遗传的制作和基因定位专家讲座

4.5细菌遗传分析与基因定位4.5.1细菌转化和基因定位转化：指一些细菌能经过其细胞膜摄取周围供体染色体片段，将另外源DNA片段经过重组加入自己染色体组过程。1928年，格里费斯(GriffithF.)在肺炎双球菌中发觉转化现象。1944年，阿委瑞(AveryO.T.)成功地进行了肺炎双球菌转化试验；证实遗传物质是DNA；转化是细菌交换基因方法之一。遗传的制作和基因定位专家讲座第1页

细菌中大部分转化工作是用下面三种细菌完成：肺炎双球菌，枯草杆菌和流感嗜血杆菌。转化主要分为二个步骤进行:(一)供体DNA与受体细胞间接触与互作肺炎双球菌转化：DNA片断最少有800个碱基对；枯草杆菌转化：DNA片断最少有16000个碱基对。转化第一步是使转化DNA与受体细菌间成功地相互作用，这包含：转化片段大小、形态、浓度和受体细胞生理状态。

①.转化片断大小：遗传的制作和基因定位专家讲座第2页②.供体DNA分子存在数目：对特定基因来说，供体DNA分子数目与成功转化相关。链霉素抗性基因转化：在每个细胞含有10个DNA分子之前，抗性转化体数目一直与DNA分子存在数目成正比。原因：在细菌细胞壁或细胞膜上有固定数量DNA接收座位，故普通细菌摄取DNA分子数小于10个。③．受体生理状态：受体细胞必须在生理上处于感受态。这种感受态只能发生在细菌生长周期某一时间范围内，在感受态内，活跃合成蛋白质细菌细胞壁多少发生改变而易于接收转化DNA。遗传的制作和基因定位专家讲座第3页㈡、转化DNA摄取和整合过程：细菌中转化，包含供体DNA结合与穿入，联会和整合。当细菌处于感受态时，外源双链DNA分子可结合在受体细胞表面接收座位上。细菌在摄取外源DNA时，由DNA移位酶降解其中一条链，并利用降解这条链产生能量，将另一条链拉进细胞中。

①.结合与穿入：供体单链DNA片段一旦进入细胞，按各个不一样位点与其对应受体DNA片段联会。

②.联会：单链转化DNA经过与受体DNA对应位点置换从而稳定地参入到受体DNA中。③．整合(重组)：遗传的制作和基因定位专家讲座第4页遗传的制作和基因定位专家讲座第5页(三)转化和基因重组作图比如：黎德伯格等用枯草杆菌进行转化和重组试验DNA片段进入受体细胞之后，可与受体染色体发生重组。紧密连锁两个基因有较多机会包含在同一个DNA片段中，并同时整合到受体染色体中。遗传的制作和基因定位专家讲座第6页遗传的制作和基因定位专家讲座第7页Trp2his2tyr1<-----------34-----------><----13-------><--------------------40--------------------->三者并发转化频率最高，故这3个基因是连锁，其中his2和tyr1连锁紧密：单交换时，染色体开环易降解，故不存在单交换类型；只有双交换和偶数多交换才有效。遗传的制作和基因定位专家讲座第8页4.5.2细菌接合和基因定位1.接合：是指原核生物遗传物质从供体(donor)转移到受体(receptor)内过程。特点：需经过细胞直接接触。遗传的制作和基因定位专家讲座第9页B菌株：Met+bio+thr-leu-，需加苏氨酸和亮氨酸。不一样营养缺点型大肠杆菌：A菌株：Met-bio-thr+leu+，需加甲硫氨酸和生物素。4.5.2.1黎德伯格和塔特姆（1946年）：A菌株和B菌株营养缺点型，不能在基本培养上生长。A+B菌株混合培养，在完全培养基上，几小时后离心，涂布基本培养,长出原养型(Met+bio+thr+leu+)菌落。遗传的制作和基因定位专家讲座第10页这种原养型细胞怎样出现？转化？细胞间直接接触而发生遗传物质交换和重组?A、B菌株分别培养在基本培养基上

一边加压和吸引使培养液充分混合

结果任何一臂培养基上均未长出原养型细菌。∴直接接触(接合)是原养型细胞出现必要条件。大分子可经过，细菌不能经过Hayes(1952)试验证实：接合过程是一个单向转移，A菌株遗传物质

B菌株，从供体“donor”到受体“receptor”。遗传的制作和基因定位专家讲座第11页⑴．F因子：致育因子(性因子)，是一个附加体。携带F因子菌株称为供体菌或雄性，用F＋表示。未携带F因子菌株为受体菌或雌性，用F－表示。5.4.2.2细菌遗传物质转移是单向⑵．F因子组成：染色体外遗传物质，环状DNA；

