新喹诺酮类抗菌药巴洛沙星的体内体外抗菌作用

新喹诺酮类药物巴洛沙星的体外、体内抗菌作用本文以氧氟沙星（OFLX），环丙沙星（CPFX），托氟沙星（TFLX），司帕沙星（SPFX）以及洛美沙星（LFLX）作为对照药，对哇诺酮类广谱抗菌药巴洛沙星（BLFX）的体外及体内抗菌作用进行了考察。BLFX在体外药物敏感性实验中，对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均显示出广谱抗菌作用，特别是对临床分离耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA的MIC9°值为8.0ug/ml，效果良好，该值是SPFXMIC90值的1/2。BLFX对临床分离的甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肺炎链球菌以及化脓链球菌的MIC9°值分别是：0.25,<0.063,<0.063及0.125pg/ml这些值均小于CPFX和LFLX各值的1/2，和SPFX及TFLX各值相当。BLFX对于其它革兰氏阴性菌的MIC值是其他哇诺酮类对照药的2至4倍。在小鼠全身感染模型实验中BLFX显示出良好的体外抗菌效果。在使用肺炎球菌TMS-3致小鼠呼吸道感染（肺炎模型）实验中，BLFX显示出与SPFX与TFLX同等优良的疗效。另外，在使用大肠杆菌致小鼠上行性尿路感染（肾炎模型）实验中，BLFX显示出与OFLX同等的治疗小果。对小鼠以50mg/kg经口给药后，血清、肺部、肾内最高浓度分别为3.35+0.95pg/ml（给药后15min）,9.57±2.67|Jg/ml（给药后15min）,11.64±2.43pg/ml（给药后30min）。关键词：巴洛沙星，哇诺酮类，体外抗菌活性，体内抗菌活性，体内过程近年来，以诺氟沙星，依诺沙星，氧氟沙星（OFLX），环丙沙星（CPFX）以及洛美沙星（LFLX）为代表的具有广谱抗菌活性的众多哇诺酮类抗生素不断的被研制开发出来，并被广泛的应用于临床。但是众所周知，在临床使用中，这些哇诺酮类抗生素均具有多种副作用，其中包括可能诱发严重的光过敏症。由中外制药研制开发的巴洛沙星（BLFX），是一种具有1-环丙基-6-氟代甲基-1，4-二氢-8-甲氧基-7-（3-甲基-氨基哌啶）-4-氧哇琳-3-羧酸结构的新型诺酮类抗菌药。该药对由紫外线照射引起的光过敏症极其稳定。并且有报道称，该药对健康受试者安全性良好，具有临床上推广使用的价值。在此基础上，我们以明确BLFX的抗菌活性为目的，进行了其体外以及体内研究。以CPFX，LFLX，OFLX，司帕沙星（SPFX）以及洛美沙星（LFLX）作为对照药，得到了BLFX的药效评价实验结果。、试验材料与方法1、使用的抗菌药BLFX使用中外制药合成的粉末，OFLX（第一制药），CPFX（贝耶尔制药），TFLX（富山化学），LFLX（北陆制药）以及SPFX（大本日制药）分别使用由各公司（括弧内表示的）提供的实验用粉末。2、 试验菌株本研究使用从1985年至1991年期间在日本各地的相关机构分离，且在本实验室冰冻保存的临床分离株。3、 最低抑菌浓度（MIC）测定采用微量液体稀释法（以“化学治疗学会”所规定的标准为基准）测定各药物对临床分离株的MIC。各实验菌株均使用马-欣二氏琼脂培养基（MHA，DIFCO公司），在35°C下培养一夜。另外，对一部分菌种，在MHA培养基中添加了对其发育适当的成分。