体内药物分析方法的建立与验证

关于体内药物分析方法的建立与验证1第1页，课件共100页，创作于2023年2月2第一节

分析方法的设计依据

在建立分析方法之前，应充分利用现代科技成就和前人的研究成果，系统检索国内外的科技文献，对药物在生物体内的存在状况、药代动力学参数、分析检测方法等相关资料加以分析和研究，以供借鉴。对于尚无文献报道的药物，亦可参考同类药物的相关文献。

检索文献，可在最短时间、最小的花费（磨刀不误砍柴工）建立一个好的分析方法！这是试验前要做的第一件事！大四的同学们，你们查过文献吗？第2页，课件共100页，创作于2023年2月3血药浓度94-20085122篇第3页，课件共100页，创作于2023年2月4第4页，课件共100页，创作于2023年2月5第5页，课件共100页，创作于2023年2月61992年创刊的《中国临床药学杂志》

2001年第二军医大学长海医院主办的《药学服务与研究》两刊于2004年同时成为中国科技核心期刊

临床药学专业性的学术期刊有：第6页，课件共100页，创作于2023年2月7不想当将军的士兵不是好士兵

容量大的U盘：《中国临床药学杂志》、《药学服务与研究》中大量的相关文献拷贝下来

另外以“临床药学”、“临床药师”、“合理用药”、“药学监护”、“血药浓度”等为关键词，查找相关的文献，copy!看文献写论文提职称第7页，课件共100页，创作于2023年2月8这门课有两个实验，要求大家以论文的形式写实验报告！！实验一改进的柱前衍生-HPLC法测定丙戊酸钠的血药浓度由老师提供文献。看完文献后，考虑一个问题：该如何设计、优化实验条件？实验二姜黄素-PVP固体分散体在兔体内的药代动力学参数的测定大家到图书馆电子阅览室查阅文献！！！

关键词：姜黄素，血药浓度或：姜黄素，（药代）动力学

要看PDF文档，电脑要安装ADOBEREADER软件第8页，课件共100页，创作于2023年2月9一、待测药物的理化性质及体内存在状况

准确测定生物样品中的药物或其特定代谢物通过一定的生物样品预处理使待测物从结合物或缀合物中释放出来。故此，应首先考虑样品预处理方法 待测药物的理化性质 药物在生物体内的存在状况 药物在生物体内的生物转化(代谢)途径建立分析检测方法的主要依据有：第9页，课件共100页，创作于2023年2月10(一)待测药物的理化性质

药物的pKa值、亲脂性、溶解度、分配系数等—决定预处理方法及萃取方法 具有亲脂性—在适当的pH值下用溶剂萃取 具有强极性或亲水性—沉淀蛋白、固相萃取、离子对萃取或衍生化后萃取等 具有挥发性—GC测定法 具有光谱或电化学特性—分析检测方法 药物的稳定性—萃取浓缩技术 对酸碱不稳定—避免使用强酸或强碱性溶剂 对热不稳定—避免高温蒸发溶剂---一个例子第10页，课件共100页，创作于2023年2月11另一个“两弹一星”：拯救5亿人的“中国神药”

---青蒿素

疟疾是危害人类最大的疾病之一。全球每年疟疾病人超过5亿，死亡100万人以上。屠呦呦：古医书中有青蒿治疗疟疾的记录。起初青蒿的有机溶剂提取物对疟疾的抑制率很低，不甘愿，又翻出古医书：“青蒿一握，以水二升渍，绞取汁，尽服之。”和中药常用的煎熬法不同？原来里面用的是青蒿鲜汁！改用沸点较低的乙醚提取，抑制率达100%

温度！！！！第11页，课件共100页，创作于2023年2月12(二)待测药物的体内存在状态与血浆蛋白结合的强弱及结合率的高低

—决定分离萃取方法指标：提取回收率

蛋白结合较强（非极性强）—不宜直接采用溶剂萃取？有机溶剂没选对？吲哒帕胺、伪麻黄碱！体内浓度高低、代谢过程及其代谢产物

—决定分析检测技术

浓度较低（尤其有代谢产物共存）

—代谢产物的干扰与特定代谢产物的同时测定

—采用HPLC或LC-MS等分析检测技术第12页，课件共100页，创作于2023年2月13二、分析测定的目的与要求

体内药物分析的目的—影响分析方法的应用

药代动力学—研究药物在体内吸收、分布、代谢和排泄过程—血浆浓度随时间的变化过程；代谢途径及代谢产物

要求—同时测定原形药物和代谢产物

检测—宽线性范围(Cmax～Cmax的1/20，4-5半衰期)、高灵敏度(10-9g/ml)和高专属性(分离能力)(原形药物及其代谢产物的分离)

方法—不必强调方法的简便、快速，按SOP，大多采用色谱及其脱线或在线联用技术，如HPLC、LC-MS建立分析检测方法的主要依据有：第13页，课件共100页，创作于2023年2月14二、分析测定的目的与要求

