分子生物学基因治疗

关于分子生物学基因治疗第1页，课件共45页，创作于2023年2月一、基因治疗的概念1990人类第一例基因治疗获得成功1966年，Lederberg提出基因治疗概念基因治疗(genetherapy)：将正常基因植入靶细胞代替遗传缺陷的基因,或关闭、抑制异常表达的基因，以达到预防和治疗疾病的一种临床治疗技术。人类疾病治疗的重大突破!与传统的方法相比较，从根本上消除遗传病因。第2页，课件共45页，创作于2023年2月二、基因治疗类型和途径生殖细胞基因治疗(germinalgenethrapy)体外（exvivo）间接基因治疗

体细胞基因治疗(somaticgenethrapy)1、类型2、途径

体内（invivo）直接基因治疗第3页，课件共45页，创作于2023年2月1、基因矫正：原位修复缺陷基因原位替换（同源重组）2、基因添加：正常基因非特异插入基因组以补偿异常基因的功能缺陷3、基因失活：抑制、关闭异常表达的基因矫正突变三、基因治疗的策略4、重新开放已关闭的基因第4页，课件共45页，创作于2023年2月四、基因治疗的方法（一）体细胞的基因治疗方法

2、受体细胞的选择3、将治疗转移到受体细胞内4、将带有目的基因的细胞重新输回体内体外基因治疗时（二）反义技术（antisensetechnology)（三）RNA干扰（shortinterferenceRNA)1、治疗基因的制备第5页，课件共45页，创作于2023年2月五、基因治疗的现状1、一些单基因病的治疗

严重复合免疫缺陷症（ADA综合症）、血友病B、囊性纤维化（CF），苯丙酮尿症等2、Bata-地中海贫血病别醇嘌呤重新开放r基因3、多基因病心血管疾病，糖尿病、神经系统疾病等4、肿瘤5、其它疾病：HIV第6页，课件共45页，创作于2023年2月六、基因治疗的问题、前景问题：1、稳定性2、安全性3、导入基因的高效表达4、免疫性5、伦理问题

前景：十分有潜力的技术，有深远的意义

“基因治疗作为一项新的治疗技术，将不只限于遗传病和肿瘤的治疗，在可见的将来，它将是临床上多种疾病可选择的治疗方法。”

第7页，课件共45页，创作于2023年2月应用腺苷脱氨酶基因ADA，经逆转录病毒载体导入严重复合免疫缺陷症（SCID）第8页，课件共45页，创作于2023年2月遗传病的常规治疗（一）外科治疗矫正畸形、组织和器官移植（二）内科治疗用药物及饮食治疗

1、禁其所忌酶缺乏不能对底物进行正常代谢的遗传病。

2、去其所余酶缺乏使体内贮存过多的“毒物”所致的遗传病

促排泄剂或螯合剂、换血或血浆过滤等

3、补其不足由于基因缺陷使体内缺乏某种酶和蛋白质而导致功能丧失的遗传病。第9页，课件共45页，创作于2023年2月第10页，课件共45页，创作于2023年2月第11页，课件共45页，创作于2023年2月ACGTCGGTACGTCGCTTTGCAGCCATGCAGCGAAACGTCGGTGCGTCGCTTTGCAGCCACGCAGCGAACGTCGGTACGTCGCTTTGCAGCCATGCAGCGAA突变基因原位修复突变修复第12页，课件共45页，创作于2023年2月带异常基因的染色体DNA分子带正常基因的外源同源片段同源重组过程第13页，课件共45页，创作于2023年2月添加正常基因第14页，课件共45页，创作于2023年2月使γ重新表达，形成HbF,HbF代偿HbA的功能。第15页，课件共45页，创作于2023年2月目的基因的制备方法1、从基因组中分离2、化学合成3、用mRNA逆转录合成cDNA4、从基因文库中筛选5、PCR合成第16页，课件共45页，创作于2023年2月受体细胞的选择

选择受体细胞的原则：

1、易于从人体分离又便于输回体内2、易于接受外源的遗传物质3、能够分裂，生命周期长4、患病的器官或部位。常用的受体细胞：骨髓干细胞皮肤纤纬细胞血管内皮细胞肝细胞淋巴细胞第17页，课件共45页，创作于2023年2月治疗基因的转移方法3、腺相关病毒(Adeno-AssociatedVirus,AAV)4、单疱疹病毒(Herpessimplexviruses,HSV)化学法磷酸钙共沉淀物理法微粒轰击、电穿孔法、显微注射脂质体法生物法将病毒（virus)改造成缺陷病毒载体1、逆转录病毒载体（