各实验菌株在琼脂平板培养基上进行单独培养，挑选3至5个典型菌落混悬于灭菌的生理盐水中，使其浓度为108CFU/ml（相当于约0.5个麦氏单位）。非特别注明条件下，使用的敏感性测定培养基为添加了钙和镁的马-欣二氏肉汤培养基（MHB，DIFCO公司），并将上述菌液接种于此，使其浓度为105CFU/ml（相当于每管104CFU）。对肺炎球菌、化脓葡萄球菌以及卡塔莫拉氏菌的培养，使用了含有5%的马血清的马-欣二氏肉汤培养基。将各实验菌株于35C条件下培养18小时后，肉眼观察各药物的MIC结果，得出完全抑制菌株发育的最低药物浓度。使用金黄色葡萄球菌ATCC25923作为这些MIC值测定的精密度控制株（标准株）。根据情况的不同，有时也使用大肠杆菌ATCC25922。以下各菌种的MIC值测定均使用以“化学治疗学会”标准法为基准的琼脂平板稀释法进行测定。对流感嗜血杆菌和淋病萘瑟氏球菌的，使用含5%马血清的巧克力琼脂培养基（MHAbase），对二氧化碳嗜纤维菌，使用含5%马血清的血液琼脂培养基（MHAbase），对百日咳杆菌，使用含1%甘油和15%马血清的博-让二氏琼脂培养基，用于前期培养以及MIC值测定。各实验菌株均接种于培养基表面，使其浓度为104CFU/apot，在35C培养24小时后判定MIC。另外，对淋病萘瑟氏球菌和二氧化碳嗜纤维菌两种菌种，均在5%CO2浓度下培养48小时。在以上按照琼脂平板稀释法测定各菌种的MIC值时，以金葡菌ATCC25923为标准株。对于厌氧菌的MIC值测定，以GAM肉汤培养基做预培养，以GAM琼脂培养基做MIC值测定。这些培养，使用厌氧培养装置，在35C条件下培养48小时。同时以脆弱拟杆菌GM7000作为标准株。4、 小鼠感染实验中的治疗效果BLFX的体内药效评价采用小鼠全身感染模型，呼吸道感染模型以及尿道感染模型进行。另外，除在肺炎链球菌的培养中使用了血液琼脂培养基外，体内实验使用的菌株均使用马-欣二氏琼脂培养基，在35C条件下培养18小时。在全身感染实验中，实验菌株为5%粘蛋白悬浊液。而在局部感染实验中，为生理盐水悬浊液。1） 全身感染模型对每组6只（MRSA每组18只）的ICR系小鼠（捉4W）,将0.5ml的菌液接种于腹腔内。一小时后，分别灌胃给药不同浓度的BLFX、CPFX、TFLX、SPFX或OFLX。在实验中分别使用了SMITH金葡菌（56XLD50:半数致死量），MRSANo235（3.1XLD50）,肺炎链球菌TMS-3（5.6XLD50）,克雷白氏肺炎杆菌3K-25（56XLD50）,铜绿假单胞菌E7（56XLD50）,以及大肠杆菌C-11（240XLD50或56XLD50不添加粘蛋白接种）等菌株。感染5天后，首先检查小鼠的存活数量。然后采用范德瓦尔登法计算出各种药物的半数有效量（ED）。另外，没有给药的小鼠在各项感染实验中全部死亡。50另外，大肠杆菌的药物敏感性良好，极低浓度的给药量便可见治疗效果，因此算出的ed50值可能不正确。因此，通过不添加粘蛋白接种增加致死感染菌量，来增加需要的给药剂量。2） 呼吸道感染模型对一组6只白细胞减少的小鼠，用乙醚麻醉，经鼻腔感染肺炎链球菌TMS-3，剂量为7.0X106CFU/20M/鼠。在感染6小时、1天、2天后分别对其进行灌胃给药，药物分别为BLFX，OFLX，TFLX，SPFX及其溶剂（含有5%CMC的生理盐水），剂量分别按15mg/kg和45mg/kg。另外，对ICR系大鼠（A，4W）小鼠于感染前4天按250mg/kg腹腔给予环磷酰胺（CY,Sigma），制成白细胞小鼠，在即将给药前，再次以150mg/kg腹腔注射CY，测定试验期间白血球减少状态。