临床治疗药物监测

药物浓度通常在有效治疗浓度范围附近

方法—尽量简便、易行；适用于长期、批量样品的测定，大多采用UV、RIA或EIA等。？

中毒患者的临床抢救

药物浓度极高

方法—不必强调方法的灵敏度，强调方法的特异性和分析速度

—大多采用色谱及其联用技术GC、GC-MS、RIA或EIA？第14页，课件共100页，创作于2023年2月15三、生物样品的类型与预处理方法

生物样品的类型与预处理方法—决定分析方法的应用

以血浆或血清为分析样品

采用蛋白沉淀、溶剂萃取预处理技术

—分析样品较为“干净”，可用HPLC检测

用RIA分析？FPIA法

—样品的预处理方法可较为粗放

—经过简单的蛋白沉淀或不经任何预处理直接测定第15页，课件共100页，创作于2023年2月16四、实验室条件

在设计体内药物分析方法时，还应充分考虑到实验室现有的或有可能在其它实验室使用的仪器装备，合理选择可行的分析方法。此外，还应从方法的可行性、每个样品测定耗时多少（10min）、操作的难易及技术要求及仪器、设备要求、费用多少等等方面加以考虑。第16页，课件共100页，创作于2023年2月17

在阿齐霉素制剂生物等效性研究过程中，血样中阿齐霉素的浓度范围为5ng/ml～1μg/ml

，其检测方法可采用HPLC法、LC-MS法和微生物法等数种方法。若用HPLC法来检测该样品，由于阿齐霉素的紫外吸收较弱，必须对样品进行富集浓缩，则样品的前处理方法采用液-液萃取法为佳；若用LC-MS法来检测该样品，则由于LC-MS仪器的灵敏度足以检测浓度为1ng/ml以上的样品，故样品的前处理只需采用蛋白沉淀法即可；若用微生物法来检测该样品，则样品连蛋白也不需沉淀，直接上样即可。

例子1第17页，课件共100页，创作于2023年2月18

当然，用LC-MS法来检测阿齐霉素时，有些分析上作者采用了液-液萃取法，也有另一些分析工作者采用了固相萃取法来处理血样，这些做法虽然行得通，但显然它们不但增加了样品处理的所需时间和工作量，而且增加了样品处理的成本，因此阿齐霉素的血样处理最好采用蛋白沉淀法。第18页，课件共100页，创作于2023年2月19

蛋白沉淀法中，高氯酸沉淀法、甲醇沉淀法、乙腈沉淀法是最常用的方法，但从样品的稳定性角度考虑，阿齐霉素遇酸不稳定，故只能采用甲醇沉淀法或乙腈沉淀法，考虑到乙腈沉淀蛋白效果优于甲醇，且该方法阿齐霉素的回收率较高，故阿齐霉素血浆样品的前处理方法以乙腈沉淀蛋白法为最佳。第19页，课件共100页，创作于2023年2月20

如果测定的是血清中头孢拉定的浓度，头孢拉定为β-内酰胺类抗生素，对酸稳定，且酸有利于头孢拉定的提取。蛋白沉淀法的选择就要采用高氯酸沉淀法了。----具体问题具体分析

----信息，查文献例子2第20页，课件共100页，创作于2023年2月21第二节分析方法

建立的一般步骤一、分析方法的选择二、分析方法的建立

(一)

检测条件的筛选

(二)分离条件的筛选第21页，课件共100页，创作于2023年2月22一、分析方法的选择

体内药物分析方法的设计受多种因素影响 生物样品中的药物浓度—决定分析方法的首要要因素 生物样品中药物或其特定代谢产物的浓度低、样品量少

—难以通过增加取样量提高方法灵敏度

—通过选择适当的分析方法适应样品分析需求。常用分析方法的检测限度及分离能力见表4-1第22页，课件共100页，创作于2023年2月23摘自:化学药物临床药代动力学研究技术指导原则二○○五年三月SFDA颁布（一）常用分析方法（1）色谱法：气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)、色谱－质谱联用法（LC－MS、LC-MS-MS，GC-MS，GC-MS-MS）等，可用于大多数药物的检测；（2）免疫学方法：放射免疫分析法、酶免疫分析法、荧光免疫分析法等，多用于蛋白质多肽类物质检测；（3）微生物学方法，可用于抗生素药物的测定。从目前发展看，生物样品的分析一般首选色谱法，如HPLC、GC法或LC－MS、GC－MS法，这类方法灵敏度、特异性、准确性一般都能适应临床药代动力学研究的需要，多数实验室也具备条件，因此应用最广，大约90%的药物浓度测定可以用色谱法来完成。具体选用何种分析方法应根据药物的化学结构、理化性质、仪器条件以及借鉴文献方法多方面因素来考虑确定。第23页，课件共100页，创作于2023年2月24二、分析方法的建立初步拟定分析方法后 进行一系列试验工作，以选择最佳分析条件

同时验证分析方法的可行性，以确认是否适用于实际生物样品分析方法的建立步骤第一步：检测条件的筛选第二步：分离条件的筛选第24页，课件共100页，创作于2023年2月25(一)检测条件的筛选

标准物质—照拟定的分析方法(不包括生物基质的预处理)测定

—确定最佳分析检测条件(如色谱条件)和检测灵敏度

HPLC—调整检测器(类型、条件)、色谱柱(型号、牌号、填料性状与粒经、柱长度)、流动相(组分及其配比)及其流速、柱温、进样量、内标物质的浓度及其加入量等

—使各物质具有足够的方法灵敏度(LOQ)

