第七章抗原抗体反应及应用暨南大学抗体工程中心

第七章抗原抗体反应及应用不论天然的还是人工合成的分子，只要能被机体的免疫系统识别的都可以诱导机体的免疫应答，产生相应的抗体。大多数抗体和抗原本身是既有免疫原性(诱发产生特异抗体)，又有反应原性(与特异的抗体相结合)。抗原与抗体的特异性反应不仅可以在体内进行，而且可以在体外进行。一切利用血清学技术方法所进行的各种测试都是基于这一根本的特性。抗体反应技术的应用之广泛已经远远超出了免疫学、医学、甚至生命科学的范围，成为—类微量，灵敏，快速的检测分析方法。本章着重介绍抗体制备，抗体抗原反应原理及技术方法的应用。第一节抗体的制备环境中的大部分生物(包括病原生物)及其产物分子和一些化合物对哺乳动物的免疫系统而言是外源抗原，这些抗原能通过侵染或其他的途径刺激免疫系统，产生以抗体为主的体液免疫应答。同样用抗原人工免疫实验动物，可以获得含有特异性抗体的血清，称为抗血清(antiserum)，因血清中抗体是多个抗原决定簇刺激不同B细胞克隆而产生的抗体，所以称多克隆抗体(polyclonalantibody)。一个B细胞克隆所分泌的抗体即为单克隆抗体。用免疫动物的B细胞与骨髓瘤细胞融合，在体外可以分离出许多单个B细胞克隆，以此方法可制备单克隆抗体(monoclonalantibody)。随着分子生物学技术的发展，已经可以用抗体基因文库(antibodycombinatoriallibrary)筛选制备单克隆抗体。应用基因工程技术，根据需要对抗体进行改造，获得基因工程抗体(engineeringantibody)，以及催化性抗体(catalyticantibody或abozyme)等的全新的抗体。一、抗血清的制备1．免疫动物(1)抗原：免疫动物是制备抗血清的第—步。免疫所用的抗原可用病毒、细菌或者其他蛋白质抗原，如果使用半抗原如小分子激素等，必须与大分子载体连接，连接剂见表7—1。抗原的用量视抗原种类及动物而异，—次注射小鼠可以少至几个微克，免、羊甚至更大的动物每次注射的量就相应增加，从几百μg／次至几mg／次。〔2)佐剂及乳化：佐剂可以帮助抗原在注射部位缓慢释放，以增加免疫刺激的效果。佐剂有完全和不完全佐剂之分。完全佐剂加有灭活的分枝杆菌(如卡介苗)或棒状杆菌。福氏佐剂可从试剂公司购买，也可用羊毛脂和石蜡油按1：2—4混合自行制备。佐剂与抗原按1：1的比例混合乳化为均匀的乳液，放置后不会发生油水分离。(3)免疫动物：常用于制备抗血清的动物打豚鼠、家免、小鼠、大鼠等，如果大量生产可用动物羊、马等，动物接受免疫的乳液量小鼠为1．0—2．0mL，家兔为2—4mL。抗原免疫动物的途径取决于动物种类、抗原特性和是否使用佐剂。腹腔注射(i．p)，肌肉注射(i．m)，皮内注射(i．d．)和皮下注射(s．c．)适合于任何抗原，这些途径主要刺激局部淋巴结发生免疫应答，初次免疫和免疫加强注射均可使用。静脉注射(i.v.)则只适合于可溶性抗原及分散的单细胞悬液，且不能使用佐剂，其诱发的免疫应答主要发生在脾脏。此外，在单克隆抗体制备时，亦可用脾脏直接注射或体外免疫方法，尤其对微量抗原比较实用。体外免疫方法也常用于人源单克隆抗体的制备。体外免疫时将脾细胞或外周血淋巴细胞(包括B细胞，T细胞及抗原递呈细胞)与抗原一起作体外培养，然后再与骨髓瘤细胞融合。初次免疫后要经过2—3次以上的免疫加强以保证能形成较高水平的IgC抗体。两次免疫注射之间的时间间隔，一般3—4周比较适合大部分动物，小动物可间隔10—14d，大动物则在2月左右。在免疫加强最后一次注射后的一周内采集抗血清，可获得高水平的抗体。2抗血清的纯化与保存（1）采血：加强免疫的动物2—3次后，可通过耳静脉或眼球(小鼠)采血，进行抗血清效价测定。当效价达到理想的高度后，可以采血。采血方式可以从心脏直接取血，也可通过动脉放血。待血液凝固后用针筒或吸管吸取血清。(2)抗血清的纯化与保存：除抗体外血清中含有多种其他蛋白成分。为了避免这些蛋白质干扰抗体(免疫球蛋白)标记反应和抗原抗体反应，抗血清可经过纯化以获得单一的机体(常为IgG)组分。常用的纯化IgG的方法为饱和硫酸胺盐析和层析法。蛋白质在不同的盐浓度的溶液中，其溶解度不一样，盐离子干扰蛋白质和水分子间氢键形成，因为水—盐结合比水—蛋白质结合更稳定，蛋白质即可从溶液中沉淀出来。蛋白质分子越大，沉淀时所需盐离子浓度越低。免疫球蛋白(Mr1.5×105)比血清中主要蛋白质白蛋白(Mr6.7×104)的分子大得多，抗体在30％—50％饱和度的硫酸盐中析出，而白蛋白需在70％—80％饱和度才析出，因此常用33％饱和度的硫酸胺纯化血清中的IgG。盐析时为了减少抗体变性，需在4℃进行，同时用pH8.0缓冲液稀释抗血清，以减少蛋白浓度过高而发生共沉淀。铵盐的溶解度不随温度变化而明显改变，0℃和25℃仅差3％，而钠盐则相差5倍，因此常在低温沉淀时用铵盐，室温沉淀用钠盐。铵盐对抗体的标记反应(如FITC和biotin标记时)有一定的干扰作用。盐析法只能部分纯化抗体，更高纯度的抗体制剂可用层析法制备。IgM五聚体相对分子质量达9.7×105，比血清中任何其他蛋白都大，用分子筛层析很容易将其纯化。IgG在PH8．0时带负电荷，能与DEAE纤维素上的阳离子结合，因此可用离子交换层析来纯化IgG。IgG纯化最常用的方法为亲和层析。IgG与葡萄球菌A蛋白和链球菌G蛋白具合高度的亲和性，可用这两种蛋白质交联亲和层析柱将IgG纯化。大部分IgG与蛋白A结合PH为8—9，洗脱PH为2—4；而与蛋白G的结合PH为5—7，洗脱PH为9—10。C蛋白更适合于IgG的纯化，不但反应条件为温和的弱酸性或弱碱性，并且与IgG的结合力高于A蛋白。G蛋自能与大部分动物种类的IgG结合，而A蛋白对小鼠IgG1、大鼠IgG2b、人IgG3、马和绵羊IgG结合力弱或不能结合G蛋白和A蛋白均不能与鸡IgG结合。抗血清或纯化的抗体在低温保存可维持活性数年，反复冻融使抗体很快失活，被细菌或霉菌污染的抗血清或IgG制品也易失去活性。稀释的抗血清加入防腐剂叠氮化钠和保护剂如BSA等可于4℃保存。长期保存常用等量甘油于—20℃以下冷藏。也可置于50％饱和硫酸铵中4℃保存，还可以冷冻干燥保存。3抗血清的特性鉴定祸根略据不同目的剪制备的抗血玻清，对其中同所含抗体的迁浓度，特异针性及免疫球啄蛋白种类的捎要求也不一纠样。为了获动得质量和数呈量上合符要秃求的抗血清蝇，在收集动考物血清前必鲁须对免疫效治果进行检测法，对收获后焦的抗血清也席必须对借—粉些参数进行推分析，如效劈价、亲和力乌及交叉反应害等。根闸据不同的抗博原性质选用警合适的检测问方法。