40-60个蛋白质基因；2-4个/细胞(雄性内)。

遗传的制作和基因定位专家讲座第12页4.5.2.3F因子三种状态：以大肠杆菌为例：②．一个自主状态F因子，即F＋；

③．带有一个整合F因子细胞叫高频重组细胞，Hfr细胞。①．没有F因子，即F－；遗传的制作和基因定位专家讲座第13页⑷．自主状态时F因子独立进行分裂。F＋×F－：先形成接合管，F因子DNA边转移边复制，F－细胞

F＋细胞。遗传的制作和基因定位专家讲座第14页F因子整合到细菌染色体上(F＋

Hfr细胞)，其繁殖与细菌染色体同时进行。此时，细菌基因重组频率增加4倍以上，所以染色体上整合有F因子菌株，称为Hfr菌株。㈡、Hfr细胞形成及染色体转移：遗传的制作和基因定位专家讲座第15页细菌染色体由一小段单链F因子为前导而转移到F-受体

边进入边合成。普通情况下仅小部分细菌染色体能够转入，接合中止

受体细胞仍为F－，F因子仍留在供体内。遗传的制作和基因定位专家讲座第16页部分二倍体中发生交换:单数交换：打开环状染色体，产生一个线性染色体，这种细胞是不能成活。偶数交换：产生可遗传重组体和片段。部分二倍体：当F＋或Hfr细菌染色体进入F－后，在一个短时期内，F－细胞内一些位点就会成为二倍体DNA。遗传的制作和基因定位专家讲座第17页4.5.2.5中止杂交作图中止杂交：就是将两个菌株（比如Hfra+strs×F-a-

strr）在培养液中进行通风培养，每隔一定时间取样，把菌液放入组织捣碎器里搅拌以中止杂交，经过稀释接种到判别培养基上，待形成菌落后判定它们基因型。

遗传的制作和基因定位专家讲座第18页1955年Wollman和Jacob首次进行中止杂交试验：供体菌：HfrHstrsthr+leu+azistonslac+gal+受体菌：F-

strrthr‑leu-azirtonrlac-gal-将大约10倍F-菌与Hfr对数期菌混合，轻轻振荡培养在不一样时间间隔取样，然后在组织搅拌中猛烈振荡,中止杂交振荡后培养物涂布于加了链霉素基本培养基上筛选不一样于两个亲本thr+leu+strr重组子再对每一个重组子非选择性标识azitonlacgal

进行测定。

azi：叠氮化钠抗性，ton：噬菌体T1抗性中止杂交试验过程遗传的制作和基因定位专家讲座第19页遗传的制作和基因定位专家讲座第20页中止杂交试验结果遗传的制作和基因定位专家讲座第21页遗传的制作和基因定位专家讲座第22页（1）不一样非选择标识进入受体且重组时间不一样，但都是稳定；（2）各基因重组频率伴随时间增加而增加，直至极值；（3）按时间次序，先重组和后重组基因，重组率极值在逐步降低；遗传的制作和基因定位专家讲座第23页该方法主要依据基因转移先后次序，以时间为单位，求基因间遗传距离。利用中止杂交试验作图遗传的制作和基因定位专家讲座第24页

大肠杆菌染色体是环形不一样Hfr菌株进行中止杂交试验，基因转移次序、起点和转移方向各不相同。推断大肠杆菌染色体为环形，而F因子在细菌染色体上有许多插入位点，且插入方向不一样。HfrH othrazilactsxgaltrpmalxylmetBthiFCotsxlacazithrthimetBxylmaltrpgalFJ4othimetBxylmaltrpgaltsxlacazithrFP72ometBthithrazilactsxgaltrpmalxylFTrpmalGalxyltsxmetBlacthi

azithrCP72HJ4遗传的制作和基因定位专家讲座第25页细菌染色体为环状遗传的制作和基因定位专家讲座第26页当转移时间间隔在两分钟之内，如已知lac与ade紧密连锁，距离约为1分钟，中止杂交作图就不可靠，须用传统重组作图(recombinationmapping)。

紫红色菌落：lac+ade+780（亲本型）白色或粉红色菌落：lac-

ade+220（重组型）Hfr:lac+ade+strsXF-:lac-ade-strr

混合60min

F-：ade+strr

1000

MM+str影印EMB五、重组作图二个基因紧密连锁:lac-：乳糖不发酵ade-：腺嘌呤缺点型遗传的制作和基因定位专家讲座第27页1、重组子产生lac-ade+strrlac+ade+strrlac+ade+strslac-ade-strrlac-ade-strslac+ade+strslac-ade-strrlac+ade-strs遗传的制作和基因定位专家讲座第28页