良好的色谱参数(n、R、T)

适当的保留时间(tR)第25页，课件共100页，创作于2023年2月26(二)分离条件的筛选

在进行分离条件筛选时，应考察生物基质中的内源性物质及代谢产物对分离与检测的干扰，步骤如下：

1．空白溶剂试验

—溶剂(方法特异性) 2．空白生物基质试验

—(方法特异性) 3．模拟生物样品试验

—方法效能指标

4．实际生物样品测试—代谢产物(方法特异性)第26页，课件共100页，创作于2023年2月271．空白溶剂试验

待测药物的非生物基质溶液（通常为水溶液）

—采用拟定的分析方法进行衍生化反应、萃取分离等 样品预处理（反应试剂、衍生化试剂、萃取溶剂等）

—测定响应信号（如HPLC峰面积或峰高） 考察目标

—方法的特异性

—空白值应尽可能小，并能有效校正第27页，课件共100页，创作于2023年2月28对色谱分析法而言

—可通过改变反应条件、萃取方法或萃取条件（萃取溶剂的极性、混合溶剂的配比，固相萃取填料性质、冲洗剂与洗脱剂及其用量等），甚至检测器类型

—空白试剂信号应不干扰药物的测定（如R＞1.5）

本步骤主要考察

—需经化学反应的预处理过程，若预处理过程仅为生物样品的提取分离，则可不进行该步骤，直接进行空白生物基质试验第28页，课件共100页，创作于2023年2月292.空白生物基质试验

空白生物基质(blankbiologicalmatrix) —如空白血浆

—按“空白溶剂试验”项下方法操作 考察目标

—生物基质中内源性物质对测定的干扰（方法特异性）

—在待测药物(或特定的活性代谢物、内标物质等)的“信号窗”内不应出现内源性物质信号第29页，课件共100页，创作于2023年2月30celecoxib塞来考昔<抗关节炎药，COX-2抑制剂>第30页，课件共100页，创作于2023年2月313.模拟生物样品试验

模拟生物样品—空白生物基质中加入待测药物，照“空白溶剂试验”项下方法操作

考察目标：

—方法的线性范围、精密度与准确度、灵敏度、 药物的萃取回收率等各项技术指标

—同时进一步检验生物基质中内源性物质以及可能共同使用的其他药物对测定的干扰程度，即方法特异性第31页，课件共100页，创作于2023年2月32对色谱分析法而言

—进一步考察待测药物、内标物与内源性物质(或其它药物)的分离情况

—如色谱峰的tR、n和T是否与水溶液的一致 色谱峰是否为单一成分（如何确定？） 标准曲线的截距是否显著偏离零点等 均可说明内源性物质是否对待测药物或内标物质构成干扰第32页，课件共100页，创作于2023年2月334.实际生物样品的测试

空白生物基质和模拟生物样品试验—确定的分析方法及其条件

—不能完全确认是否适合于实际生物样品的测定

—药物在体内可能与内源性物质结合(如血浆蛋白结合物)或代谢生成数个代谢产物及其进一步的结合物(或缀合物)

实际生物样品—确立分析方法后，尚需进行实际生物样品的测试 考察目标：—代谢产物对药物、内标物质的干扰情况—进一步验证方法的可行性？第33页，课件共100页，创作于2023年2月34空白血浆空白血浆+标准标准溶液志愿者实际样品空白溶剂试验多余？第34页，课件共100页，创作于2023年2月35第三节分析方法

验证的内容与要求

基于以下原因需要对建立的分析方法学进行验证：1、生物样品量少2、药物或活性代谢产物浓度低3、内源性物质的干扰4、生物的个体差异较大第35页，课件共100页，创作于2023年2月36（二）方法学确证建立可靠的和可重复的定量分析方法是进行临床药代动力学研究的关键之一。为了保证分析方法可靠，必须对方法进行充分确证，一般应进行以下几方面的考察：1、特异性(Specificity)2、标准曲线和定量范围（CalibrationCurve）3、定量下限（LowerLimitofquantitation，LLOQ）4、精密度与准确度（PrecisionandAccuracy）5、样品稳定性(Stability)6、提取回收率7、微生物学和免疫学方法确证8、方法学质控摘自:化学药物临床药代动力学研究技术指导原则

第36页，课件共100页，创作于2023年2月37

用于实际生物样品分析之前： 需要验证(validation)分析方法的可行性与可靠性 方法验证时应考虑影响分析方法的所有可变因素：

取样、样品制备、色谱分离、检测与数据评价使用的样品

—通常采用模拟生物样品和用药后的实际生物样

验证的技术指标

—效能指标

第37页，课件共100页，创作于2023年2月38验证步骤

首先为分析方法的验证

—特异性、精密度与准确度、回收率、定量限与检测限、稳定性等

其次为生物基质中待测药物稳定性的验证

—室温放置、冷冻（或冷藏）、冻-融循环

Freeze-and-thawcycle第38页，课件共100页，创作于2023年2月39验证的效能指标与基本要求

1．特异性（专属性）—避免干扰

2．标准曲线与线性范围—覆盖所有浓度范围

3．准确度—与实际状况相符

4．精密度—结果可重现

5．定量限—达到峰浓度的1/10～1/20 6．稳定性—确保所有样品准确测定

7．提取回收率—确保检测的灵敏度第39页，课件共100页，创作于2023年2月40一、方法特异性(专属性或选择性)