最常仿用的为免疫嫁沉淀，EL耻ISA，放寨射免疫等。征效常价又称滴度联(tite慧r)，是常另用于表达抗花血清中特异芒性抗体相对何含量的苗—雪个半定量指撕标，即在给存定的条件下燕，结合走—腹定量抗原的器抗血清的稀严释度。抗血秘清经一系列怨稀释后(如园倍比稀释)将与定量的抗汽原反应，以造能检测抗血今清最大稀释厦倍数即为该析抗血清的效授价。不同的累检测方法测评定同一种抗泄血清的效价植，灵敏度不续一样，抗血启清的效价也督不一样，如择沉淀反应(碌琼脂双扩散卧)与ELI名SA二者的伟效价相差甚尤大，后者远晶高于前者。楚放射免疫分香析(RIA崇)常用于标要记小分子抗授原来检测抗扇血清的效价单。塑亲抬和力(af做fin从ity)表怕示抗血清与杯相应抗原的浴结合强度，肺是描述抗体蒙持异性的重受要指标，奖常用亲和常陡数K表示。妻亲和常数K寿与抗原抗体饥反应的平衡怪常数有关：皮赞购K撕+室平A电g＋Ab傲任A滤gAb吹相框K贝－贪[AgAb厌]缝叠岔K裕+强K=给痰靠K芒=截[Ag][地Ab]晓剃医K剖－俩袭式中K咬+皂为结合速度脚常数，K泥－霸为解离速度冠常数。亲和崖常数K的测捡定见第二节旅抗充体特异性与蓝交叉反应：裤抗体是特异野的。只与相淡应抗原反应口。实际制备巩的抗体却常鞋有非特异性哗反应，这是弟因为抗原不蜘纯造成的。每多组分抗原借之间存在共协同的抗原决黑定簇，或者凤两个抗原决晋定簇结构类胁似能与同一全抗体结合，走均可出现抗译体与异源抗讽原的交叉反吐应。用琼脂为双扩散能简帅便直观地反作映不同抗原厘与同一抗血欣清，或不同伶抗血清与同捉一抗原的交振叉反应。勇二掀、单克隆抗烦体的制备留1朋制备原理拍单识克隆抗体(删MAb)与叠抗血清(又届称多克隆抗壤体，PAb校)最主要的岗区别是MA意b为单一种添B细胞克隆孟所产生的一紧种均一的免陕疫球蛋白分老子。所以M平Ab是B细滤胞克隆的标粒志，是一种营独特型的抗所体，它的特渗异性是针对倍一个抗原决话定簇的。制访备单克隆抗曾体不能用化哈学分离的方班法从多克隆浴抗体中去分夕离纯化得到汪它，而是用坛分离产生抗供体的B细胞饶克隆的方法枯得到它。为告了使B细胞纸克隆能在体仪外人工培养判下长期存活联并产生完全却均一的MA兼b，G．K顿Ö贿hler合撞Milst僵ein于1者975年创沿立了杂交瘤救方法。所以装制备单克隆泪抗体的技术肺又称杂交瘤问技术(hy耕bredo丽mate爸chniq羊ue)。悟杂陕交瘤技术的止基本原理是现用分泌抗体脂但不能长期禾培养的B细勤胞与能在体阔外长期培养宇并可低温保子存的肿瘤细贪胞进行杂交冈。筛选得到浇的杂交瘤细希胞应该是既隙能分泌抗体藏又有瘤细胞总的特性，可博长期传代培拜养，又可在舞液氮中保存压的细胞。把危这些细胞单夜克隆化，用务单克隆化的薯杂交瘤细胞许进行单克隆盘抗体的生产算（图7－1膜）。犯2．B慈细胞与瘤细垒胞的来源及哲杂交瘤选择尖原理宫最雾常用的单克支隆抗体是小左鼠的单抗，娘此外也有大凯鼠的和人源甩的单抗。人兔源单抗制备短比较复杂。默小鼠单抗的敞制备通常是广使用Bal院b／c小鼠帆的B细胞和想它的骨髓瘤克细胞。大鼠幅的单抗制备颂通常用Lo骗u／c大鼠则及其骨髓瘤仙和Y3／A样O大鼠及其犹骨髓瘤细胞虚(表7耐—告2)。B细你胞是从免疫烘动物的脾脏族中分离出来格的。动物免辛疫方法与抗尿血清制备相晚同，只是在嫌制备脾脏前骂3d必须进矮行一次静脉班加强注射以痰保证得到的谱B细胞有旺附盛的分泌抗钱体的活性。蒙骨髓瘤细胞扛有许多细胞铜株是经过诱醒变和筛选得歉到的缺陷型立。筛选的标下准是拆①阻瘤细胞本身春不产生抗体唱或者产生抗痒体的某种链皮，但不能分漏泌；无②宿是次黄嘌呤破鸟嘌呤核苷膛酸转移酶(值HGPRT谅)和胸腺嘧雀啶激酶(T吼K)的缺陷貌型。因为这掘种缺陷型的塔瘤细胞正常聪的核酸合成流途径被氨基朱喋吟(am灯inopt派erin)还阻断后，由枪于缺失这些株酶，即使补役充它的底物匹次黄嘌呤(缺H)和胸腺五嘧啶(T)良，核酸合成线的旁路也不睛能起到救援裹的作用，结叔果导致瘤细赢胞死亡(图蚀7懂—正2)。而杂润交瘤细胞因绝带有B细胞桨的全套基因去，在HAT包存在的条件厌下借助于H应GPRT和躲TK的作用睬通过替代的腥核酸合成途猜径能正常合旋成DNA和希RNA。所制以杂交瘤能餐正常地生长端繁殖而被选弱择出来。未证被融合的游蔬离的B细胞继只能存活3蛛d而后自行博死亡。这就鬼是用HAT涌培养基进行舒选择的原理萄。驼3．泪细胞杂交与切选择培养斑(芦1)融合：伸细胞杂交之内前，要分别说准备好脾脏球的B细胞悬茎液和小鼠骨流髓瘤细胞(咱如SP2／牺0袖—风Agl4细摇胞株)。免进疫后的小鼠种脾脏在无菌捉条件下破碎虎，将B细胞赛悬浮在没有骄血清的培养牙液中(通常沃使用RPM子Il640飞商品配制)裤，并洗涤3足次去掉小鼠睛的血清。S膀P2／0细嫌胞是用加有惠10％胎牛侮或小牛血清舞培养的，每厘天更换新鲜毒培养液使成耗为对数分裂功期生长旺盛挡的细胞。细蜂胞用RPM帅Il640拜洗涤2屯—往3次，把两温种细胞合并姨在同鞠—泼试管中，用扮50％的聚穗乙二醇(相境对分子质量脚为1000皇—揭1500)霜作为融合剂网，在烤37蝇℃焰条件下融合屑l夹—皮2min。手然后用16唯40培养液铲缓慢稀释，卸然后除去P见EG，将细毙胞分散至H帅AT选择培妥养板中。电谢融合方法也吉可用于单克投隆抗体制备布，虽融合率托较高，但一箩次融合的细银胞数少，且继需专门设备扶，故限制了登其广泛使用萌。融合时脾糕细胞和骨髓咏瘤细胞的比璃例在5：1离—候10：1均饭可获得满意济结果，每次亲融合细胞数室量在10野7泊—宇10宰8飘较为合适。妇融合后的细宜胞在40或渐96孔板上引的HAT培反养液(RP炒MIl64能0含10％饱—恭20％胎牛煤或小牛血清险和HAT)妻中散37妖℃食，5％CO营2尚条件下培养苹。融合后的王细胞悬液中杯只有脾细胞们和骨髓瘤细环胞形成的杂胡交瘤细胞能南在HAT培插养基中生长测，其他形式垮的融合细胞免均不能生长削．未融合的隙细胞也不能断在HAT培陷养液中生存顽(表7骗—姐3)。鼻在别融合后的细确胞培养过程桂中，饲养细坛胞(fee势derc吹ell)有捆助于杂交瘤协细胞的生长卫。饲养细胞武可用同种动喇物的腹腔细朋胞或胸腹细略胞。腹腔细墓胞中的吞噬鞋细胞能清除妨死亡细胞碎彩片。使背景退更为清洁省“转干净祝”津。同时饲养毅细胞分泌的捕细胞因子或薯活性物质有对助于杂交瘤懒细胞的生长奥。现有商品移“肠杂交瘤细胞以生长因子勒”扶可用于替代固饲养细胞。前(倘2)阳性杂汪交瘤细胞的刘筛选与单克霜降化：杂交颈细胞经约1悲0凑—呀14d培养株后，形成可针用的细胞集淘落(克隆)解。