2、重组频率计算1分钟相当于20%重组值，即：1min=20cMRFlac-ade=*100%lac-ade+lac+ade++lac-ade+

=*100%=22%=22cM2201000遗传的制作和基因定位专家讲座第29页3、大肠杆菌遗传图谱图距单位：分钟总长度：100分钟起点（0分钟）：thr座位大肠杆菌环形遗传学图遗传的制作和基因定位专家讲座第30页遗传的制作和基因定位专家讲座第31页4.5.3细菌转导和作画1.定义：以噬菌体为媒介所进行细菌遗传物质重组过程，称转导。2.发觉●Lederbery及其硕士Zinder（1951）首先在鼠伤寒沙门氏菌（Salmenellatyphimurium）中发觉转导现象。

●发觉过程他们用苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸营养缺点型鼠伤寒沙门氏菌和甲硫氨酸、组氨酸营养缺点型鼠伤寒沙门氏菌共同培养，相当让两种不一样缺点型菌杂交。杂交过程和结果以下：

遗传的制作和基因定位专家讲座第32页

LT22phe-try-tyr-

×

LT2met-his-

（苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸）

（甲硫氨酸、组氨酸）营养缺点型↓

营养缺点型

原养型菌落（即出现个别正常型细菌）

那么这些原养型菌落出现是由接合引发？还是由转化引发？他们先进行U形管试验（P159），结果在LT22一臂取得原养型菌株，由此推测可能有一个可经过滤膜过滤性因子（FA）在起作用。深入利用DNA酶处理，结果FA不受DNA酶影响，从而消除了转化作用可能性。最终认为FA是一个噬菌体，发觉了转导。遗传的制作和基因定位专家讲座第33页遗传的制作和基因定位专家讲座第34页3.转导机制转导是在噬菌体包装中因为错误将细菌染色体片段包装进去成为内含细菌染色体片段“假噬菌体”而发生。详细过程以下：

（1）噬菌体侵染细菌。（2）噬菌体DNA使细菌染色体形成片段，合成噬菌体DNA和外壳。（3）新噬菌体包装，偶然将细菌染色体片段也包装进去成为内含细菌染色体片段“假噬菌体”。“假噬菌体”和真噬菌体一起释放出来。

遗传的制作和基因定位专家讲座第35页（4）“假噬菌体”和真噬菌体一样可再侵染细菌，其中“假噬菌体”侵染时，就将外来细菌基因注入，经过基因重组改变遗传性状，完成转导过程。当前依据转导机制，已广泛应用在体外包装“假噬菌体”，即将外源基因导入“假噬菌体”中，再侵染细菌，进行基因表示研究。遗传的制作和基因定位专家讲座第36页1.普遍性转导

普遍性转导：指P1、P22等能够转导沙门氏菌染色体组任何不一样部分。假如两个基因一直是一起转导或同时转导（共转导或并发转导）频率较高，那么证实两基因连锁，而且频率越高，则两基因距离越近。如：a基因和b基因共转导频率高，a和c共转导频率也高，b和c共转导频率低，则3个基因次序为bac遗传的制作和基因定位专家讲座第37页遗传的制作和基因定位专家讲座第38页若同时观察3因子转导分析，则只做一次试验就可推出其次序。举例：利用普遍性转导测知leu，thr，azi三个基因次序。方法：（1）用噬菌体P1侵染带leu+，thr+和azi+大肠杆菌。（2）用从该大肠杆菌释放出来噬菌体，再侵染leu-、thr-和azi-大肠杆菌。遗传的制作和基因定位专家讲座第39页

(3)把受体菌接种到不含thr选择培养基上对thr+进行选择，凡具thr+细菌都可生长，把此菌接种到其它培养基上，结果在选出thr+重组子只有3%leu+，但无一个同时也是azi+。若选择leu+重组子，则约有50%同时也是azi+，所以3基因次序应为thr+leu+azi+。P165遗传的制作和基因定位专家讲座第40页遗传的制作和基因定位专家讲座第41页遗传的制作和基因定位专家讲座第42页遗传的制作和基因定位专家讲座第43页遗传的制作和基因定位专家讲座第44页2.特异性（不足）转导１概念：只能转移细菌染色体特定部分基因转导.2不足转导过程3转导机制:是因为噬菌体在细菌染色体特定位点上整合。4低频转导与高频转导

噬菌体

↓感染供体菌→裂解液(转导噬菌体)→非溶源

(溶源菌)

(10-6)

性细菌溶源性转导子重组性转导子低频转导：指溶源性细菌经诱导所释放噬菌体所

进行转导.遗传的制作和基因定位