方法的特异性(specificity) —又称专属性或专一性，通常与选择性(selectivity)互用

—系指当有内源性物质存在时，方法准确测定待测物质的能力，通常表示所检测的信号(响应)系属于待测药物所特有 选择性—包括将待测物质与其代谢物及同服的其它药物加以区分(分离)的能力

特异性—函盖二者，以验证所测定的物质与待测药物的同一性特异性用于考察方法的抗干扰程度。如果特异性不佳，方法的准确度、精密度、线性都将受到影响。因此确保特异性是建立和验证一个分析方法的第一步。

第40页，课件共100页，创作于2023年2月411.内源性物质的干扰

比较—待测药物或其活性代谢产物的对照品（或标准品）

—空白生物基质

—模拟生物样品（空白生物基质中添加对照品）的检测信号

—如HPLC色谱峰的tR、n和拖尾因子（T）是否一致，以及与内源性物质色谱峰的分离度（R） 确证—内源性物质对分析方法有无干扰考察一个分析方法是否具有特异性，应着重考虑以下几点：第41页，课件共100页，创作于2023年2月422.代谢产物的干扰

比较模拟生物样品和用药后的实际生物样品的检测信号 如HPLC中药物色谱峰的tR、n和T是否一致，〔或改变色谱条件(色谱柱)再比较〕，以及与代谢产物的R，来确证代谢产物对分析方法有无干扰。

结构已知的特定活性代谢物的测定 －通过HPLC-DAD和LC-MS确证色谱峰的单纯性和同一性

对于结构未知的代谢产物的测定 －采用LC-LC-NMR进行结构的初步推测后，考察其干扰情况。第42页，课件共100页，创作于2023年2月43

对于色谱法至少要考察6个不同个体的空白生物样品色谱图、空白生物样品外加对照物质色谱图（注明浓度）及用药后的生物样品色谱图，以反映分析方法的特异性。对于以软电离质谱为基础的检测法（LC-MS、LC-MS-MS）应注意考察分析过程中的介质效应，如离子抑制等。摘自:化学药物临床药代动力学研究技术指导原则

第43页，课件共100页，创作于2023年2月443.伍用药物的干扰

TDM时

—还要考虑患者可能同时服用药物的干扰 通过比较待测药物及可能同时服用药物的模拟生物样品的检测信号 如HPLC色谱峰的tR、n和T是否一致

来确证同时服用药物对分析方法的干扰情况第44页，课件共100页，创作于2023年2月454.与参比方法的相关性

除上述方法外，有时还可使用参比方法对照法。 参比方法一般选用特异性强、准确度高、线性关系良好的色谱法。如在TDM中使用UV(或RIA)时,可以HPLC(或GC)为参比 参比方法测定结果为横坐标(X);拟定方法结果为纵坐标(Y)

用最小二乘法计算回归方程Y＝a＋bX(坐标标度相等)、相关系数(r)—表示两种方法测得结果的一致性，若r≠1，表示拟定方法为非线性，如RIA中抗血清滴度选择不当第45页，课件共100页，创作于2023年2月464.与参比方法的相关性

Y＝a＋bX

截距(a)—表示拟定方法受到恒定干扰的程度—内源性物质(UV)

斜率(b)—表示拟定方法受到比例干扰的程度—标记抗原不纯(RIA)

与参比方法的相关性比较，除显示分析方法的特异性外，还反映分析方法的准确度。

—斜率b表示两种方法测得结果的一致性

若参比方法准确度良好，且截距a≈0,则拟定方法的准确度(回收率)为100b(%)第46页，课件共100页，创作于2023年2月47二、标准曲线与线性范围

标准曲线（standardcurve）—校正（calibrationcurve）or工作（workingcurve）

—指生物样品中所测定药物浓度与响应（峰面积或峰高）的相关性（呈比例的程度）

—通常用回归分析方法所得的回归方程来评价

—除少数方法（免疫分析法）外，标准曲线通常为线性模式

—常用的回归分析法为最小二乘法（leastsquares）或加权最小二乘法（weightedleastsquares） 线性范围（linearrang）—标准曲线的最高与最低浓度的区间

—在此线性范围内，模拟生物样品的测定结果应达到试验要求的精密度和准确度第47页，课件共100页，创作于2023年2月48二、标准曲线与线性范围(续)

标准曲线—用模拟生物样品建立

—线性范围(不包括零点)应能覆盖全部生物样品中的药物浓度

—不能使用外推的方法求算未知生物样品中的药物浓度

建立标准曲线所使用的模拟生物样品应使用与待测的含药生物样品相同的生物基质制备第48页，课件共100页，创作于2023年2月49标准曲线的一般建立过程：标准系列溶液的制备内标溶液的制备