经过几次释更换培养液涛(HT培养福液)后进行冷抗体活性检震测。常用的纲筛选枪测方魔法是ELI进SA和凝集霜试验，前者必常用于可溶缩性抗原，后旁者适用于细册胞、细菌等且表面抗原。粘此外，Do却t－ELI陪SA、免疫蒜印迹及免疫叮荧光试验均罩可用于杂交龄瘤细胞的筛御选。籍使许冻多细胞克隆轰混合生长的胜细胞分离为脂单个的细胞溜克隆的过程拉称克隆化(仇colon索izati无on厉)最常用的展单克隆化方聋法是有限稀纯释法(li遵mited饿dilu迎tion)挪，即将混合阅细胞经稀释冤后分装于培眠养板万上，使培养须板的大部分读孔中只出现取一个细胞。铅为了确保抗柱体分泌细胞缸来源于单个悄细胞，克隆耐化过程可重民复进行，称担为亚克隆化撤(subc种loniz姓ation条)。除有限痛稀释法外，页荧光激活细膨胞分拣法平(FACS设)也用于杂蚀交瘤细胞的排克隆化过程龟。黄4悔．单克隆抗绘体的扩大生决产扩产两生特异性抗瓣体的单克隆驻杂交瘤细胞朽株应立即扩测大培养，以怕获得足够的巡细胞用于保逗存和生产可糟供应用的抗乡体。生产大毕量单克隆抗粥体的方法目多前常用的有牌3种：小鼠活腹水制备，倦大瓶培养和炼中空纤维反枣应器，前者漫多用于实验谊室制备，后昌二者适应于蓝工厂化生产殃。罪腹论水制备：杂次交骨髓瘤细墨胞在腹腔中豪定植，并产慧生大量腹水码。选用与单晴克隆抗体制肥备所用相同妇的动物品系挤或者含有相阶同基因的F肺l代杂交品营系。杂交F泼1代品系更温适合于腹水炸制备，如果恢用异源动物松制备腹水时北可选用无M研HC限制性伞的裸鼠。用冒小鼠制备腹溉水时，先用父矿物油或P深rista想ne致敏，会以抑制其免材疫功能，利臭于腹水的形削成。腹腔注秀射10洁6犬—越10碌7罢个杂交瘤细美胞，经过7容—再10d后优形成腹水。苦每只小鼠可絮获得3量—蹈5mL腹水膀，每mL含吊IgG抗体您可达5暑—谋10mg。树腹水中含有哗较多的杂蛋帽白和非特异博性IgG，铜并且含有许料多蛋白酶，办易使抗体失棉活，因此腹咳水收集后应轿尽快纯化，东以防止降解追。号大碗瓶培养：采绢用1000拍mL或更大回的摇瓶培养愁。大瓶培养育上清体积大摊，但抗体浓爹度低，给抗帝体纯化带来慌很大困难，久消耗人力和祝培养液，增还加生产成本教。蜂中社空纤维反应奉器：是比较藏经济的单克溉隆抗体生产棍方法。该装纹置由具有半菌透膜性质的逆成束的微孔暂纤维组成，慌杂交瘤细胞葬位于纤维外快部的小量培冶养液中，培涨养液在纤维另的微孔中循答环，供给营歌养和带走废脾物，抗体大挂分子和小分李子化合物被龟隔开。高密剩度的杂交瘤范细胞能在此站系统中维持右数月，每天柄可产生数百揪毫克的抗体瓣，抗体浓度圾高，体积小掌易于纯化。帽胎(小)史牛血清一直唤是细胞培养着所必须的，章在单克隆抗辟体生产过程仅中培养液中锄的血清蛋白鹿使抗体的纯泡化增加了困僻难，近年开锐发的无血清刚培养技术已伶逐渐用于单算克隆抗体的唯生产中。跌5格．人单克隆演抗体的制备卫小游鼠的单克隆抵抗体蛋白应割用于人体后喉，作为抗原饺能引起人的闸免疫应答，慈大大降低其糕生物活性，苍并可能导致生变态反应。确因此人源单火克隆抗体在裹临床治疗上廊有广泛应用咳前景，引起祝人们的普遍男兴趣。但是托人单克隆抗口体制备存在塔许多技术上绝和伦理上的狠障碍，如人阁杂交瘤细胞备系不稳定，蚀有些抗原不叉能对人进行浪人工免疫，两人B细胞只剧能从外周血柱中分离而无阿法从脾脏取毙得等。尽管才如此，一些呆人源单克隆仙抗体已经获朋得，技术上升也在逐步完种善起来。妇人险的瘤细胞株圈U律—乱266常用述来与人外周萌血B细胞融杆合以获得人贡源单克隆抗锅体。另一些聪淋巴母细胞纽抹(LCL昆)则来源于慎EB病毒转秒化的淋巴细围胞，如GM难l500，耽W1旬—坚L2和AR捎H77等也叶用于杂交瘤妻细胞的制备抖。这些细胞鼠系表现ED胀病毒核抗原起(EBNA刊)阳性，且蕉形成的杂交宽瘤细胞抗体扰的分泌水平因不高。驰获迁得人单克隆袖抗体的另一驻方法是用E称BV直接转蕉化某些抗体都分泌细胞，戒使之成为购“纠不死含”乞的细胞在体臂外培养。E个BV感染人撞B细胞后，址病毒基因插棍入人B细胞姻基因组中，梦有1％的细意胞转化为罩“晴不死狭”爸的细胞。B压细胞转化可杜通过版“偿病毒驱动拴”浅和奸“匙细胞驱动虽”诞两种方法获轰得。前者是贺将B细胞与惰分泌EBV舒的B95盒—粗8细胞系一涨同培养，后山者则是与E政BNA阳性焰的LCL细反胞一同培养轰。境“哈细胞驱动译”研转化的B细晴胞比较稳定倾，抗体分泌祖能力也较强难。电人贯淋巴母细胞是系和人杂交始瘤细胞较难枪获得，人单铅克隆抗体也息可以通过异午源杂文的办众法制备，即今将EBV转续化的B细胞芒与小鼠骨髓兼瘤细胞融合者，将获得的宾异源杂交瘤坝细胞再与免域疫后的B细记胞融合，得耽到人单克隆飞抗体分泌细胁胞，不产生话自身免疫球遍蛋白，EB异VA也是阴朝性。吐三束、基因工程长抗体的制备票1值．抗体的化届学修饰访抗双体Fc段用太双功能连接孔剂与荧光素毅，同位素，撕酶，发光化亮合物，稀土刊元素以及药接物，毒素等绍连接后，并植不影响其F软ab功能区松与特异性抗泪原结合。根斜据交联物的些性质不同，雷标记的抗体祝可用作诊断仍试剂，也可府作为药物的挑定向载体，誉引导药物或等毒素到达抗叮原存在部位袋使药物或使量毒素发挥更钱有效的作用敞，即俗称纲“滥生物导弹乖”孙。从而减少夜药物、毒素夺、同位素、摄酶在肿瘤治聋疗过程中引务起严重的副速作用，大大具提高治疗肿笛瘤的效果。脆许犬多毒素如蓖丹麻毒素，白恭喉毒素，天介花粉，红豆材毒素等均为练蛋白质或糖努蛋白，可用笔双功能剂与谋抗体相连；泥吗啡，前列唯腺素，氨甲惊喋吟，磷酸为酯酶C等含悔有羧基能用童碳二亚胺(宾EDC)，饭混合酸酐法吨与抗体的氨批基形成酰胺竭键；同样，怕含脂肪胺的今药物如庆大跌雷素，阿霉指素在水溶性赠EDC的作渗用下与抗体偷的羧基连接锋；而含芳香陶胺的药物则张先在低温下旬与亚硝酸作疮用形成重氮苗化合物，再先与抗体分子者上的酪氨酸沙或组氨酸残痛基形成偶氮球键。总之通刑过抗体的化毒学修饰把抗连体的特异性妹用到定向给站药和定位检少测上。腰2全．抗体基因闪文库国抗凶体基因文库港(anti棚bo刃dyre梁combi感natio鲜nlib将rary)沉是将不同的皇重链和轻链引基因随机组诱合，克隆到维合适的表达短载体中，在获原核细胞表务达不同的抗宰体，形成一柏个抗体库，后从这个抗体炕库中，用抗鄙原可以筛选扭到相应的抗妙体基因(图亡7顿—束3)。抗体渗基因来源于叨杂交瘤细胞疗或动物B细丧胞(免疫或优未免疫)的免DNA和m坝RNA。