乳糖微生物限度验证方案

目录1.目的 32.范围 33.职责 34.参考文件 35.系统概述 46.验证用仪器、菌种和培养基 46.1验证用仪器 46.2验证用菌种 46.3验证用培养基 47.验证实施 47.1验证文件确认 57.2需养菌总数、霉菌及酵母菌计数培养基的适用性检查 67.3需养菌总数、霉菌及酵母菌计数方法验证 67.4控制菌检查用培养基的适用性检查 67.5控制菌检查方法验证 88.偏差清单及报告 99.验证周期 910.验证结果分析与评价报告 911.验证附表 10表1验证方案培训记录表11表2文件的确认 12表3菌液计数结果 13表4需养菌总数、霉菌及酵母菌培养基的适用性检查记录 14表5需养菌总数、霉菌及酵母菌计数方法验证记录 15表6控制菌检查用培养基的适用性检查记录 16表7控制菌检查方法验证 17表8偏差清单 18表9偏差报告 19表10验证结果分析与评价报告 201.目的依据《中国药典》（2015年版四部）,对乳糖新建立的微生物限度检查方法进行验证，以确认在目前的检验环境下该方法适合于供试品的需养菌总数、霉菌、酵母菌测定及控制菌的检查。2.范围本验证方案适用于乳糖的微生物限度检查法的验证。3.职责 3.1验证小组成员及职责序号部门姓名职务验证小组职务工作职责1质量管理部刘国利质量副总组长负责验证方案、验证报告的最终批准负责验证涉及文件、资料的最终审核确保完成验证项目2质量管理部邓志军质管部长副组长负责验证方案、验证报告的审核负责验证涉及文件、资料的审核3质量管理部胡绪勇QA主任小组成员负责验证方案的起草、培训负责验证工作的实施负责验证实施过程中资料数据的收集、整理、归档负责难证项目实施中各部门协调工作负责验证报告的撰写4质量管理部饶滔QC主任小组成员负责验证检验标准、检验方法的起草负责验证实施过程中检验工作的安排5质量管理部阮江为QA小组成员负责验证方案、验证报告的初审负责协助验证过程的实施6质量管理部毛亚琼QC小组成员负责验证过程实施原始记录的填写徐秋红3.2验证方案培训：本验证方案批准后，根据《人员培训标准操作规程》对确认小组成员和相关人员进行培训，使其了解方案的实施程序，明白其职责并能在验证工作中得到很好的执行。见表1.4.参考文件本验证方案参考了以下标准和指南：《药品生产质量管理规范》（2010年版）《药品微生物学检验技术》《药品生产验证指南》（2003年版）《中国药典》（2015年版四部）5.系统概述参照《中国药典》（2015年版二部及四部）采用的检测方法对葡萄糖原料新建立的微生物限度检查法进行验证，以确认所采用的方法适合于供试品的需养菌总数、霉菌、酵母菌的测定和控制菌的检查。可以照此检查法和此检查条件进行供试品的微生物限度检查。6.验证用仪器、菌种和培养基6.1验证用仪器仪器名称生产厂家仪器型号压力蒸汽灭菌器电子天平PH酸度计电热恒温培养箱生化培养箱微生物限度检验仪6.2验证用菌种菌种名称菌种编号提供厂家菌种代数金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]北京三药科技开发公司第（）代铜绿假单胞菌[CMCC（B）10104]北京三药科技开发公司第（）代枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501]北京三药科技开发公司第（）代大肠埃希菌[CMCC（B）44102]北京三药科技开发公司第（）代白色念珠菌[CMCC（B）98001]北京三药科技开发公司第（）代黑曲霉菌[CMCC（B）98003]北京三药科技开发公司第（）代6.3验证用对照培养基对照培养基名称来源批号胰酪大豆胨液体对照培养基中国食品药品检定研究院胰酪大豆胨琼脂对照培养基中国食品药品检定研究院沙氏葡萄糖琼脂对照培养基中国食品药品检定研究院沙氏葡萄糖液体对照培养基中国食品药品检定研究院麦康凯液体对照培养基中国食品药品检定研究院麦康凯琼脂对照培养基中国食品药品检定研究院6.4验证用培养基培养基名称配制批号培养温度（℃）胰酪大豆胨液体培养基30～35℃胰酪大豆胨琼脂培养基30～35℃沙氏葡萄糖液体培养基20～25℃沙氏葡萄糖琼脂培养基20～25℃麦康凯液体培养基42～44℃麦康凯琼脂培养基30～35℃PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液——0.9%无菌氯化钠溶液——7.