标准系列模拟生物样品的制备、测定标准曲线的绘制加权最小二乘法限度要求第49页，课件共100页，创作于2023年2月50标准曲线的一般建立方法

1.标准系列溶液的制备标准物质－对照品、标准品 溶剂—水或甲醇（或其他适当溶剂） 浓度—模拟生物样品中药物浓度的50倍以上 加入量为生物样品总体积的2%以下 避免标准模拟生物样品与实际样品存在较大差异。难溶性药物，浓度较低—应除去溶剂后再加入生物基质结晶？否则,在实际样品测定时应加入等体积的溶剂并涡旋混匀

第50页，课件共100页，创作于2023年2月51

至少含5～8个浓度点(不包括零点，即空白) —可覆盖全部待测生物样品中的药物浓度 如：1、2、5、10、20、50、100(等比梯度模式—比例常数约为2)

若体内平均达峰浓度为50，其1/20为2.5

设定最高浓度为100，最低浓度为1(个体差异)第51页，课件共100页，创作于2023年2月522、内标溶液的制备内标物质－对照品、标准品或化学试剂适宜的溶剂－甲醇、水、乙腈或混合溶剂浓度－与标准系列溶液的中间浓度相当如：某标准溶液5、10、20、40、80、160、320μg/ml，则内标的浓度应配制成40μg/ml

在这里，加内标溶液时并没有象标准溶液那样要求加入量为生物样品总体积的2%以下，为什么？第52页，课件共100页，创作于2023年2月533.标准系列模拟生物样品的制备

空白生物基质(如血浆)—加入标准系列溶液适量，涡旋混匀标准模拟生物样品的最高浓度应高于生物体用药后的达峰浓度，最低浓度应低于Cmax的10％～5％。目的—涵盖 为防止在标准溶液加入及涡旋混合时造成的损失？

——①先加入标准溶液②再加入空白生物基质 ③涡旋混匀

①②③第53页，课件共100页，创作于2023年2月544.标准曲线的绘制

以待测药物的检测响应(如色谱峰面积或峰高)或与内标物质的检测响应的比值(内标法)(因变量,y)对模拟血药浓度(自变量,x) —求得回归方程(y＝a＋bx)及其相关系数()

在一组由至少7个浓度(不包括零点)构成的标准曲线中，至多可有2个浓度点数据，可予剔除。但应有确切原因，如： （1）样品处理有损失；（2）色谱图有问题；（3）显著偏离标准曲线

—其余应有至少5个浓度点在标准曲线上第54页，课件共100页，创作于2023年2月555.加权最小二乘法

普通最小二乘法—每个浓度点绝对误差(yi－yi’)赋予同等的重要性

若标准曲线上的高低浓度相差悬殊(范围达102) —低浓度区的计算值相对误差过大，难以满足规定要求。加权最小二乘法—回归计算时增加一个权重因子(w) —各浓度的响应值与回归值的相对离差平方和达到最小式中，wi为标准曲线上第i个浓度点的权重因子第55页，课件共100页，创作于2023年2月561）回归方程(y=a+bx)参数的计算

现在有专业软件第56页，课件共100页，创作于2023年2月572）权重因子的选择

选择加权因子时—兼顾考虑曲线上高、中、低各浓度点的准确度，赋予低浓度点以更大的权重 在实际工作中的一般方法 （1）当wi=1/(yi’)2时，则 （2）而yi与xi成正比 （3）所以，令wi=1/(bxi)2=k/xi2

当高浓度点测量值的准确度下降过大 低浓度点权重过大，降低低浓度点的权重，wi=k/xi第57页，课件共100页，创作于2023年2月58标准曲线的限度要求

—标准曲线至少包括5个浓度(通常为5～8个浓度,不包括零点)—最高浓度应高于用药后生物体内药物的达峰浓度(Cmax)，最低浓度应为方法的LOQ(非LOD)，并应低于Cmax的10％～5％（1/10-1/20）—若标准曲线浓度范围较宽，可分为高低两个浓度区间(每个区间不少于5个浓度)，分别加权回归—如1、2、5、10、20和10、20、50、100、200—相关系数要求≥0.99(色谱法)或≥0.98(生物学方法)—回归方程的截距应接近于零，b≥1使之具有较高的灵敏度--与坐标的标度选择有关在药代动力学或生物利用度研究中：第58页，课件共100页，创作于2023年2月59三、准确度

方法准确度(accuracy)—系指用该方法测得的生物样品中待测药物的浓度与其真实浓度的接近程度 理论上应使用实际生物样品测定，但实际生物样品的浓度是未知的。所以，通常使用模拟生物样品测定，以测得的浓度与添加的理论浓度比较计算求得。 一般用相对回收率(relativerecovery，RR)或相对误差(relativeerror，RE)表示第59页，课件共100页，创作于2023年2月601.测定法