Retroviruses)2、腺病毒介导的基因转移（Adenoviruses）第18页，课件共45页，创作于2023年2月脂质体法优点：易大量制备无致病性细胞类型多治疗过程可控缺点：转化效率不高血循中快速清除(肝巨噬细胞)第19页，课件共45页，创作于2023年2月第20页，课件共45页，创作于2023年2月逆转录病毒的改造第21页，课件共45页，创作于2023年2月逆转录病毒感染细胞过程第22页，课件共45页，创作于2023年2月逆转录介导基因转移的优缺点优点：1、能高效率的感染宿主细胞（100%）2、其宿主范围广泛，包括来自不同种的生物和细胞类型3、被整合的基因在宿主基因组中稳定表达4、用复制缺陷的重组逆转录病毒感染，毒性小缺点：1、只能感染分裂细胞2、其外源DNA的容量太小3、安全性问题（激活癌基因的潜在性）第23页，课件共45页，创作于2023年2月腺病毒感染细胞的过程第24页，课件共45页，创作于2023年2月腺病毒介导基因转移的优缺点优点：1、具有较广的宿主范围，能感染除造血细胞以外的几乎所有细胞2、可以感染分裂及非分裂细胞3、能高效地感染宿主细胞4、外源基因容量大5、安全性较高（不引起癌基因激活）缺点：1、技术上需进一步改进2、不整合到人类基因组腺病毒是基因治疗载体的发展方向。第25页，课件共45页，创作于2023年2月1、野生型的AAV为非病原性，其安全性高2、AAV病毒颗粒的物理化学性质较为稳定3、应用宿主范围较广，使用于分裂及非分裂细胞4、可整合入宿主染色体上，可长期表达目的蛋白腺相关病毒载体优点：缺点：重组AAV的制作较为繁杂、效率低，滴度低第26页，课件共45页，创作于2023年2月单疱疹病毒载体优点

具有对神经元的特异的亲和力可插入的基因片段容量很大，可达40-50kb缺点

对细胞有较大的毒性第27页，课件共45页，创作于2023年2月反义技术

反义技术（antisensetechnology)也称反义寡核苷酸,是指利用人工合成的反义RNA或反义DNA来阻断基因的转录或翻译，控制细胞生长的中间阶段，使基因不能转录或翻译，因而不能合成蛋白质，以达到治疗某中疾病的目的。(1)将cDNA导入基因组中，转录得反义RNA(2)直接输入反义寡核苷酸二、反义基因技术（阻断转录）类型：1、反义RNA技术（阻断翻译）第28页，课件共45页，创作于2023年2月

第29页，课件共45页，创作于2023年2月

第30页，课件共45页，创作于2023年2月转录阻断反基因技术示意图第31页，课件共45页，创作于2023年2月第32页，课件共45页，创作于2023年2月正常细胞(无细胞毒性)胞嘧啶脱氨酶基因erbB-2启动子5-FC5-FC5-FU

(细胞毒性)肿瘤细胞肿瘤特异性高表达因子药物靶向治疗肿瘤细胞死亡第33页，课件共45页，创作于2023年2月RNA干扰（RNAinterferenceRNAi)

2003年10大科学进展--第四(Science)正常生物体内一些小的双链RNA可以抑制特定基因表达的一种现象。当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的小双链RNA(doublestrandedRNA，dsRNA)时，可以通过促使该mRNA降解来高效、特异的阻断体内特定基因的表达，从而导致基因表达沉默的现象，这种现象发生在转录后水平，又称为转录后基因沉默(post-transcriptionalgenesilencing，PTGS)。这些小的双链RNA称为siRNA(Small/shortinterferingRNA，siRNA)。第34页，课件共45页，创作于2023年2月RISC:RNA-inducedsilencingcomplexRNA诱导沉默复合物第35页，课件共45页，创作于2023年2月RNAiingenetherapy第36页，课件共45页，创作于2023年2月基因治疗的现状-1第37页，课件共45页，创作于2023年2月基因治疗的现状-2第38页，课件共45页，创作于2023年2月基因治疗的现状-3第39页，课件共45页，创作于2023年2月基因治疗的现状-4第40页，课件共45页，创作于2023年2月基因治疗的现状-5第41页，课件共45页，创作于2023年2月基因治疗的现状-6第42页，课件共45页，创作于2023年2月HemophiliaB,FIXfunctionreduced,X-linkedMalestobleedaftercircumcision第一例临床实验——中国上海1995-1996年载体——AAV自体皮肤成纤维细胞两名血友病B患者(兄弟),先后治疗了四名患者FIX水平升高2倍并持续了1年以上2003年获得国家批准进行中国首次AAV基因治疗血友病B临床试验中国的基因治疗第43页，课件共45页，创作于2023年2月AAVbasedgenetherapyforhemophiliaB1.ViralgenesareremovedfromAAV2.AgeneforbloodclottingproteinFactorIXisplacedinsidetheemptyAAV3.TheFactor