词用质粒作为裕抗体文库的车载体，虽然总也可能表达凭有活性的抗真体分子或片据段，但由线旦状噬菌体表胖达更为方便及有效。M1含3、fd、及F1等噬菌冲体的外壳蛋狗白由5种蛋苍白组成：p掘Ⅲ纵、p秀Ⅵ海、p竹Ⅶ荒、p沉Ⅷ伟和p叮Ⅸ俭。每种含量标不一，其中肥p索Ⅷ疏含量最多，模每个噬菌体拉有2700码个p雁Ⅷ欺亚基，其余码4种蛋白仅哀5个拷贝。冰增加噬菌体哄外壳蛋白的芬长度并不影恐响噬菌体的钟装配，抗体键以融合蛋白乔的形式表达绿于噬菌体表风面。噬菌体悟表达质粒常批用的有fd课－CAT1芝、fd－t昂et－DO音G1、炼P贩HEN1、套pComb怖3和pCo凉mb3H等忠。抗体融合麦蛋白构建多亏用p哨Ⅲ优和p争Ⅷ箱，p诸Ⅷ揉拷贝数高，坦低亲和力的冤抗体蛋白容昏易筛选出来办。撑在噬菌体表五达抗体时，牛常常不表达欧完整的抗体姥分子，（因室为C图H炕2上不能进悄行糖基化）味。根据不同烛的引物得到剖重链的V炕H尿或V摸H衫C奶H据1区，轻链冲的V眼L六或V狼L齿C筝L鞭区。V奉L乌和V薯H甲两个片段用锁一短肽作连滤接片段，形趁成单链可变泪区（sin玩gle－c平hain葛fragm眠entv樱ariab沈le，sc卸Fv）；V华H薯C蝇H英1和V艰L碑C钻L潮两片段则形伍成Fab片蛋段。另外，应单独的V举H狱和V圆L红也能结合抗井原，如果二赔者形成同源座或异源狭二聚体(d峰Ab)，则桑稳定性和亲吃和性明显提冠高(图7幼—替4)。此外墙在抗体片段握DNA末端舞加上一些功充能蛋白(如慨碱性磷酸酶晃和蛋白毒素纺)的基因，相则表达的抗遭体就带有一宏定生物活性糕功能片段，秘可用于检测暗或治疗。如证果在抗体基榨因末端加上池终止子(T桑AG)则表哄达的抗体片唐段是可溶性渠的，而不是阶结合在噬菌愈体表面。爷用特异由性抗原免疫籍的动物B细喝胞构建抗体忽的噬菌体文伸库，抗体亲挎和性高，用如与免疫抗原娃不同的抗原罩筛选得到的蔬抗体亲和性祸普遍较低。贿可用模拟天润然体细胞突滋变的方法来芦提高亲和力洽。如混杂重沾组法，即将恶己获得的轻露链或重链的拉V片段切下句，再克隆至途随机的文库驻中的V区构磨成二级文库危，使H链和饥L链混杂，摇可以使抗体食片段的亲和震性提高。利严用PCR错缠配将随机突罚变引人至抗知体的抗原结侧合区，也能中提高对抗原越的亲和力。记先用低亲和采力的载体在扇噬菌体的P粒Ⅷ疲表达，筛选分后、将抗体驶基因片段P食CR扩增转仿至P掏Ⅲ拉上表达，可董获得高亲和瓶力的抗体片婚段。横抗链体基因文库布有两个优点并，一是从不贸适合进行人把工免疫的物嗽种获得单克轨隆抗体，如销人源单克隆辛抗体；二是梯可快速方便论获得单克隆辜抗体。只3粒．抗体基因玩的改造锋将冠鼠源抗体的算V区基因与窃人源抗体C贯区基因重组亦，获得的嵌葵合抗体(c窜himer宗ical忍antib刻ody)，斩可保留鼠抗蝴体对抗原的猎高亲和性，绪又减弱鼠源悠抗体对人的阴免疫原性，浓提高治疗性哲抗体的效果默。旋重组的嵌合歪抗体基因转乡化骨髓瘤细草胞或中国地稠鼠卵细胞(要CH0)，劫可在其中表宝达。为了进色一步地消除爽鼠抗体V区简框架区(F哭W)的异源平性，可实行跪CDR移植盐(CDR丛graft练ing)，聚以获得与鼠们FW类似的够人FW结构场的嵌合抗体筹。读噬符菌体表达的建抗体仅含V喇区(scF条v)或Fa电b片段，缺优乏Fc区，被使抗体的稳沟定性下降，判半衰期缩短挤，与Fc受强体结合功能骗也消失。因防此在抗体功遮能片段的末博端连接A蛋扎白、酶、细你胞因子、C疾D4和毒素上等分子，既馅可增加抗体乳片段的稳定逃性，又可发曾挥某些生物泄学活性功能膏。励用泰抗体基因工帖程方法获得分的抗体与效油应分子交联但物比用化学拥交联法具有讽优点：可以同大量生产，欧不会因修饰养作用影响抗映体及效应分悔子的活性，蹄效应分子还橡可根据需要图进行改造。阀此烫外在抗体片凤段的末端连索接一段特异旷的双亲性螺既旋(amp恩hiphi朗lich火elixe贩s)结构，偿如亮氨酸拉雄链结构(泳leuci缺nezi悦pper)浪，可使单价际的scFv贤或Fab片伙段在体内或鸭体外形成稳义定的双分子所聚合体，从珠而提高抗体篮片段的亲和搭力。此法也台可用于制备耻双特异性抗筐体。殊4陈．基因工程旱抗体在真核跳细胞中的表池达巴噬菌体表黎达的抗体片捎段常常是在蛛原核细胞(掘E.col蔬i附)中完成。抢原核系统表咸达抗体片段谣产量稀高，成本低蛇，快速易于氏操作。但抗嗽体片段在原斜核表达系统装中不能进行摊CH2糖基叠化，从而影锻响抗体的活齐性。因此重鉴组抗体基因历片段可转移违至适合的骨损髓瘤细胞系狡或哺乳动物嚷细胞系(如拨CHO)，倚甚至于植物缎细胞中表达银，可以得到测与淋巴细胞怎表达相同的仍抗体分子。肌免疫球蛋白纸IgA宅的重链和轻吼链及分泌片肚基因可以分田别转化不同努的植株，将摘表达这些蛋体白的植株进构行有性杂交鹅，在杂交后圾代中可以装绘配成完整的冠IgA双分布子。以植物否作为生物反冠应器进行抗常体的表达已响有许多成功艳的研究报道巨，与动物细割胞相比更为穴经济，具有狐广泛的应用阶前景。绵四搜、催化性抗驼体的制备存1梨．抗体催化触的原理耗1零986年，敲由P．G．冈schul喘tz和R．咐A．Ler师ner分别埋领导的两个零小组同时证饱明抗体具有戴催化活性。韵针对一个四结面体带电荷爆的磷酸酯半响抗原产生的承抗体，能有强选择性地催赛化相应的碳标酸脂和羧酸局脂的水解反伯应。他们将绩这种有催化友活性的抗体累称为催化性左抗体(ca吉talyt胁ican死tibod跃y)，又称爬抗体酶(a彼bozym雹e)。催化阅抗体的作用被取决于底物必分子水解时盲的转换态(灰trans席ition放stat样e)(图7刻—火5)。转换愚态的分子结笋构是分子活品化后的一种殊结构状态，钢处于转换态确的分子具有锣最高的活化扶能，分子表橡现极性。处缓于这种状态违的分子也是振最不稳定的超，能与这种屑分子结合的谷酶或者抗体去会使某些化展学键发生断妈裂(如酯键趟，碳键，胺室键等)起到途酶解作用。清可见抗体酶亿的作用与天耐然的蛋白质卸酶非常相似乏。抗体酶也棍表现出对底凯物的专一性浆，对立体结喊构的专一性暂。在饱和动读力学与竞争督性抑制方面历都与常规酶终相似。所以诊抗体酶的发葛现打破了只淹有常规酶才拆有的分子识杯别和加速催球化反应的传茅统概念，为托酶工程学开胁创了新的领枝域。丧2锹．抗体催化市的化学反应对由依抗体催化的优化学反应特异异性高于酶件，但催化速葬率低于常规见的酶，只有担l0尤3爆—夸10狮6霞倍。但有一筹些未发现催悼化剂的反应让，如Die奶ls模—崇Alder暂反应也能被柏抗体催化。协常规酶一般处不能催化胺赏键水解，抗加体酶能使胺样键水解的速揪度增加25帝万倍。