感染3天后，深度乙醚麻醉，无菌条件下摘出小鼠两肺，加入2ml生理盐水。在玻璃匀浆机中进行匀化，然后用生理盐水对匀化液进行梯度稀释，再分别取各个悬浮液0.1ml接种于血液琼脂平板上，从而测定出肺中细菌数。本实验中的检测限为20CFU/lungs。3） 尿道感染模型使用禁水20小时的ICR系小鼠（A，4W），一组11只（溶剂对照组12只）。在乙醚轻度麻醉下，用装有结核菌素的聚乙二醇导管注射器，经尿道将大肠杆菌TMS-3以1.1X106CFU/50M/鼠接种于小鼠膀胱内。接种后立刻用小夹夹住尿道口，1小时后，放开尿道口，并给水。早期感染的第1日和第2日，分别以1mg/鼠的剂量灌胃给药BLFX，OFLX，SPFX及其溶剂，在感染的第3日，采用与呼吸道感染相同的方法摘出两肾，进行匀化处理。然后，测定出肾中的细菌数。肾内细菌数的测定采用MHA平板培养基。本实验对照组小鼠中，5只未检测出细菌。我们认为是由于细菌从体内被自然排泄。因此，每组按检出菌数由少至多的顺序除去5只，采用余下6只小鼠（溶剂对照组是由多至少的顺序）的数值进行比较分析。在BLFX和OFLX的给药量比较实验中，使用小鼠每组11只。采用了与上述相同的方法，接种剂量为3.6X107CFU/50M/鼠。在感染8小时，第1天，第2天，分别对其灌胃给药BLFX和OFLX或其溶剂（对照组），剂量为0.4，0.8，1.6和3.2ml每只，在感染第3天后，采用与上述相同的方法，在麦科恩奇琼脂培养基上检测出肾内的细菌数。5、小鼠体内过程实验对每组5只的ICR系小鼠（A，4W）进行灌胃给药，分别给药50mg/kg的BLFX和作为兑照的其他喹诺酮类抗生素。在给药15分钟，30分钟，1小时，2小时和4小时后，乙醚麻醉，采血，离心分离，得到血清样本。另外，采血后，迅速摘出两肺和两肾，先用生理盐水小心洗净，然后均加入2ml生理盐水，进行匀化。匀化之后，离心分离，得到上清夜。血清和匀化的上清夜样本均保存在-70°C条件下，第三天采用生物测定法测定样品中的药物浓度。作为鉴定菌株，对BLFX和TFLX使用了枯草芽孢杆菌ATCC6633，对CPFX和OFLX使用了大肠杆菌，对LFLX使用了大肠杆菌NIHJJC-2。这些药物的鉴定灵敏度分别如下：BLFX：0.56网/ml，TFLX：0.45网/ml，CPFX：0.03网/ml，OFLX：0.0卯g/ml，LFLX：0.40^g/ml。6、数据分析采用多重比较的方法进行统计。在呼吸道感染实验中，采用了DUNNETTt-检验法，在尿道感染实验中，采用STUDENTt-检验法及Turkey检验法来确定显著性差异。二、实验结果1、抗菌活性BLFX、CPFX、LFLX、OFLX、SPFX以及TFLX对于临床分离的革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的抗菌活性如Table1所示。BLFX对MSSA的MIC90值为0.25网/ml。该值是OFLX，CPFX以及LFLMIC90值的1/4，是TFLX和SPFX的MIC90值的2倍。BLFX对本实验中使用的MRSA（甲氧西林的MIC值N50网/ml）的MIC90值为8.0网/ml，是对照喹诺酮类药物中最小的。BLFX对表皮葡萄球菌的MIC9」直W0.063网/ml，该值是OFLX和CPFX和LFLX的MIC90值的1/4至1/16，但是与TFLX和SPFX的MIC90值相同。BLFX对于肺炎链球菌的MIC9°值W0.063网/ml，在对照药物中显示出最强的抗菌活性。