,课件共72页,创作于2023年2月四、酶类药物的提取和纯化
原料选择生物材料的预处理☆提取浓缩☆纯化结晶☆第26页,课件共72页,创作于2023年2月1.动物材料的预处理:(1)机械法:有绞碎、刨碎、匀浆、研磨、超声波、挤压等方法。有些酶用机械法处理后仍不能有效的提取,可结合其他处理法。(2)冻融:冷到-10℃左右,再缓慢溶解至室温,如此反复多次。由于细胞中冰晶的形成,及剩下液体中盐浓度的增高,能使细胞中颗粒及整个细胞破碎,使酶释放出来。(3)丙酮粉:组织经丙酮迅速脱水干燥制成丙酮粉,不仅可以减少酶的变性,同时因细胞结构成分的破碎使蛋白质与脂质结合的某些化学键打开,促使某些结酶释放到溶液中。材料的预处理第27页,课件共72页,创作于2023年2月2.微生物材料的预处理胞外酶:除去菌体后再直接从发酵液中吸附提取酶。胞内酶:将菌体细胞破壁,制成无细胞的悬浮液后再行提取。第28页,课件共72页,创作于2023年2月1.干燥法:干燥后菌体产生自溶(1)空气干燥:适用于热稳定的酶(2)真空干燥:适于细菌(3)冷冻干燥:适用于较敏感的酶2.机械法(1)研磨法(2)组织匀浆法(3)超声波法(4)高压匀浆法3.酶法处理第29页,课件共72页,创作于2023年2月(二)酶的提取1.水溶液法常用稀盐溶液或缓冲液提取。经过预处理的原料,包括组织糜,匀浆,细胞颗粒以及丙酮粉等,都可以用水溶液抽提。许多酶再蒸馏水中不溶解,而在低盐浓度下易溶解,所以提取时加入少量盐可提高酶的溶解度。第30页,课件共72页,创作于2023年2月2.有机溶剂法某些结合酶如微粒体和线粒体膜的酶,由于和脂质牢固结合,用水很难提取,为此必须除去结合的脂质,且不能使酶变性,最常用的有机溶剂是丁醇。丁醇具有以下特点:(1)亲脂性强,特别是亲磷脂的能力;(2)兼具亲水性,在0℃在水中的溶解度为10.5%;(3)在脂与水分子间能起类似去垢剂的桥梁作用。3.表面活性剂法第31页,课件共72页,创作于2023年2月(三)酶制剂的工业提取法1.发酵液的预处理及过滤絮凝剂2.酶液的脱色0.1~1.5%活性炭3.盐析法4.有机溶剂法5.喷雾干燥直接制备粉末酶制剂第32页,课件共72页,创作于2023年2月酶的分离提纯三个基本环节:第一抽提,即把酶从材料转入溶剂中制成酶溶液;
第二纯化,即把杂质从酶溶液中除掉或从酶溶液中把酶分离出来;第三制剂,即将酶制成各种剂型。在酶的分离纯化过程中.每步都须做三件事:第一,测定酶活力(IU/m1);第二,测定蛋白质含量(mg/m1);第三,测量体积(m1)。第33页,课件共72页,创作于2023年2月酶是生物活性物质,操作条件要温和,一般在0~5℃间进行。初分:用分离蛋白质的方法,如盐析、等电点沉淀、有机溶剂分级、选择性热变性等方法可从酶粗提液中初步分离酶。细分:再采用吸附层析、离子交换层析、凝胶过滤、亲和层析、疏水层析及高效液相色谱法等层析技术或各种制备电泳技术进一步纯化酶,以得到纯的酶制品结晶:酶的结晶过程进行得很慢,需要数天或数星期。第34页,课件共72页,创作于2023年2月凡用于蛋白质的纯化手段均适用于酶的纯化酶的提纯常包括两方面的工作:(1)浓缩:把酶制剂从很大体积浓缩到比较小的体积,(2)去杂蛋白:把酶制剂中大量的杂质蛋白和其他大分子物质分离出去。(四)酶的纯化第35页,课件共72页,创作于2023年2月一般原则:防止强酸、强碱,要求加入的化学试剂不使酶变性;在低温下操作,全部操作在低温0~4℃;在分离提纯过程中,避免剧烈搅拌;在提纯溶剂中加一些保护剂,如少量EDTA、少量β-巯基乙醇;在不破坏所需酶的条件下,可使用各种“激烈”的手段。第36页,课件共72页,创作于2023年2月(一)杂质的除去酶提取液中,除所需酶外,还含有大量杂蛋白,多糖,脂类和核酸等,需要除去。