讫今制为止，已发刻现和证明的渠由抗体催化侵的化学反应埋不下40种临。嗽3条．催化性抗尝体的制备怒抗坏体酶是抗原繁决定簇处于窄转换态结构戏的抗体。因向为转换态分渠子极不稳定麦无法制备抗勇体，所以催紫化性抗体的器获得主要是蛙通过设计稳飘定的转换态昌的类似物作谋为半抗原，衣与载体蛋白屑交联后，免依疫动物，获聚得针对半抗将原的抗体，庆从中筛选具殖有催化活性亭的抗体。筛瞧选催化性单尸克隆抗体所假用的ELI恋SA与筛选榜一般抗体的降方法不完全警一样，应根峡据催化反应公的特点而进委行适当的修渗改。经典的制方法是先筛双选出与底物哈或半抗原结故合的抗体，多然后从中再攀筛选出有催茶化活力的抗醋体，这种方投法费时费力园。利用催化厕性抗体对底严物的催化活仅性，对底物葡进行适当修逮饰，使催化锁反应的产物找可直接表现版抗体的催化设活性，这样致可以简化检望测步骤。蜓转通换态类似物袍半抗原的设伤计，必须了森解催化反应异的转换态模右型的结构特浮点。催化抗寻体的抗原结祖合位点上与塞转换态互补掏的某些催化罪基团的形成炒，能稳定转叼换态分子。锐此外有人把织单克隆抗体共分子用化学末修饰方法引倚入一些活性校基团，提高脑催化性抗体坏的催化与亲暮和效率。应蛙用噬菌体抗荒体文库也可钢以筛选催化提性抗体，可快省去制备转忙换态类似物李的复杂过程妙，直接用底籍物从文库中肾筛选有催化疤活性的抗体点片段。如用危半抗原免疫均后制备的文珍库或文库经菊过多次混杂厉重组，则可起以得到更高喷的亲和力的勺催化性抗体劲。抗独特型际抗体也用于棋催化性抗体跌的制备，用叶酶作为抗原精免疫小鼠获斯得能够封闭线酶活性位点脸的单克隆抗畅体，将这个址抗体用蛋白拍酶除去Fc吐片段，用F慨ab免疫其径他品系的小抛鼠或家兔，像得到的抗体吓具有相应的却酶催化活性糠。察从径理论上看，霜B细胞具有尽全套免疫球伶蛋白的多样林性的胚系基佣因，当然也当包括有催化楼作用的自身害抗体在内。刃然而198笑9年Pau勺lW.首烈次报道了人胖体的一种能开催化蛋白质从水解的免疫服球蛋白。它堆是宏—忌种自身抗体侧，能水解血哄管活性肠肽匪(vaso倒activ谈eint友ensti梁nalp狠eptid问e，VIP昼)的Gln他l6搂—仿Met17屡键。用VI膀P作为抗原站能得到有催但化作用的单斜克隆抗体，粪也能催化洲Glnl6吵—疼Met17谅键。大约有牢17％的人检有这种自身衰抗体酶，但警患有气喘的掘病人中该抗闹体与VIP纽的亲和力比眨健康人高5纠0倍。由于贪VIP是一岭种气管松弛惑剂，因此有纲人认为这种颂VIP自身胡抗体的长期鞠作用可能与血气喘的过敏景应答有一定备关系。由此追推测除了人其工设计催化纵抗体以及发纸现的自身催瓶化抗体外，根用筛选单抗阵的方法，也隶有可能找到典所需要的催献化抗体。艺第二节牺抗原抗体反她应原理沿抗梦体能特异性骨地识别相应牧的抗原，并担与之结合。腰这种结合在龙体外也能发休生，这种特年性就是许多吼免疫检测方详法的基础。候抗原与抗体批相互作用是枝非共价的，同可逆的，其园特性符合许撒多化学反应佛的基本原理孙。但因为抗盒体分子的结占构特点，以膛及抗原分子德结构的多样慢性，使抗原躲抗体结合反再应表现出复嗽杂性。驻一、抗斥原抗体作用恶的热力学与届动力学殃1悄．溶液中抗描原抗体的化市学平衡倘抗议体与抗原的射结合是非共摄价结合，二钟者在结构互译补适应的基雷础上通过范钥德华力(v耕ande谣rWaa道lsfo汇rce)、尖静电引力、涂氢键和疏水盈作用等次级岔键相互作用荣。因为结合姿是可逆的，税结合与解离屯的强度在槽—茫定条件下取仓决于抗原与著抗体的亲和墨力。如果以图S代表抗体澡结合位，即稳互补位(p忙arato子pe)；以阶L代表抗原晒决定簇；以厚SL代表抗证原与抗体的恢复合物，则反抗原(Ag脂)与抗体(栽Ab)在溶有液中的反应暮如下：坝政K响+食览爷偶妹K落+秤Ag＋Ab汁贯AgA距b即S＋苍L方淹百SL荒旺K趋－咐刚愁钟忠K孕－肌K湿α漏＝[SL]正/[S][让L]＝K蜂+推/K尺－聋徒抗原抗体结酷合形成的复矛合物的浓度绞为[SL]堵，游离的抗昏体结合位的块浓度为[S屑]，抗原决怖定簇的浓度桌为[L]。西在反应早期佣复合物形成凡很快，一定尊时间后逐渐洲慢下来，直京至复合物的皮形成与解离绢达到平衡(厅图7松—蛋6)。此时孟抗原抗体复锈合物的浓度女[SL]与傲游离抗原表樱位的浓度[功S]和游离翁抗体结合位廊的浓度[L倦]之比K位α竟是平衡常数暗，又称为内迅在结合常数驻，或称内在辜亲和力(i柜ntrin雅sica生ffini慰ty)。管K扰+龙和维K避－肯分别为结合斥和解离反应唉速度常数。派在此恒定的条件洲下，如温度突、pH、离鸟子强度等一拔定时，K帽α和是一个常数寸。改变抗原钩或抗午体的浓度，永复合物的浓列度也相应改斑变以达到新昏的平衡，在附一定范围内井如果[S]陪与[L]增争加2倍，则简[SL]应肠该增加4倍挤，但实际上恋会少于4倍抓，因为Ag绿—剖Ab复合物似的浓度[S脚L]是抗原雾抗体的一部证分。如果上警述浓度都以补摩尔浓度m喷ol／L表盟示，则是涨K茄α邻的单位为浓喂度的倒数(躲L／mol滔)。如抗体帐的肠K绣α炎在10书7进—袖10圆12秧L并／mol为哭高亲和力抗呆体，察K桑α泻低于熊10辱7胡L烧／mol为题低亲和力抗熟体。知如三果以解离常杠数(揭K谦α拾)描述抗体专的亲和力，垮比毁K武α纯更简单方便吹，Kd为粉K锣α济的倒数，即汽Kd＝1/秀K州α絮，单位为m巧ol/L。击K弃d值越大亲督和力越小，蓝Kd越小亲夹和力越大。德2朝．抗原抗体址反应的自由欲能变化功抗暂原抗体反应孙的自由能改帖变与近K丙α备相关：筐Δ总F挖0丧＝挠—现RT愚ln店K肥α导，践K京α驴＝e抗－ΔFˊ/扒RT魂，这里R＝或摩尔气体常蔽数[8.3督1J／(m爹ol物·农K)]；T扇＝绝对温度加；ln＝自抱然对数；e俊＝自然对数糠的底数；铜Δ屈F炼0丈＝标准的自康由能变化，延规定质Δ互F模0挽＝1mol包S与1mo指lL形成魔1mol奏S搬—兵L时自由能培的变化。负商号表示自由腿能为负的变凳化。生从魔上式可以估冻计：当抗原串抗体结合亲烧和力增加l爬0倍，则1相n10＝2骡．303，法37则℃骨(搅3l寺0．15K集)时的桨Δ绳F漫0农＝5.94艳KJ／mo缎l，温度低朗于债37雕℃闻时岗Δ狮F掏0辞更小。这种蝶自由能变化框还不足单个欣氢键的能量尿(约18．芳81KJ／骑mol的1计／3。即使娃亲和力非常择高，努K坡α干＝理10假10恭L墙／mol，忙Δ击F缝0拥只有5．9名4KJ／m名ol，仅相装当于3个氢睬键的结合能足。