BLFX对于化脓链球菌的MIC90值为0.125网/ml，分别是CPFX，OFLX和LFLXMIC90值的1/2至1/32，但却是TFLXMIC90值的2倍以上。BLFX对于粪肠球菌和屎肠球菌的MIC90值均为4.0网/ml，对于屎肠球菌的MIC90为对照喹诺酮类抗生素中最小值。BLFX对于大肠杆菌的MIC90值为0.25网/ml，对克雷白肺炎菌的MIC”值为1.0网/ml，对奇异变形杆菌的MIC90值为2.0网/ml，对普通变形杆菌|BIC90值为1.0网/ml，对雷氏普罗威登斯菌iBIC”值为2.0网/ml，对斯氏普罗威登斯菌的MIC值为1.0网/ml，对粘质沙雷菌的MIC值为16网/ml，对阴沟90 90肠杆菌的MIC90值为0.5网/ml，对产气肠杆菌的MIC90值为4.0网/ml，对弗氏柠檬酸杆菌的MIC9。值为2.0网/ml。这些数值均等于或高于作为对照的喹诺酮类抗生素的MIC”值32倍以上。BLFX对铜绿假单胞菌的MIC90值与OFLX，TFLX和LFLX相当，均大于128网/ml。但是MIC50值为8.0网/ml，是作为对照的喹诺酮类抗生素的8至32倍。BLFX对下列细菌的MIC值分别为：西巴杆90菌2.0网/ml，嗜麦芽黄单包菌属8.0网/ml，醋酸钙不动杆菌0.125网/ml，卡他莫拉菌0.125网/ml。这些数值虽然与OFLX,CPFX和LFLX的MIC90值相当，但却是SPFX及TFLX的MIC90值的4至8倍。BLFX对流感嗜血杆菌和百日咳杆菌的MIC9"直分别为0.10网/ml和0.20网/ml。BLFX对产酶或不产青霉素酶的淋病奈瑟菌的MIC90值均为0.mg/mlo该值虽然是LFLX的MIC90值的1/2，但却是CPFX、TFLX和SPFX的MIC90值的2至8倍。BLFX对于二氧化碳嗜纤维菌的MIC90值是0.78网/ml,该值虽然是CPFX、TFLX和SPFX的MIC90值的2至8倍，但却与OFLX和LFLX的MIC90值相同。BLFX对于艰难梭菌和脆弱拟杆菌的MIC90值均是25网/ml,该值在作为对照的喹诺酮类抗生素中是一个平均值。2、 BLFX对小鼠全身感染的治疗效果BLFX和作为对照的喹诺酮类抗生素对小鼠全身感染模型的治疗效果如Table2所示。BLFX在MSSASMITH感染中的ED50值为0.100mg/鼠。该值与TFLX几乎相等，但却是OFLX、CPFX和LFLX的1/2至1/2.5oBLFX在MRSANo235（MIC值>100网/ml）感染中的ED50值为0.400mg/鼠。但是其他对照喹诺酮类抗生素的ED50值均在3.200mg/鼠以上或者更高，所以无法算出。BLFX在肺炎链球菌TMS-3感染中的ED5°值为0.200mg/鼠。该值虽然是OFLX、CPFX和LFLX的1/3至1/4，但却比TFLX高出约5倍。在革兰氏阴性菌肺炎克雷伯菌3K-25，铜绿假单胞菌E7和大肠杆菌C-11的感染实验中BLFX的ED50值分别为3.200，0.635和0.00785mg/鼠（或0.100mg/鼠，不添加粘液素），这些数值都高于对照的喹诺酮类抗生素。3、 BLFX对小鼠呼吸道感染的治疗效果BLFX、TFLX、SPFX以及OFLX在使用了肺炎链球菌TMS-3的小鼠呼吸道感染模型中的治疗效果如Table3所示。在本实验中，溶剂对照组在感染三日 后，其肺内细菌数为 8、36土0、54log10CFU/LungSo这时BLFX、TFLX、SPFX的45mg/kg给药组的肺内生物细菌数分别为5.27±2.63,2.65±2.09,4.38±2.27log10CFU/Lungs。