验证实施7.1验证文件确认目的验证支持文件的确认，用来保证验证的一致性、有效性。程序检查《乳糖糖质量标准》、《微生物限度检查法操作规程》、《培养基适用性检查操作程序》及相关记录是否齐全、是否是现行批准的文件。可接收标准与本次验证相关的文件及记录齐全，均为现行版本。确认结果结果见“表1文件确认”。7.2需养菌总数、霉菌及酵母菌计数培养基的适用性检查目的确认使用的需养菌总数、霉菌及酵母菌计数培养基适用性检查符合要求。程序菌液制备取铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物分别接种至胰酪大豆胨液体培养基中，经30～35℃培养18～24小时，将培养物1ml，加入到9ml0.9%无菌氯化钠溶液中，10倍稀释制成每1ml含菌数不大于100cfu的菌悬液，备用。取白色念珠菌的新鲜培养物接种至沙氏葡萄糖液体培养基中，经20～25℃培养2～3天，将培养物1ml，加入到9ml0.9%无菌氯化钠注射液中，10倍稀释制成每1ml含菌数不大于100cfu的菌悬液，备用。取黑曲霉的新鲜培养物接种至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基中，经20～25℃培养5～7天，加入3～5ml含0.05%（ml/ml）的聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，吸出孢子悬液至无菌试管内，取此菌原液1ml，用含0.05%（ml/ml）的聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液9ml，10倍稀释制成每1ml含孢子数不大于100cfu的孢子悬液，备用。菌液计数（取2个平皿的平均值）：取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌1ml分别接种至2个无菌培养皿中，每皿注入胰酪大豆胨琼脂培养基约20ml，倒置于生化培养箱30～35℃培养3天，计数；取白色念珠菌、黑曲霉菌液1ml分别接种至2个无菌培养皿中，每皿注入沙氏葡萄糖琼脂培养基约20ml，倒置于霉菌培养箱20～25℃培养5天，计数并取其平均值。②计数培养基适用性检查胰酪大豆胨琼脂培养基取7个无菌平皿，分别接种铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌各2平皿，每皿接种1ml（含菌不大于100cfu），另一平皿不接种菌作为空白对照，倾注胰酪大豆胨琼脂培养基，混匀，凝固后置于30～35℃培养3天，计数。取4个无菌平皿，分别接种白色念珠菌、黑曲霉菌各2个无菌平皿，倾注胰酪大豆胨琼脂对照培养基，混匀，凝固后置于30～35℃培养5天，计数；对照培养基同法操作。沙氏葡萄糖琼脂培养基取5个无菌平皿，分别接种白色念珠菌、黑曲霉菌各2个平皿，每皿接种1ml（含菌不大于100cfu），另一平皿不接种菌作为空白对照，倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基，混匀，凝固后置于20～25℃培养5天，计数；对照培养基同法操作。可接受标准被检固体培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数的比值应在0.5～2范围内，且菌落形态、大小应与对照培养基上的菌落一致，则判断该培养基的适用性检查符合规定。确认报告结果见“表2菌液计数结果”、”表3培养基的适应性检查”。7.3需养菌总数、霉菌及酵母菌计数方法的验证目的确认所采用的计数方法适合于产品的需养菌总数、霉菌及酵母菌的测定。