微生物的实验室培养

课题1微生物的实验室培养专题2:微生物的培养与应用（一）微生物的类群微生物原核类:真核类非细胞类：细菌、支原体、放线菌、蓝藻个体微小、结构简单酵母菌、霉菌、食用菌真菌：原生生物：显微藻类、原生生物病毒、类病毒、朊病毒◆微生物的共同特点：一、基础知识1.细菌的形态二分裂2.细菌的繁殖3.细菌的菌落（1）概念：单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，形成的一个肉眼可见的、具有一定形态结构的子细胞群体，叫做菌落。（2）特征：大小、形状、光泽度、颜色、硬度、透明度等。（3）功能：每种细菌在一定条件下所形成的菌落，可以作为菌种鉴定的重要依据。几种菌落及其形态几种菌落及其形态4.病毒的结构:由核酸和蛋白质构成病毒的结构（二）微生物需要的营养物质及功能1.碳源2.氮源3.无机盐4.水5.特殊营养物质：凡是能为微生物提供碳元素的营养物质。①无机碳源：CO2；NaHCO3等②有机碳源：糖类、脂肪酸、石油等①构成细胞物质和一些代谢产物②异养微生物的能源⑴概念⑵来源：⑶作用：1.碳源①无机氮源：N2、NH4+、NO3-、NH3等。②有机氮源：尿素、牛肉膏、蛋白胨、

氨基酸等凡是能够为微生物提供N元素的营养物质。主要用于合成蛋白质、核酸及含N的代谢产物。2.氮源⑴概念：⑵来源：⑶作用：3.特殊营养物质（生长因子）⑶常见的生长因子：⑴概念：⑵作用：微生物生长不可缺少的微量有机物。酶和核酸的组成成分。维生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶等。（三）培养基

1.概念

：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。2.培养基的类型和用途3.不同培养基配方(参考教材附录3)4.不管哪种培养基，一般都含有水、碳源、氮源、无机盐等营养物质，另外还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质（如:生长因子）以及氧气、二氧化碳、渗透压等的要求。划分标准培养基种类特点用途物理性质化学成分用途培养基的种类不加凝固剂加凝固剂，如琼脂工业生产观察微生物的运动、分类鉴定微生物分离、鉴定、活菌计数、保藏菌种含化学成分不明确的天然物质工业生产培养基成分明确分类、鉴定在培养基中加入某种化学物质,以抑制不需要的微生物的生长,促进所需要的微生物的生长培养、分离出特定微生物在培养基中加入某种指示剂或化学药品,用以鉴别不同种类的微生物鉴别不同种类微生物选择培养基液体培养基半固体培养基固体培养基天然培养基合成培养基鉴别培养基液体培养基：表面生长均匀混浊生长沉淀生长back半固体培养基：(是否运动)

无动力有动力(弥散)固体培养基：菌落（四）无菌技术1.概念无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。⑴消毒定义：利用化学或物理方法，杀死部分微生物的过程。2.消毒与灭菌⑵灭菌的定义：以化学试剂或物理方法消灭所有微生物，包括所有细菌的繁殖体、芽孢、霉菌及病毒，而达到完全无菌之过程。

①煮沸消毒法：100℃煮沸5-6min。②巴氏消毒法：70-75℃下煮30min或

80℃下煮15min。③化学药剂消毒法：用70%酒精等进行皮肤

消毒；氯气消毒水源。④紫外线消毒法（1）消毒的方法3.常用的消毒与灭菌的方法①灼烧灭菌②干热灭菌

160-170℃下加热1-2h。③高压蒸气灭菌

100kPa、121℃下维持15-30min.（2）灭菌的方法

最常用的灭菌方法是________________，它可以杀灭所有的生物，同时可以基本保持培养基的营养成分不被破坏。有些玻璃器皿也可采用______________。为了防止杂菌，特别是空气中的杂菌污染，试管及玻璃烧瓶都需采用适宜的塞子塞口，通常采用_______，也可采用各种金属、塑料及硅胶帽，它们只可让空气通过，而空气中的其他微生物不能通过。平皿是由正反两平面板互扣而成，这种器具是专为防止空气中微生物的污染而设计的。高压蒸汽灭菌高温干热灭菌棉花塞1.无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外,还有什么目的？2.请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。（1）培养细菌用的培养基与培养皿（2）玻棒、试管、烧瓶和吸管（3）实验操作者的双手无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。旁栏思考旁栏思考消毒灭菌微生物实验室培养的基本操作程序1.器具的灭菌2.培养基的配制3.培养基的灭菌4.倒平板5.微生物接种6.恒温箱中培养7.菌种的保存二、实验操作(以培养大肠杆菌为例)（一）制备牛肉膏蛋白胨培养基1.计算2.称量3.溶化4.灭菌:

将锥形瓶放入高压蒸气灭菌锅，在压力为100kPa、温度为121℃，灭菌15～30min。5.倒平板:

待培养基冷却到50℃左右时，在酒精灯附近倒平板。2d后观察平板，无杂菌污染才可用来接种。倒平板操作1.培养基灭菌后，需要冷却到50℃左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？问题讨论1问题讨论1

可用手触摸锥形瓶，感觉温度下降到刚刚不烫手时，就可以倒平板了。2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？

通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。（二）纯化大肠杆菌平板划线法和稀释涂布平板法。1.微生物的接种的常用接种方法：2.平板划线的操作方法平板划线的操作1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。问题讨论2问题讨论22.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？

以免接种环温度太高，杀死菌种。3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。问题讨论2问题讨论23.稀释涂布平板的操作方法涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第2步应如何进行无菌操作？

应从操作的各个细节保证“无菌”。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围等等。问题讨论3问题讨论35.菌种的保存接种到固体斜面培养基，菌落长成后置于4℃冰箱保存。4.微生物的恒温培养⑵长期保存：甘油冷冻管藏法⑴临时保藏：三、结果分析与评价（一）培养基的制作是否合格如果未接种的培养基在恒温箱中保温1～2d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。（二）接种操作是否符合无菌要求如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明接种操作是符合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求，需要分析原因，再次练习。（三）是否进行了及时细致的观察与记录培养12h与24h后的大肠杆菌菌落的大小会有明显不同，及时观察记录的同学会发现这一点，并能观察到其他一些细微的变化。例:某同学用新鲜的泡菜滤液为实验材料纯化乳酸菌。分离纯化所用固体培养基中因含有碳酸钙而不透明，乳酸菌产生的乳酸能溶解培养基中的碳酸钙。回答下列问题：（1）分离纯化乳酸菌时，首先需要用__________对泡菜滤液进行梯度稀释，进行梯度稀释的理由是:无菌水

在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的乳酸菌将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落。

（2）推测在分离纯化所用的培养基中加入碳酸钙的作用有_______________________________和______________________________________。分离纯化时应挑选出____________________的菌落作为候选菌。（3）乳酸菌在-20℃长期保存时，菌液中常需要加入一定量的_______（填“蒸馏水”、“甘油”或“碳酸钙”）。中和乳酸菌代谢过程中产生的乳酸

在平板上有溶钙圈甘油