当抗原与露抗体间形成允氢键时，水光的氢键被破孩坏，因此每圆个氢键的净娇能接近于4镜.18KJ径／mol。达由此可见抗袖体与抗原结擦合时，吸力双与斥力几乎陪相等，即使慨在很高亲和尤力下，也只毕有几个千卡智的微小差别熄。因而款Δ未F程的轻微增加缎会导致抗原悉抗体结合的绩亲和力增高洁，这就不难朽理解当抗原锋结构发生某钞些微小改变打(如化学修王饰)时，会徒引起抗原抗盏体的亲和力挎的很大变化嘴。症自由能对完K赤α呆的影响取决科于温度，然趟而自由能本揪身也受温度即的影响：资否Δ酿F素0牧＝页Δ帮H粪引0箭－裹T扇Δ筐S郊0票Δ倾H帅贩0炸为焓变，辩Δ围S下0蒸为熵变，妨T降为绝对温度门。冰K芽α策随温度的变南化如下:樱诞短d洲ln苹K概α欢扒/dT=坐Δ有H表悄0缎/旦RT崖2错或dln饺K翠α爹/d(1/毁T挺)=投Δ艇H稿衔0衣/码R袄械粗当雅氢键和极性待键形成时，黄较大的负焓弄变驱动放热旧，亲和力会扫随温度的增照加而下降。访因此抗原抗个体相互作用妥在券4网℃污比在登25蚁℃雨或爹37线℃峡有更高的亲绳和力，可见啦在给定的浓捧度下，最大滔眼度的结合洽在较低温度执下达到的。妻相反，非极帜性或者疏水跑的相互作用芒受到熵的影痕响，口T蹦Δ种S遭0丑和捡Δ王H陷珍0焦接近于零，惯所以这时温菊度对亲和力驻影响较小。直3伶.抗原抗体毕反应的动力释学证抗众原抗体反应奇达到平衡时演的参数测定熟在实际操作微时是困堆的底。反应完成属90％，只模需几分钟或含几小时，而还从90％至蜘99％则需腐几倍的时间鸽，而欲达到望99．9％夏完成时所费事时则更长，馆因为此时的运[Ag]和句[Ab]已验减少到极低分的水平。测上定一些参数直在反应的早糠期或者未到霞平衡时是可宿行的，利用匀动力学可以愁计算出抗原培抗体反应的字特征性参数遵，用以描述打抗原抗体反东应的规律：签麦秃抓哀K残+耀错性返施Ag既（S）哗＋Ab川(L)晋泪AgA夕b延（左SL辈）涂仁揭弊猜师K尘－铃亲结合反应速龙度＝K歇＋庸·其[S]堆·泼[L]寄·滋M繁-1丹·乡S楼-1驱解糟离反应速度渣=K逮-阵·挖[SL]手·彩S背-1梯达到平衡时轧，则K刚+免·圾[S]掠·益[L]＝K最-查·踪[SL]束帽K滑α池＝K备+统／K胃-义盒K冶α汇＝K定+毕／K亏-昨表明相同亲钱和力的抗体删，其结合速别度常数和解盒高速率常数眠并不一致。泪如果桌K亦+害和K庆-波均很大则抗沟原抗体复合扒物形成很快守，但不稳定设；而K套+幻和K架-诸均小时抗原寿抗体复合物稿形成较慢，畜但很稳定。买前者适合于恰亲和层析，卡后者适合于踪标记分析。啄抗袄原抗体结合瓶成复合物后押解离的速度缘常数(K掀-计)取决于结彻合键的强度极。已知抗体轮的亲和秩力和结合速龙度常数K驴+纸，根据动力画学基本公式今K氧α呈＝K扩+游／K漠-肝可以计算解掉离常速度数齿K雾-杀。业例如抗葡萄镜球菌核酸酶惕的抗体对酶什蛋白抗原的谱亲和力是8驶.3抽×驱l迹0挣8乌L浸／mol，絮结合速度常唤数K演+砖＝4．1腔×藏l费0腐5妙L款／(mol甘·馅s)，比对傍半抗原的结侵合常数低。盗由公式俗K淘α柜＝K俗+诉／K女-逗计算得到K杠-坐＝4.9普×骂10晕-4政L录／(mol本·澡s)。然后醉根据公式颗t川1/2暮＝1n2／日K稿-怪，计算半解连离期(ha丑lf－ti坡mefo竿rdis驱socia纯tion)县，得到该抗荷体与抗原复音合物的半解窃离期为23暖min。了兽解抗原抗体征复合物的半俗解离期便可盲知道结合物醒在多大的时读间范围内稀绵释而不影响症结合物的解滔离，这对在跟免疫亲和层末析等许多其爪他免疫方法蛾的应用中有始重要意义。治抗译原抗体反应咸的速度在很冤大程度上取誉决于抗原分垒子和抗体分巨子的扩散速界率及碰撞的偷机辞率。扩散速讲度常数用下安式表示：咏K粒d爱l＝4拨∏知α涨D笑(6腰×钩10款20攻)他辩α葛为抗原和抗骄体分子半经阿之和(单位次为cm)；型D为反应系集统中抗原和火抗体分子的旷扩散常数变之和(单位求为cm绳2斩／s)；6韵×奖10选20念为转换函数韵，为了把单妖位转换为L拆／(mol编·捆s)。例如章α宇＝10季-6瓦cm次，D＝10总—辈7扶cm泽2肆／s，Kd蹲l=7.5序×杠10另8律L棕／(mol矛·磨s)。通常荐大的蛋白抗烘原比半抗原受与抗体结合乳的速率要慢拌，大部分蛋宫白质的结合曾速度在10突5改—骆10蒙6残L贯／(mol妙·虾s)，而理掌论上限为需10妹9疤L标／(mol格·据s)。贿二励、抗体与单拾价抗原的作柴用蜡1康．抗体亲和枕力的测定搁抗插体亲和力的递测定的方法火常采用作图桂法。抗原抗纷体反应最简阳单的情况是绝单克隆抗体渴与单材价抗原的反膏应，如半抗板原与单克隆载抗体或单克么隆抗体与大郑分子抗原上坊单一的非重陵复的位点(芝抗原决定簇跌)的作用。鹅以最简单的兼单克隆抗体死与半抗原反朵应为例的作跌图法，首先帖用平衡透析衔(equi及libri涉umdi凡alysi滚s)(图7彻—高7A营)来测定捐—快系列游离抗轰原及结合抗秩原的浓度。飞根据不向抗值原浓匆度进行平衡唇透析所获得屋的结合抗原浇，游离抗原添。抗体浓度偏是已知的。痕根据这些数窜据，进行茄Scatc纠hard分遮析，即可计司算出Ka的拳值(图7惑—淡7B)。汉S殖catch响art分析刷方法是将K见a＝[SL贝]/[S]膛[L]分子且和分母都除佛以抗体的浓劫度，[SL佛]/[Ah撇]=r,r俱代表每个抗袍体分子结合盗的抗原(单懒价)分子数攀[S][L俭]/[Ab蹈]=[S]亏/[Ab]报.[L]＝斗(n垫—清r)C，[伯S]/[A词b];表示救每个抗体分铺子上未被抗弹原占有的游豪离抗体结合股位的浓度。棉这脊—果浓度实际上张是抗体分子热上等于全部离抗体结合位次(n)减去辅以被抗原占蛮据了的结合免位数。因为疤用的是单价站抗原，因此爸也就是减去黑结合的抗原装分子数r，宋即(n被—舍r)。这里横的n实际上台代表抗体的曲价数。C在遗这里代表抗渔原的浓度[睛L]。由此济得到公式：指玻锤肃型富当固定抗体涌的浓度用不汗同浓度的抗戏原进行一系割列的平衡透肝析实验，得补到一系列相根应的r数据熔，然后根据双以r/C对素r作图。如翻果所用抗体懂是均质的（捡单克隆抗体设），r/C关与r的关系隆为线性关系尸，它的斜率训即为亲和力哀Ka（图7李－7B）。首从公式可见吗，当抗原的忌浓度很大的得r/C违≈琴0，蝶所以Ka（捡n－r）＝钢0或Ka仆·纺n=Ka复·叙r,由图7罗－7B可见如横坐标r的庸截距就等于衰抗体价n。歌2．亲和力殊的异质性睛当途与单价抗原救结合的抗体任是多克隆抗殖体时，其S鹅catch粒ard图呈颠非线性关系酱(图7蛇—循7B)。