(1)pH和加热沉淀法利用蛋白质酸碱变性性质的差异可以通过调pH和等电点除去某些杂蛋白,也可以利用不同蛋白质对热稳定性的差异。(SOD酶)(2)蛋白质表面变性法利用蛋白质表面变性性质的差别,也可以除去杂蛋白。制备过氧化氢酶,加入氯仿除杂蛋白。第37页,课件共72页,创作于2023年2月(3)选择性变性法利用蛋白质稳定性的不同,除去杂蛋白。(4)核酸沉淀剂法在微生物制备酶时,常含有较多核酸,可用核酸酶降解,离心分离,用核酸沉淀剂如三甲基十六烷基溴化铵,硫酸链霉素等。(5)将酶与底物结合,用加热法除去杂蛋白。近来发现,酶和底物结合或竞争性抑制剂结合后,稳定性大大提高,这样可以用加热法除去杂蛋白。第38页,课件共72页,创作于2023年2月基本操作程序:分离:先进行净化处理(过滤,絮凝,离心脱色),再采用沉淀法分离(盐析法,沉淀法,超离心等)。第39页,课件共72页,创作于2023年2月酶分离方法有:分子大小:如离心分离法、筛膜分离法、凝胶过滤法等。溶解度大小:如盐析法、有机溶剂沉淀法、共沉淀法、选择性沉淀法、等电点沉淀法等。所带正负电荷:如离子交换分离法、电泳分离法、聚焦层析法等。稳定性差异:如选择性热变性法、表面变性法等亲和作用的差异:如亲和层析法等.第40页,课件共72页,创作于2023年2月纯化:采用离子交换层析,凝胶过滤,液相色谱,亲和色谱和超滤等方法。第41页,课件共72页,创作于2023年2月1.凝胶过滤法(分子筛)原理将样品混合物通过一定孔径的凝胶介质,由于流经路径的差异,使不同分子质量的组分分离;大分子物质直接从凝胶颗粒外通过,走得快;小分子物质进入凝胶颗粒的内部再出来,走得慢。第42页,课件共72页,创作于2023年2月第43页,课件共72页,创作于2023年2月2.离子交换法原理利用溶液中各种带电粒子与离子交换剂之间结合力的差异进行物质分离。DEAE是一种阴离子交换剂,将样品的pH值调至等电点以上,使样品带负电荷,采用盐溶液洗脱,通过高浓度的带同种电荷的离子(Cl-)置换被分离的组分T离子强度蛋白浓度T第44页,课件共72页,创作于2023年2月+++++
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带负电荷的被吸附上带负电荷少的先被置换带负电荷多的后被置换第45页,课件共72页,创作于2023年2月
NaClTris连续梯度洗脱:梯度混合仪第46页,课件共72页,创作于2023年2月3.亲和层析法原理
亲和吸附剂一般是由固相载体和能与目的酶专一可逆结合的配体共价结合而成的.将亲和吸附剂填充层析柱,让酶溶液流过层析柱,则目的酶能迅速而又选择件地吸附在亲和吸附剂上,用适当的溶液进行洗脱,除去—些非专—性的杂质后.再用浓度高的或亲和力强的配体溶液边行亲和洗脱,酶便脱离层析柱上的配体而流出柱外。洗脱方法
改变温度的洗脱改变pH、离子强度及溶剂系统组成进行洗脱。第47页,课件共72页,创作于2023年2月亲合层析原理图解洗脱液支持物被分离物的抗体其它物质被分离物第48页,课件共72页,创作于2023年2月表—些互为配基的物质。第49页,课件共72页,创作于2023年2月第50页,课件共72页,创作于2023年2月
2.酶的浓缩:(1)工业上:超滤、真空减压浓缩、薄膜浓缩、冷冻浓缩、离子交换法、(2)实验室:除上述方法外,对少量样品可用下列方法
1.用G-15或G-25浓缩
2.用聚乙二醇(PEG)浓缩
3.凝胶吸水第51页,课件共72页,创作于2023年2月(二)脱盐和浓缩1.脱盐(1)透析玻璃纸袋(2)凝胶过滤SephadexG-10第52页,课件共72页,创作于2023年2月(3)复合结晶法有时可以利用某些酶与有机化合物或金属离子形成复合物或成盐的性质来结晶。(4)透析平衡利用透析平衡进行结晶也是常用方法之一。(5)等电点法第53页,课件共72页,创作于2023年2月(三)酶的结晶☆特征:有序性,对称排列,周期性的重复结构