程序菌液制备：取铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物分别接种至胰酪大豆胨液体培养基中，经30～35℃培养18～24小时将培养物1ml，加入到9ml0.9%无菌氯化钠溶液中，10倍稀释制成每1ml含菌数不大于100cfu的菌悬液，备用。取白色念珠菌的新鲜培养物接种至沙氏葡萄糖液体培养基中，经20～25℃培养2～3天，将培养物1ml，加入到9ml0.9%无菌氯化钠注射液中，10倍稀释制成每1ml含菌数不大于100cfu的菌悬液，备用。取黑曲霉的新鲜培养物接种至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基中，培养5～7天，加入3～5ml含0.05%（ml/ml）的聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，吸出孢子悬液至无菌试管内，取此菌原液1ml，用含0.05%（ml/ml）的聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液9ml，稀释制成每1ml含孢子数不大于100cfu的孢子悬液，备用。②验证步骤：取供试品1个批号，每批中验证试验包括3组进行独立的平行试验，并分别计算各试验菌每次试验的比值。a.试验组：取1：10的供试液10ml加入适量的试验菌液，混匀，使每1ml供试液中含菌量不大于100cfu，再取1ml注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，分别制备2个平皿，按平皿法测定其菌数。b.菌液组：取稀释液10ml，同试验组操作，测定其菌数。c.供试品对照组：取1：10的供试液1ml，测定供试品菌数。可接受标准试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值应在0.5～2范围内。稀释剂对照组菌落数与菌液对照组菌落数的比值应在0.5～2范围内。试验组菌数比值=试验组平均菌落数－供试品对照组平均菌落数菌液对照组平均菌落数确认报告结果见”表4需养菌总数、霉菌及酵母菌计数方法验证记录”。7.4控制菌检查用培养基的适用性检查目的确认使用的控制菌计数培养基适用性检查符合要求。程序①菌液制取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌的新鲜培养物分别接种至胰酪大豆胨液体培养基中，经30～35℃培养18～24小时，将培养物1ml，加入到9ml0.9%无菌氯化钠溶液中，10倍稀释制成每1ml含菌数不大于100cfu，备用。②适用性检查麦康凯液体培养基分别接种1ml（含菌不大于100cfu）大肠埃希菌于被检培养基和对照培养基中，在42～44℃培养24～48小时，与对照培养基管比较，被检培养基管试验菌应生长良好；接种1ml（含菌大于100cfu）金黄色葡萄糖菌于被检培养基和对照培养基中，在42～44℃培养48小时，试验菌应不得生长。麦康凯琼脂培养基用涂布法分别接种1ml（含菌不大于100cfu）大肠埃希菌于被检培养基和对照培养基平皿上，在30～35℃培养18小时，与对照培养皿比较，被检培养皿与对照培养皿生长的菌落大小、形态特征应一致。用涂布法分别接种不大于100cfu的大肠埃希菌于被检培养基和对照培养基平皿上，在30～35℃培养18小时。被检培养基上试验菌生长的菌落大小、形态特征、指示剂反应情况等应于对照培养基一致RV沙门增菌液体培养基分别接种1ml（含菌不大于100cfu）沙门菌于被检培养基和对照培养基中，在30～35℃培养24小时，与对照培养基管比较，被检培养基管试验菌应生长良好；接种1ml（含菌大于100cfu）金黄色葡萄糖菌于被检培养基和对照培养基中，在30～35℃培养24小时，试验菌应不得生长。木糖赖氨酸脱养胆酸盐琼脂培养基用涂布法分别接种1ml（含菌不大于100cfu）沙门菌于被检培养基和对照培养基平皿上，在30～35℃培养18小时，与对照培养皿比较，被检培养皿与对照培养皿生长的菌落大小、形态特征应一致。