由矛于多克隆抗姿体来源于多和个细胞克隆秋，其内在亲帆和力不同。骗内在亲和力慧的平均值K咐o常用于表基示异质的多帐克隆抗体的涝亲和力，K缝o为抗体结葵合位点1／紧2被占据时控的游离抗原牲浓度。皆3铃．抗体结合衬抗原的特异骂性派——锡半抗原反应我抗体与单价颠半抗原反应神的特异性极忽强，半抗原悔上化学基团客的细小差别确或位置的改购变，则与抗越体的反应性罗会表现明显帜的差别(图螺7悠—爪8)。抗体菊与同源抗原烘(homo荷logou剧sant家igen)巾反应最强，射与异源抗原粗(hete办rolog追ousa母ntige统n)反应相央对较弱。有稳些抗体与异腾源抗原的反伴应比同源强进，称为变态贡抗体(he航teroc缝litic吉anti钥body)拖。抗原分子鞠表面或末端僚的一些突出护的基团，具杆有免疫优势兰，是抗原决窝定簇的主要斗结构，影响幼决定簇的特误异性。抗体华的抗原结合羞部位是疏水骄的，微溶于才水的三硝基披苯半抗原与讯相应抗体形漂成亲和力很捧高的复合物雷，而水溶性货很高的糖类要、有机离子碰(如苯甲酸依盐)只能与样抗体结合形搭成低亲和力叉的复合物。滔三、得抗体与大分火子多价抗原稻的反应参1党．多抗原决绘定簇桨——出大分子抗原末的特征像能哪与一个抗体徒结合的大分肚子抗原的特牌异性部分称透为抗原决定嫌簇(ant悄igen匙deter械minan丰ts)。一顺个大分子抗格原常常有多捞个抗原决定订簇而成为多雹价抗原。抗学原决定簇的插序列结构已亦清楚的称为冰抗原表位(暖epito瞧pe)。半炕抗原相当于燃一个抗原决艳定簇。大分简子抗原上含袖有多个抗原物决定簇能与渗相应的特异怠抗体结合。扛在一些情况咬下，决定簇引之间相距较浑远的各自与奖抗体结合而搜互不影响，漂这种决定簇醉是不重叠的容决定簇。当罚一个抗体与生某一决定簇踏结合后，在彩空间上干扰塞了其他抗体举与相应决定列簇的结合，送这些靠得较便近的决定簇屡称为重叠决摸定簇。在少疾数情况下，宅前一抗体的占结合导致抗量原结构的空弱间变化，影炉响了另外抗乱体的结合，骆称为变构效扭应(all蚂oster饥icef蹲fect)透。旋许外多大分子如磁蛋白质、核易酸、复合多启糖常常形成世重复结构，乌因而每个分威子内有多个仗相同的抗原鼓决定簇。颗孤粒性抗原细厘胞、细菌及骄病毒等还可橡形成多亚基撞聚合物，也笼可产生重复去的抗原决定恒簇，成为多腿价的(mu劲ltiva撇lent)由抗原。单抗着原决定簇的信分子即半抗绑原可吸附在捉固相载体上离，其结构也普类似多价抗胃原，如EL头ISA中的甲包被抗原，古其结合特性烈和溶液中单族价抗原有所夸不同。林2辅．抗原抗体桥的亲和力和持亲合力料单侧价抗原与抗镇体反应取决绞于亲和力(惕affin训ity)的心大小，而天故然多价抗原佣与小分子半姨抗原不同，乓含有1个以刚上的抗原决喉定簇，因此络能与1个以早上的抗体结淋合。如果没耍有空间限制蚀，对重复的遥多价抗原分杜子，一个I亏gG或Ig高E分子有两小个结合位点运，而列—际个IgM有买10个结合讲位点。对任衔何一个位点是的亲和力是奇不变的，总资的结合强度晋包括抗体上她所有的结合况位的亲和力起，抗体对抗葡原分子总的己结合强度，之称为亲合力芽(avid旅ity)。再亲合力大大庄强于每一位并点的亲和力寨，其强度增超加不仅仅是怒亲和力的简减单相加，而锻是呈几何级鸡数上升的。壤因此，一个捡低亲和力的德IgM分子访，或者多个歪低亲和力的锻IgG分子撕对一个多价旋抗原的结合耽是相当紧密款的。差3苏．抗体与多抵价抗原结合租的浓度带现伯象怕抗认体与单价抗璃原形成的复缎合物都是可掀溶性的，但子抗体与多价路抗原形成的铅复合物大多赤数能形成沉揭淀。沉淀反辉应可用于研服究抗体与大险分子抗原结袄合的特性。品用非蛋白大心分子(如多盛糖)抗原与驻相应抗体形晃成的沉淀，表其中只有抗玩体是蛋白质垮，为抗体的寒定量测定提问供了方便。禁在一定量的膀抗体中，逐撞渐增加抗原赚浓度，沉淀广的形成与抗吹原抗体的比煮例密切相关羞。图7抱—偷9是典型的的单特异性沉限淀曲线。沉疫淀反应的曲既线分为3个切区：抗体过泳量区，抗原伍与抗体形成察小分子复合间物，不形成蚕沉淀或沉淀俱很少，称为粗前带(pr辫o－zon狼e)现象；吹抗原过量区损，虽然没有孩游离的抗体印，但沉淀仍百很少，称为含后带(po扶st暂—咬zone)参现象；在抗盲原抗体等带符区(equ降i冈—屋zone)俘形成大量沉析淀，也没有泼游离的抗原权和抗体存在宫。如果抗原庄是多抗原决猛定簇的多价脑抗原如细菌岗、细胞、乳炼胶颗粒等表痕面，则形成桃凝集反应。犹抗广原抗体相遇呀时，不管二裹者比例如何分，很快发生炎特异性结合止，一般在几工秒钟内完成摸，称为初级精反应阶段。全初级反应没曾有可见的沉趣淀。从特异砖性结合到可缎见沉淀形成晒称为次级反毯应阶段。这遍阶段通常需爹要更长的时谢间，从几分脚钟到几小时玻甚至几天，蜂才能看见沉孔淀。次级反掀应除受抗原拌抗体浓度比绘例影响外，改pH值、离拘子强度和补钥体的存在也骡影响沉淀的看形成。蒸抗榴原抗体形成爱沉淀的机理抽，用Mar辆rack等投人提出的网它格理论可得阿到合理的解版释。抗原肚—述抗体的结合摸包括许多抗酒原与许多抗犬体相互连接余形成网格。康当这些聚合铁物达到一定帖大小时，便成从溶液中沉框淀出来。抗烟体分子大多秤为二价(1担gG)，而品大分子抗原退一般是多价较的，一个抗勉体可以与两泰个抗原上相亦同的决定簇架结合，一个鸟抗原分子也讲能与多个抗畜体分子结合堵，从而形成讯相互交联的照网格发生沉枕淀。而抗原臣或抗体过量硬时，不能形胃成网格，故岭不发生沉淀俗。反应系统拴中存在多种陵抗原抗体反猴应称为多特广异性系统，价它与单特异鸽性反应不同丸，在沉淀最隶多时．悬液宽中仍有过量墨的抗原或抗顺体，这是因陕为一个独立陶的反应中，慰过量抗原会悲与另摩—巷个独立的反缸应的过量抗桶体重叠的结览果。此外，赔在一些反应堡系统中，即熊使抗原抗体自比例合适，感也不形成可筑见的沉淀、寇这是因为抗库体的亲和力乒很低，或者妥抗体的双价者结合位点只衰结合一个大乞分子抗原，抵称为单配双真价结合(m司onoga挖mous露bival兄entb弄indin冈g)，或者澡抗体的双价版结合位结合仍了同一个抗味原分子的重狭复的决定簇种。在上述这蒸些情况下无丢法形成网格便结构，这类盲抗体称为不记完全抗体(奶incom供plete腊anti支body)椅。棒4镰．交叉反应施大孤分子抗原常述常含有多个棒抗原决定簇骗，部分抗原焰决定簇与另旺一大分子上奇的抗原决定砌簇相同，当素用此类抗原走免疫后所获挖得的抗体既里可以与同源头抗原结合，幕又能与异源努抗原结合。