通过与对照组相比，可以确定其细菌数均有明显降低（P<0、05,Dannett的t-检验，在BLFX和TFLX之间也发现了明显差异）。这三种药品虽然在15mg/kg给药组中没有发现明显差异，而与对照组比较，其肺内细菌数减少了。另外，结果中虽未表示，但这三种药品在5mg/kg给药组中的肺内细菌数与对照组几乎没有差异。由此可以确认BLFX在本呼吸道感染实验中显示出与TFLX、SPFX相同的剂量依赖性的肺内细菌数减少效果。而另一方面，OFLX的45mg/kg给药组（78±0.75log10CFU/Lungs），与对照组比较，也没有发现有明显的肺内细菌数减少效果。4、 BLFX对小鼠尿道感染的治疗效果对BLFX、OFLX、CPFX的50mg/kg给药组在使用大肠杆菌TMS-3大鼠尿道感染模型中的感染治疗效果进行了调查，其结果为，感染3日后的BLFX、OFLX、CPFX50mg/kg给药组和溶剂对照组的小鼠肾脏内细菌数分别为3.25+2.04,2.47+1.62,4.38+1.47,5.42±2.07logioCFU/Kidneys。与溶剂对照组相比，OFLX给药组显示出肾脏内细菌数明显减少（P<0.05,Student的t-检验）。BLFX的给药组也显示出了细菌数降低的趋势（P<0.10,Student的t-检验）。而CPFX的给药组中细菌数的降低，在统计学意义上，并没有明显的差异。依据该结果，使用BLFX和OFLX进行了给药量比较研究实验，其结果如Table4所示。在本实验中，两药均以80mg/kg和160mg/kg剂量给药，与对照组比较，显示出明显肾脏内细菌数减少的效果（P<0.05,Turkey检验）。另外在同一给药量情况下，对于肾脏内细菌数，相对于OFLX给药组BLFX给药组显示出偏高的倾向。但是在两药之间，没有发现明显的统计学差异（Turkey检验）。5、BLFX的体内过程在血清中，50mg/kg灌胃给药时BLFX和对照组药品在肺内和肾脏中浓度以及其变化情况如图5所示。BLFX在血清，肺内和肾脏中的峰浓度分别为3.35±0.95网/ml（给药后15分钟），9.57±2.67网/g（给药后15分钟），11.46+2.43网/g（给药30分钟后）。其峰值虽然比OFLX和LFLX低，但是却比CPFX和TFLX高。而且，BLFX在血清中，肺内和肾脏中到达峰值的时间比OFLX和CPFX短。给药四小时后BLFX,OFLX和CPFX的肾脏内浓度分别为4.92±1.24网/g,2.24+1.18网/g和0.70±0.14Vg/g。三、考察本实验主要通过使用微量液体稀释法，评价BLFX体外抗菌活性，确定了其对临床分离革兰氏阳性菌的良好抗菌活性，远大于原有喹诺酮类抗生素。尽管BLFX对MSSA的抗菌活性与SPFX和TFLX相当，但对MRSA的抗菌活性较TFLX和SPFX更好。，是对照药中最好的。关于BLFX对MSSA和MRSA的抗菌活性的不同点，Ito等通过琼脂平板培养法进行考察，但其机理仍不清楚。最近有通过使用CCCP（mchlorophenylhydrazone）的实验表明，BLFX在MRSA中的衰减水平比在MSSA中衰减水平高。另外，Ito等使用BLFX和原有喹诺酮类抗生素，就对来自FDA209P金黄色葡萄球菌的DNA旋转酶抑制活性（IC50）和对FDA209P金黄色葡萄球菌抗菌活性（MIC）之间的关系进行了考察，但是最终未能确认两者之间有相关性。由此可见，BLFX在MRSA中的衰减水平比作为对照的喹诺酮类抗生素低。其结果是菌体内BLF