用涂布法分别接种不大于100cfu的沙门菌于被检培养基和对照培养基平皿上，在30～35℃培养18小时。被检培养基上试验菌生长的菌落大小、形态特征、指示剂反应情况等应于对照培养基一致。三糖铁琼脂培养基用涂布法分别接种不大于100cfu的沙门菌于被检培养基和对照培养基平皿上，在30～35℃培养18小时。被检培养基上试验菌生长的菌落大小、形态特征、指示剂反应情况等应于对照培养基一致。可接受标准促生长能力检查：被检培养基与对照培养基生长的菌落大小、形态特征应一致。抑制能力检查：试验菌不得生长。指示能力检查：被检培养基上试验菌生长的菌落大小、形态特征、指示剂反应情况等应于对照培养基一致。确认报告结果见”表5控制菌检查用培养基的适用性检查”。7.5控制菌检查方法验证目的验证所采用的检查方法适合于产品的控制菌检查。程序菌液制备取大肠埃希菌、沙门的新鲜培养物接种至胰酪大豆胨液体培养基中，经30～35℃培养18～24小时，将培养物1ml，加入到9ml0.9%无菌氯化钠溶液中，10倍稀释制成每1ml含菌数不大于100cfu的菌悬液，备用。1.验证步骤供试液的配制：取供试品10g，加入pH7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，使成1：10的供试液。试验组：取1ml供试液和不大于100cfu试验菌加入100ml胰酪大豆胨液体培养基中，混匀30～35℃培养18小时，取上述培养物1ml加入100ml麦康凯液体培养基中42～44℃培养24小时。取麦康凯液体培养物划线接种于取麦康凯琼脂培养基平皿上，30～35℃培养18小时。阳性对照组：取1ml不大于100cfu试验菌加入100ml胰酪大豆胨液体培养基中，混匀30～35℃培养18～24，取上述培养物1ml加入100ml麦康凯液体培养基中。42～44℃培养24小时。取麦康凯液体培养物划线接种于取麦康凯琼脂培养基平皿上，30～35℃培养18小时阴性对照组：取pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液1ml加入100ml胰酪大豆胨液体培养基中，混匀30～35℃培养18小时，取上述培养物1ml加入100ml麦康凯液体培养基中42～44℃培养24小时。取麦康凯液体培养物划线接种于取麦康凯琼脂培养基平皿上，30～35℃培养18小时。试验组：取10g供试品和不大于100cfu试验菌接种至100胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，30～35℃培养18小时，取上述培养物0.1ml接种至10mlRV沙门增菌液体培养基30～35℃培养18小时取少量RV沙门增菌液体培养物接种于木糖赖氨酸脱养胆酸盐琼脂培养基平皿上，30～35℃培养18小时，用接种针挑选疑似菌落于三糖铁琼脂培养基进行斜面接种30～35℃培养18小时。阳性对照组：取1ml不大于100cfu试验菌接种至100ml胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，30～35℃培养18小时，取上述培养物0.1ml接种至10mlRV沙门增菌液体培养基30～35℃培养18小时取少量RV沙门增菌液体培养物接种于木糖赖氨酸脱养胆酸盐琼脂培养基平皿上30～35℃培养18小时，用接种针挑选疑似菌落于三糖铁琼脂培养基进行斜面接种30～35℃培养18小时。阴性对照组：取100ml胰酪大豆胨液体培养基30～35℃培养18小时，取上述培养物0.1ml接种至10mlRV沙门增菌液体培养基30～35℃培养18小时取少量RV沙门增菌液体培养物接种于木糖赖氨酸脱养胆酸盐琼脂培养基平皿上30～35℃培养18小时。可接受标准阳性对照组应检出试验菌，阴性对照组应无菌生长。若试验组检出试验菌，则可按此供试液制备法和控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查；若试验组未检出试验菌，应消除供试品的抑菌活性后，重新进行验证。