取空白生物基质（如血浆）数份，照标准曲线项下方法操作，在标准曲线范围内制备质控(qualitycontrol，QC)样品

—高(接近上限)、中、低(接近LOQ)3个浓度

—每一浓度至少5个样本

—与随行的标准曲线同法测定、计算，每个样品分析测定1次，用标准曲线计算测得的浓度第60页，课件共100页，创作于2023年2月612.结果计算与限度要求

计算

—测定值M(measured)的平均值与理论浓度(加入值)A(added)比值 相对回收率 相对误差 限度要求

—相对回收率应在85%～115%(LOQ附近80%～120%) —RE在±15%(LOQ附近为±20%)第61页，课件共100页，创作于2023年2月62四、精密度

方法精密度(precision) —系指每次测定结果与多次测定的平均值的偏离程度

—表示该分析方法的可重复性(reproducibility) —反映分析方法的可操作性，是方法验证的基本要点之一 理论上，精密度应使用实际生物样品测定。但实际上生物样品的量有限(如血浆，一般为0.5～2ml) —使用模拟生物样品测定，且通常与方法准确度评价同时进行，如日内精密度即可使用方法准确度的测定数据计算。第62页，课件共100页，创作于2023年2月631.表示方法

方法精密度一般用标准偏差(standarddeviation，SD)或相对标准偏差(relativestandarddeviation，RSD)表示

SD= RSD= =在体内药物分析中，方法精密度一般用RSD表示。第63页，课件共100页，创作于2023年2月64

批内(within-run或intra-assay)RSD系指在同一分析批内测定结果之间的RSD。一个分析批通常在一个工作日内完成，又称为日内(within-day)RSD。

无论是药代动力学试验或治疗药物监测监测，通常在一个工作日内难以完成全部样品的分析。在不同工作日之间的实验条件有可能发生微小变化，对分析结果有可能产生影响。所以，方法精密度除要考察批内RSD外，同时还有考察批间RSD。

批间(between-run或inter-assay)RSD系指在不同分析批的测定结果之间的RSD。因不同分析批通常是在不同的工作日内完成，又称为日间(between-day，day-to-day)RSD。第64页，课件共100页，创作于2023年2月652.测定法—分别测定法(Ⅰ)

取空白生物基质(如血浆)数份，照准确度项下方法，分别在同一批内和不同批间制备高、中、低3个浓度的QC样品，并分析测定批内RSD：一个工作日内完成，随行制备一条标准曲线和每一浓度5～6个样品，每个样品测定1次，用随行标准曲线分别计算3个浓度的RSD批间RSD：在至少5个工作日内完成，每一工作日内完成一个分析批的测定。每一分析批内制备一条标准曲线和每一浓度1个样品，每个样品测定1次；用随行标准曲线计算3个浓度(每一浓度5～6个分析批数据)的RSD第65页，课件共100页，创作于2023年2月662.测定法

若实际样品测定所用的分析批次少于5批，也可进行3个批次的连续分析(每1浓度的每1批次为5～6个样本)—采用多次分析的方差分析法 批间RSD=

批内RSD= =批内与批间RSD第66页，课件共100页，创作于2023年2月673.限度要求

在药代动力学和生物利用度研究中

对g/ml级水平的RSD一般应≤10% ng/ml级水平的RSD一般应≤15%

在LOQ附近RSD应≤20%。

第67页，课件共100页，创作于2023年2月68五、定量限

方法定量限(limitofquantitation，LOQ) —系指在保证具有一定可靠性(准确度与精密度符合要求)的前提下，能测定出生物样品中药物的最低浓度，又称为方法灵敏度(sensitivity) —标准曲线上的最低浓度点(最低浓度点≥LOQ)

要求—应能满足测定3～5个消除半衰期后生物样品中的药物浓度或Cmax的10％～5％

—准确度在80%～120%(或RE在±20%的范围内) —RSD≤20%第68页，课件共100页，创作于2023年2月69最低检测限（limitofdetectionLOD）：是指可在噪音水平下识别生物样品中药物的最低浓度，一般认为信噪比（S/N）≥3，信号可被检测，故以S/N＝3时的样品浓度作为LOD。

LOQ的检测信号至少是LOD的2倍以上，以（S/N）＝10作为LOQ的估计值。第69页，课件共100页，创作于2023年2月70LODTestS/N＝3第70页，课件共100页，创作于2023年2月71六、稳定性

生物样品量较大时，在一个工作日内难以完成全部样品的分析；有时样品需进行复测。因此生物样品及其预处理后的残渣或溶液的稳定性就显得尤为重要。需要对样品的存放条件和时间进行考察，以保证分析结果的准确、可靠

方法稳定性

生物样品的稳定性稳定性第71页，课件共100页，创作于2023年2月72（一）方法稳定性：首先考察待测药物的标准品（内标、衍生化试剂）或其分析溶液在实验室温度、湿度、光照及暴露空气等条件下的稳定性；在分析方法的建立时要考虑模拟生物样品的预处理过程（提取、净化及相转移）及待测物（蒸干后的残渣及其溶液）在室温或冰箱中存放的稳定性。第72页，课件共100页，创作于2023年2月73短期稳定性：主要考察模拟生物样品在室温、4℃或－20℃以及冻－融循环条件下的稳定性（二）生物样品的稳定性长期稳定性：主要考察生物样品长期冰冻（－20℃或－80℃）后的稳定性，考察期限从生物样品的采集到分析完毕的整个时间区间。第73页，课件共100页，创作于2023年2月74测定方法与要求1、取高、中、低三个浓度的QC样品，在不同条件下存放不同时间后，每个样品重复测定三次，平均值应为零时测定的±5％以内（经衍生化处理±15％以内）。若考察时间大于1天，则应与新制QC样品比较，若考察时间很长，可与在液氮中保存的样品在相同条件下的测定值比较2、稳定性期限要求室温下存放一般仅考察1个工作日（如1、2、4、8、24h）冰箱中－数个工作日（或数星期、数月）第74页，课件共100页，创作于2023年2月75七、萃取回收率（Extactionrecovvvery）

