水生动物检疫实验常用技术

水生动物检疫实验常用技术水生动物检疫实验常用技术显微技术---------------观察形体形态分离培养技术---------培养活细菌或病毒生化鉴定技术------检测酶的活性核酸检测技术------检测核酸免疫学技术------------检测蛋白综合检测技术显微技术1、观察寄生虫、真菌等2、细菌、细胞形态观察3、电子显微观察革兰氏染色G+G-正常的CO细胞感染SVC病毒的细胞感染SVC病毒的细胞电子显微镜分离培养技术1、鱼类病毒的分离培养样品洗涤后匀浆，用10倍体积的细胞培养液充分悬浮，静置。离心收集上清，倍比稀释后接种单层细胞分离培养技术2、细菌分离培养稀释法注意事项：每画一组线，接种环需灭菌一次（即每个培养皿只取材料一次）平板划线分离法选择适宜的培养基生化鉴定技术1、病毒生化鉴定1.1氯仿敏感试验1.2吖啶橙试验1.3DNA抑制剂抑制试验1.4免疫荧光试验生化鉴定技术2、细菌生化鉴定各种细菌具有各自独特的酶系统，因而对底物的分解能力不同，其代谢产物也不同。用生物化学方法测定这些代谢产物，可用来区别和鉴定细菌的种类。利用生物化学方法来鉴别不同细菌，称为细菌的生理生化试验或称生理生化反应。生理生化检测技术吲哚试验有动力现象无动力现象阴性阳性阳性阴性核酸检测技术1、聚合酶链式反应（PCR）检测2、逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）检测3、荧光定量PCR检测RNA抽提将450μl细胞病变悬液加入450μlCTAB溶液。25℃作用2-2.5小时。加600μl酚/氯仿/异戊醇（24:24:1）,用力混合至少30秒。12,000rpm离心5分钟，取上层水相（约750μl）。加650μl氯仿/异戊醇（24:1）,用力混合至少30秒12,000rpm离心5min，取上层水相（约600μl）。加1.5倍体积的无水乙醇，混匀后-20℃过夜，12,000rpm离心30分钟，小心弃上清，倒置在滤纸上吸干，37℃干燥30min，加11μl水溶解，吹打20下，-80℃冻融一次，做PCR模板。不同的抽提方法蛋白酶K或SDS消化后用酚抽提CTAB处理后酚/氯仿抽提TRIZOL处理后氯仿抽提QIAGEN法抽提从效果、方便、价格综合考虑变性和退火在0.2mlPCR管内分别加入各反应成分模板10μl引物2.5μlDEPE水2.5μl混匀，70℃反应5分钟，立即冰浴，低速离心5ScDNA合成在上述0.2mlPCR管内分别加入各反应成分5*AMVbuffer

10μldNTP

2μlRnase抑制剂0.5μlAMV反转录酶1μlDEPE水1.5μl至总体积为25μl,42℃反应60min。PCR扩增1）在0.5mlPCR管内分别加入各反应成分10*PCRBuffer

8μldNTP10μl上下游引物各2μlTaq酶1μlMgcl28μlDEPE水52μl反应总体积100μl2）94℃预变性3min，94℃变性1min，50℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环，最后72℃延伸8min，4℃保温。套式PCR扩增1）另取一0.2mlPCR管内分别加入各反应成分模板5μl10*PCRBuffer

10μldNTP8μl上下游引物各2.5μlTaq酶1μlMgcl210μlDEPE水61μl反应总体积100μl2）94℃预变性3min，94℃变性1min，50℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环，最后72℃延伸8min，4℃保温。免疫学技术免疫学检测技术利用抗原抗体间能发生特异性免疫反应的原理来检测病原，是运用较为广泛、成熟的检测技术。常用的有免疫荧光技术、免疫酶技术、Western印迹法等。酶联免疫吸附试验(ELISA)是目前应用最广泛的固相免疫酶测定技术，是利用了抗原一抗体反应的高度特异性和酶促反应的高度敏感性，通过肉眼或显微镜观察及分光光度计测定，达到在细胞或亚细胞水平上示踪抗原或抗体的部位，以及对其进行定量的目的。阳性弱阳性阴性空白

综合检验技术免疫PCRPCR-ELISA免疫病理学技术分子病理技术可以看出，病原的检测方法多种多样，各种方法都有