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为空间结构研究提供x-衍射样品既是纯化的结果又是纯化的手段第54页,课件共72页,创作于2023年2月把酶提纯到一定纯度以后,可使其结晶。蛋白质分子多数处于含水的环境中,蛋白质分子与水分子结晶形成稳定的水合物。当蛋白质的浓度非常高的时候,溶液中没有足够可以与蛋白质结合的水分子用于形成水合物,在蛋白质分子之间也没有足够的水分子可以将它们充分隔开,于是蛋白质就以无定形沉淀或结晶的形式从溶液中析出。第55页,课件共72页,创作于2023年2月2.结晶的条件选择酶的纯度酶的浓度金属离子pH温度、时间晶种第56页,课件共72页,创作于2023年2月酶蛋白结晶的基本条件:(1)酶的纯度酶只有达到相当纯度后才能结晶。酶的纯度越高,结晶越容易,长成大的结晶可能性也越大。(2)酶的浓度结晶母液尽可能保持高的浓度。酶的浓度越高越有利于溶液中溶质分子间的相互碰撞聚合,形成结晶的机会也越大。第57页,课件共72页,创作于2023年2月(3)温度(4)时间(5)pH有时相差0.2pH,只能达到沉淀,而不能达到晶体。(6)金属离子许多金属离子能引起或有助于酶的结晶。(7)晶种(8)结晶器皿处理。第58页,课件共72页,创作于2023年2月酶的结晶方法(1)盐析法在适当的pH、温度等条件下,保持酶的稳定性,慢慢改变盐浓度进行结晶。结晶时采用的盐有硫酸铵,柠檬酸钠,乙酸铵,硫酸镁等。利用硫酸铵结晶时一般是把盐加入到一个比较浓的酶溶液中,并使溶液微呈浑浊为止。然后放置,并且非常缓慢地增加盐浓度。操作要在低温下进行,缓冲液pH要接近酶的等电点。第59页,课件共72页,创作于2023年2月(2)有机溶剂法酶液中滴加有机溶剂,有时也能使酶形成结晶。结晶用溶剂有:乙醇,丙醇,丁醇,乙腈,异丙醇,二恶烷,二甲亚砜,二氧杂环已烷。(3)复合结晶法(4)透析平衡法(5)等电点法第60页,课件共72页,创作于2023年2月酶的制剂形式:
结晶:固体:干燥(冰冻升华,喷雾干燥,真空干燥)液体:低温(0-4℃,-20℃)提高酶蛋白的浓度加入稳定剂固定化第61页,课件共72页,创作于2023年2月保存:通常将纯化后的酶溶液经透析除盐后冷冻干燥得到酶粉,低温下可较长时期保存。也可将酶溶液制成25%甘油或50%甘油分别贮于—25℃或—50℃冰箱中保存。注意:酶溶液浓度越低越易变性,因此切记不能保存酶的稀溶液。
第62页,课件共72页,创作于2023年2月
酶的分离纯化工作中的注意事项1.防止酶蛋白变性2.防止辅因子丢失3.防止酶被蛋白水解酶降解第63页,课件共72页,创作于2023年2月采取的措施:1.避免泡沫的生成2.加入金属鏊合剂EDTA3.加入巯基试剂,如巯基乙醇、二硫苏糖醇(DTT)等4.加入蛋白酶抑制剂
第64页,课件共72页,创作于2023年2月衡量分离提纯方法优劣的指标:总活力的回收(表示提纯过程中酶的损失情况).比活力提高的倍数(表示提纯方法的有效程度)。第65页,课件共72页,创作于2023年2月总活力=活力单位数/ml酶液×总体积(m1)比活力=活力单位数/mg蛋白(氮)=总活力单位数/总蛋白(氮)mg纯化倍数=每次比活力/第一次比活力回收率(产率)=每次总活力/第一次总活力×100%第66页,课件共72页,创作于2023年2月二、酶活性测定(一)、酶活性1.酶活性或酶活力(Enzymeactivity):在最适条件下(25C,最适底物浓度和最适pH),酶催化一定化学反应的能力,以酶促反应速度表示。第67页,课件共72页,创作于2023年2
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