从生物样品基质中回收得到分析物质的响应值与加入的标准品的响应值的百分比即为分析物的萃取回收率。也可以说是将供试生物样品中分析物萃取出来供分析的比例。

应考察高、中、低3个浓度的萃取回收率，其结果应当精密和可重现第75页，课件共100页，创作于2023年2月761.测定法

取空白生物基质(如血浆)，制备高、中、低3个浓度的QC样品(每一浓度至少5个样品)，每个样品分析测定1次 另取等量的相同3个浓度的标准溶液，用溶解模拟生物样品经提取处理后的残渣的溶剂稀释至同体积，同法测定

AT—经萃取后的QC样品的检测信号或比值(内标法) AS—未经萃取的标准溶液的检测信号或比值(内标法)第76页，课件共100页，创作于2023年2月77实验过程中的注意事项1、要考察是内源性物质还是提取方法对提取回收率产生影响2、测定回收率时，如采用内标法，内标应在提取之后，溶剂蒸发之前加入3、采用内标法定量时，应同时测定内标物质的提取回收率，只需配制一个中间浓度的QC样品5份，同法测定。第77页，课件共100页，创作于2023年2月782.限度要求在生物利用度或TDM时高、中、低浓度样品的萃取回收率一般应≥70%高、中浓度的RSD应≤15%低浓度的RSD应≤20%内标法中内标物质的提取回收率应≥50%（RSD≤15%)第78页，课件共100页，创作于2023年2月79

（1）方法准确度(或相对回收率，relativerecovery)

（2）萃取回收率(绝对回收率，absoluterecovery)萃取回收率与相对回收率的比较：（1）萃取回收率主要考察生物样品预处理过程造成的药物的程度损失（2）相对回收率主要用来考察测定方法的准确度，采用标准曲线可准确计算生物样品中药物浓度第79页，课件共100页，创作于2023年2月80有时，低浓度的回收率大大低于高浓度的回收率，其原因可能是疏水性药物易被玻璃器皿或聚乙烯管表面吸附。

解决办法：表面硅烷化处理或加入可降低吸附的试剂如异丙醇、异戊醇、乙二胺等。第80页，课件共100页，创作于2023年2月81八、质量控制1、质控样品（QualitycontrolQC）：是指将已知量的待测药物加入到空白生物基质中配制的模拟生物样品，用于整个分析过程中的质量控制，一般配制高、中、低三个浓度的样品

分析方法建立并通过验证后，方可进行实际生物样品的测定，此时仍需对分析数据的质量进行监控！

质控样品池由不负责生物样品测试的人员（推荐由独立的人员）在实验开始时制备，并与实际生物样品在相同条件下储存第81页，课件共100页，创作于2023年2月822、质量控制（1）测定法：在测定过程中，每批生物样品都应建立相应的标准曲线，并随行间隔以高→低或低→高测定高、中、低至少3个浓度的6个QC样品（2）限度要求：6个QC样品中至少4个的测定结果的准确度在各自正常浓度80％～120％，RSD≤20%，允许有2个QC样品超出各自的±20％第82页，课件共100页，创作于2023年2月83

由于生物基质中存在内源性的该物质，难以测定方法的LOQ和准确度，此时可通过以下方法制备空白生物基质：1、对生物基质进行处理---活性炭滤过、透析2、使用不含内源性物质的生物基质—周期性变化的内源性物质如某些激素。3、使用替代基质—如兔血浆、人血清蛋白、缓冲液九、生物样品测定中其它情况（一）作为外源性药物使用的内源性物质的测定第83页，课件共100页，创作于2023年2月84出现以下情况时，分析方法需进行再评价或交互验证：1、改变色谱条件或生物样品的处理方法－样品的前处理方法改变后需要对效能指标进行重新考察2、改变生物基质不同物种的同种生物基质（大鼠血浆人血浆）、同一物种的不同生物基质（血浆血清）、甚至使用相同基质而使用不同抗凝剂等。（二）方法的再评价或交互验证：第84页，课件共100页，创作于2023年2月85（三）实际浓度超出标准曲线的处理：1、浓度高于定量上限－取样品用空白基质稀释，同时制备高于定量上限的QC样品，同法稀释后测定，以确认稀释的有效性。2、浓度低于LOQ－增加生物样品的体积，使测定液的浓度高于LOQ。应在相同条件下制备QC样品和增加体积后的空白生物基质进行试验，以确认方法的准确度、精密度和特异性符合要求。第85页，课件共100页，创作于2023年2月86第四节体内药物分析方法