确认报告结果见”表6控制菌检查方法验证记录”。8.偏差清单及报告整理所有验证过程中发现的偏差，并将清单列在“表6”中。将验证过程发现的所有偏差记录在“表7”，并提出偏差解决方案，审核和批准偏差解决方案及其实施。9.验证周期每5年进行一次再验证，原测定法的检验条件发生改变时，也需要重新验证。10.验证结果分析与评价报告由验证小组组长对本方案做验证结论及建议，填写“表8验证结果分析与评价报告”，验证小组成员进行会签，验证委员会主任对本方案的结论进行批准。表1验证方案培训记录表培训内容教师姓名部门职务培训时间培训地点教师签名参加培训人员签名部门姓名部门姓名表2文件的确认文件的确认文件名文件编号存放地点《药用炭质量标准》《微生物限度检查法操作规程》《培养基适用性检查操作程序》检查人日期复核人日期

表3菌液计数结果菌液计数结果培养结果（个/ml）加菌量菌种培养基平皿号1天2天3天4天5天胰酪大豆胨琼脂培养基金黄色葡萄球菌12平均值枯草芽孢杆菌12平均值铜绿假单胞菌12平均值大肠埃希菌12平均值沙氏葡萄糖琼脂培养基白色念珠菌12平均值黑曲霉菌12平均值胰酪大豆胨琼脂培养基阴性对照/沙氏葡萄糖琼脂培养基阴性对照/结果□合格□不合格结论检查人/日期复核人/日期表4需养菌总数、霉菌及酵母菌培养基的适用性检查记录需养菌总数、霉菌及酵母菌培养基的适用性检查记录培养结果（个/ml）加菌量菌种培养基平皿号被检培养基对照培养基比值1天2天3天4天5天1天2天3天4天5天胰酪大豆胨琼脂培养基金黄色葡萄球菌1////////2////////平均值枯草芽孢杆菌1////////2////////平均值铜绿假单胞菌1////////2////////平均值白色念珠菌1////////2////////平均值黑曲霉菌1////////2////////平均值沙氏葡萄糖琼脂培养基白色念珠菌1////////2////////平均值黑曲霉菌1////////2////////平均值胰酪大豆胨琼脂培养基阴性对照沙氏葡萄糖琼脂培养基阴性对照结果□合格□不合格结论检查人日期复核人日期表5需养菌总数、霉菌及酵母菌计数方法验证记录需养菌总数、霉菌及酵母菌计数方法验证记录供试品名称批号生产厂家试验方法平皿法菌种加菌量项目平均菌落数结果123金黄色葡萄球菌试验组□合格□不合格菌液对照组供试品对照组试验组菌数比值铜绿假单胞菌试验组□合格□不合格菌液对照组供试品对照组试验组菌数比值枯草芽孢杆菌试验组□合格□不合格菌液对照组供试品对照组试验组菌数比值白色念珠菌试验组□合格□不合格菌液对照组供试品对照组试验组菌数比值黑曲霉菌试验组□合格□不合格菌液对照组供试品对照组试验组菌数比值检查人日期复核人日期表6控制菌检查用培养基的适用性检查记录控制菌检查用培养基的适用性检查记录试验项目促生长能力抑制能力指示能力菌种大肠埃希菌金黄色葡萄球菌大肠埃希菌菌种代数第（）代第（）代第（）代加菌量（cfu/ml）试验结果培养基培养条件结果麦康凯液体培养基培养温度℃培养时间hr--------麦康凯液体培养基培养温度℃培养时间hr--------麦康凯琼脂培养基培养温度℃培养时间hr----麦康凯液体培养基阴性对照麦康凯琼脂培养基阴性对照结果□合格□不合格结论检查人日期复核人日期表7控制菌检查方法验证控制菌检查方法验证记录供试品名称批号生产厂家控制菌验证：大肠埃希菌供试液制备取供试品10g，加入pH7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，使成1：10的供试液。取1：10的供试液1ml。培养基及培养条件试验组阳性对照组阴性对照组胰酪大豆胨液体培养基30～35℃培养18小时麦康凯液体培养基42～44℃培养24小时麦康凯琼脂培养基30～35℃培养18小时结果□合格□不合格检查人日期复核人日期表8偏差清单偏差清单偏差编码偏差描述发生偏差的项目检查人日期复核人日期表9偏差报告偏差报告偏差编码发生偏差的项目偏差描述及建议的纠正措施：验证人员签名日期纠正措施的审核和批准：质监中心主管签名日期结果跟踪：质监中心主管签名日期（附相应的偏差记录）