应用示例

第三代喹诺酮类广谱抗菌药盐酸环丙沙星片人体生物等效性研究

一、文献调研 在水中溶解，在甲醇中微溶，在乙醇中极微溶解，在氯仿中几乎不溶，在氢氧化钠试液中易溶；环丙沙星游离体在水中不溶，在乙醇、二氯甲烷中极微溶解，在稀醋酸中溶解。

第86页，课件共100页，创作于2023年2月87药动学参数吸收过程—空腹口服后吸收迅速、人体生物利用度约为49%～70%Cmax—口服500mg后平均Cmax为2.4～2.6mg/LTmax—1～2hT1/2—血中T1/2约为4h，肾功能减退时稍有延长至6h蛋白结合率—20%～40%代谢—口服给药24h内，40%～50%原形、15%代谢物经肾排出第87页，课件共100页，创作于2023年2月88体内分析方法

RP-HPLC

色谱柱—ODS色谱柱 流动相—甲醇(乙腈)-磷酸(枸橼酸)缓冲液(三乙胺调节pH2.3～3.5)，或离子对色谱:溴化十六烷基三甲基铵(氢氧化四丁基铵)

检测—紫外或荧光检测

生物样品预处理 蛋白沉淀法—甲醇、乙腈或高氯酸沉淀蛋白后直接进样 溶剂萃取法—二氯甲烷-异丙醇、氯仿-异丙醇混合溶剂 蛋白沉淀-溶剂萃取—乙腈沉淀蛋白后二氯甲烷-异丙醇提取

第88页，课件共100页，创作于2023年2月89二、分析方法设计

1．分析方法 血浆蛋白结合率低(20%～40%)、以原形从肾排泄 生物等效性研究—测定血浆中环丙沙星原形药物的浓度-时间曲线。初步拟定：采用RP-HPLC法

2．检测方法 紫外—灵敏度＜1ng，若取血浆0.5ml，采用3倍量乙腈沉淀蛋白，取上清液100l进样，则要求血浆中环丙沙星浓度在50ng/ml以上，当Cmax在2g/ml以上(口服500mg)时基本可满足生物等效性研究要求

荧光—灵敏度＜0.1ng，能满足本试验要求

第89页，课件共100页，创作于2023年2月90

3．样品制备方法 初步拟定—采用简便、快速的乙腈沉淀蛋白后取上清液直接进样分析 预试—含75%乙腈的提取液100l进样后，色谱峰理论板数、对称性下降(前沿峰)，进而导致检测灵敏度降低(峰高降低)

经进一步试验，确定为： 血浆0.5ml→乙腈1ml沉淀蛋白→二氯甲烷-异丙醇(95:5)5ml萃取→60℃氮气流吹干→流动相200l溶解→20l进样 灵敏度可达2ng/ml(血浆浓度)，符合要求(Cmax＞2g/ml)

第90页，课件共100页，创作于2023年2月91三、实验方案

1．给药方案

20名受试者随机分为两组，每组10人 第1次试验—第一组口服受试制剂(相当于环丙沙星500mg)，第二组口服相同剂量的参比制剂 第2次试验—第1次服药后第7天（有足够长的清洗期）开始，两组交换给药第91页，课件共100页，创作于2023年2月92

2．血样的采集与处理

分别口服给药前和给药后0.25、0.5、1.0、1.5(tmax)、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、12.0和24.0(5～7个t1/2)小时 由肘正中静脉取血4ml

立即移入经肝素处理的离心试管中，静置5分钟后，离心15分钟(3000rpm)，分离血浆，-20℃冰箱中保存待测第92页，课件共100页，创作于2023年2月93

3．血样分析法

色谱条件

—高效液相色谱仪(包括LC-10ATvp泵，RF-530荧光检测器)；色谱柱为KromasilODS-AP(200mm×4.6mm，5m) —流动相为乙腈-0.025mol/L磷酸溶液(86:14)，流速1.0ml/min —激发波长为ex=277nm，发射em=445nm —柱温为40℃。

第93页，课件共100页，创作于2023年2月94

3．血样分析法 血浆样品的预处理 取血浆0.5ml，加内标溶液(10g/ml诺氟沙星甲醇溶液）50l、乙腈1.0ml，涡旋混合30s，离心5min，取上清液1ml，加二氯甲烷-异丙醇(95:5)混合溶剂5ml，涡旋振荡1min，离心5min，弃去上层水相，吸取下层有机相，60℃下氮气流吹干，残渣加流动相200l，涡旋溶解30s，离心5min，取上清液20l进样第94页，课件共100页，创作于2023年2月95四、分析方法验证

1．方法特异性

环丙沙星峰tR=12.4min，诺氟沙星(内标物质)tR=10.9min，各峰均获得完全分离，内源性物质峰(与空白血浆样品一致)tR=8.6min对测定无干扰。志愿者用药后的血浆样品色谱图中环丙沙星与内标物质峰与模拟血浆样品中环丙沙星与内标物质峰的tR、T、n和R均一致，峰形相同。故不认为代谢物有干扰第95页，课件共100页，创作于2023年2月96

2．标准曲线

标准系列溶液——取盐酸环丙沙星，加水制成1、2