景抗体与同源系抗原的亲和锡力通常比异抱源抗原要高荡得多，所以室反应较强。模少数交叉反攀应用低亲和胁力的抗体比叫用高亲和力筑抗体更能显街示出来，如矩抗多糖抗体待一般亲和力追较低，易表曾现交叉反应蜓。低亲和力烫抗体往往是惕因为其抗原卷结合位特异填性低，易与芦结构类似的酱抗原反应。忧用免疫沉淀柿尤其是凝胶盟双扩散方法问能非常容易善地鉴定交叉摄反应，并且辈根据沉淀线历形成的类型申判断几种抗铃原间的交叉啊反应关系。落第三节驱常见免疫元分析方法碧免疫分析方葱法是利用抗贤原与抗体特侦异性反应的矿特性对抗原作或抗体进行要量或质的测僻定分析。这鬼类分析方法竹具有特异、治灵敏和快速傻的特点，有焰的可以表现吉出一个氨基框酸分子的差是异，如用单迫克隆抗体进鹅行检测的方萍法；测定的燕量可以达到丛μ普g甚至ng组的水平，如值ELISA沿法，放射免页疫法等；反建应在几小时资，几分钟甚境至更短的时鹊间可以看到卷测定的结果熊，如免疫沉谷淀法等。这确类免疫分析召的方法可以刃用于医学，蜡免疫学中抗盆原抗体的分糕析(包括病讽原的诊断，申免疫细胞表飘面分子的检选测等)，而杨且可以广泛弱的用于生命锻科学的几乎螺各个领域，和甚至于食品颗科学，环境巨科学及分析胡化学等更为燥广泛的学科僻领域。狠一疯、免疫沉淀致1逗．溶液中的王沉淀反应册在轮体外当抗体聪与相应抗原就二者浓度比涝例适当时，闷会发生免疫断沉淀(im岂muno－悲preci咱pitat劝ion)反硬应，表明两务者之间有特企异性反应。连免疫沉淀反事应广泛用于看抗原或抗体厌的定性及定统量分析。在榜液相中形成码的沉淀不易滨观察判断，里利用抗原和危抗体溶液之绩间的界面形非成的沉淀线它便于判断，富即环状沉淀些试验(ri畅ng侍preci磨pitan杂t改test尚)(图7葵—坊l0)。沉屑淀试验可以柳在玻璃管中都进行，将小愿试管或毛管酒的底部加入身抗原溶液，日在上层轻轻辈铺上不同稀任释倍数的抗产体溶液，勿聪使界面破坏国，为了使界邮面更好地形剃成，常在下彼层抗原溶液踢中加入10蹦％的蔗糖或帮甘油。抗原带抗体溶液置臣于创37俗℃司或鹊4宾℃帽孵育后，在订界面上形成哀白色沉淀线填。玻片上沉增淀的形成必这须在显微镜幼下观察。御2凝胶扩散而沉淀鸽抗原抗垫体可在半透抹明的半固相扩介质中进行样沉淀实验。句抗原分子和远抗体分子在铺凝胶介质中韵自由扩散形志成浓度梯度膏，抗原与抗戚体在比例合舒适的一定扩冬散部位相遇她形成沉淀线珠。凝胶沉淀愈可用于测定歌抗原或抗体贪的相对浓度羽，也可用于米比较不同抗宣原的特异性错、纯度及相妄互关系。最拌常用的方法凡为单向免疫寸扩散(ra纯dial呢immun暂odif倘fusio育n)和双粪向免疫扩散裤(doub弯le－im意muno旨diffu乞sion)篮。触单叹向扩散法又舌称Manc沃ini法，版将适当浓度垦的抗体混于咏琼脂(0．昂8％匠—阴1％)中，昨琼脂凝固后壤，打成小孔豪，加入抗原鹊，抗原由小傅孔开始向周贯围扩散，并赖在小孔周围羽合适的位置弦形成沉淀环障。沉淀环的鸟面积与抗原贺浓度呈正相粮关。通过与庙已知抗原浓轻度形成的沉压淀环面积进井行比较，可宜确定被测抗梦原的浓度(铁图7丝—孔11)。单帮扩散常用于豪测定血清中誓IgG、I锋gM、Ig去A及补体的拳含量。单扩拉散法的特点删使用抗体浓旋度大，当抗裕原浓度低于艰5菌—赵10股μ岔g／mL则拌不适用。舌双贩扩散法又称约为Ouch信terlo咬ny法，在蕉琼脂板中抗舱原和抗体分管别从相邻的樱孔中向四周格扩散，在抗需原孔和抗体运孔之间二者霞比例合适的铺部位形成沉粗淀线。琼脂往双扩散常用港于分析抗原岗间的血清学怪关系和抗体豆间差异，相叫邻孔中不同熊抗原与同一投抗血清反应冻形成的沉淀愧线形状的变用化显示抗原姿间是否存在剑共同的抗原听决定簇。当袭两个抗原完炸全笔—佣致时，两条炒沉淀线完全驾融合(图7轧—最12A娃)；如果两胞个抗原无共推同抗原决定乔簇而抗血清异中有针对两慈种抗原的抗吨体时，沉淀释线互不干扰请，呈交叉状智(图7旱—衣12B)；隐当两个抗原眨只是部分抗订原决定簇相析同，还有其眨他不同的抗愿原决定簇，桐则沉淀线在挎后者一方形露成突出的小为刺(图7鞭—饿12C辜)。此外，巩根据抗体或登抗原的不同曾，可形成其添他不同特征暖的沉淀线。量Oucht凶erlon需y法灵敏度死不高，形成附沉淀线需较驱长时间(1惊8蛇—上24h)。前但在抗原分家析方面很有冻实用价值。技3亮．免疫电泳葱免芹疫扩散沉淀描形成需较长眼时间，且灵傅敏度低。免嚼疫电泳（i绑mmuno侨－elec念trpho犹resis兄）是利用蛋巧白质在凝胶输中电泳迁移队率不同能被领分离开来的营特性与免疫扎扩散结合一捞起进行分析雁的方法。这摆种方法能提左高分辨率和枪灵敏度。混敌合的蛋白质盐抗原在PH锡8．6时拆带负电荷，情在电场的作骡用下，由负梦极向正极迁乌移，使混合定的抗原组分徐得以分离，林而抗体可以宗通过自由扩偏散，也可以利通过电泳与含分离的抗原磁形成相应的尼特异性沉淀霉线。从而提支高免疫沉淀袄的灵敏度。猴常见的免疫梨电泳方法有售血清免疫电陪泳，火箭电胖泳和对流免裁疫电泳(又送称电渗析)停。恨传含统的免疫电祖泳即指血清宾免疫电泳，炸将抗原混合哲物(病人血意清)在凝胶宪中用电泳分血离后，沿电朵冰方向挖一哄平行的小槽钢，加入抗血闪清，进行双屿扩散。沉淀赏线的特点显江示病人血清云与正常人血恶清存在的差支异，即血清延蛋白组分的市缺少或增加烂(图7车—殖13)。它火箭电毯泳(roc卵kete湖lectr朋ophor滚esis)塑，为单向免爷疫扩散与电端泳结合的一角种方法。已推混合有抗体贝的凝胶上，早做一小孔，课加入抗原，概电泳后，沿轻着电泳方向何形成火箭型腔沉淀线，沉闲淀线的高度柔与抗原量成贪正比(图7遥—壮14)。火叙箭电泳可用惊于定量测定肤，例如用于押测定人血清袍中的甲胎蛋光白。杠此外，将火酷箭电泳与血籍清免疫电泳衬相结合进行揭双向免疫电餐泳(two唉—爆dimen楚siona途limm念uno嫌—巨elcct轧ropho殿resis轰)先将血清安经电泳分离膊后，切下转袋移至另一已但加有抗血清值的凝胶上，描进行第二次角电泳，形成孙的沉淀线呈啦连续的火箭香样。第二次踪电泳方向与燥第一次电泳骑方向互相垂助直(图7母—票15)。缴对肺流免疫电泳搭(coun舍teri怎mmuno奉—防elcct敬ropho防resis箩)又称电渗仁析。在电场崇作用下抗原毅向正极迁移茧，而抗体在通同样的电场润环境中，因土电渗作用向维负极移动，撤二者在两孔稿之间形成抗侍原抗体沉淀脉线(团7妥—幻16)。对长流免疫电泳城法有微量快培速的特点，棵常用于医学钓检验。沈二、免疫船标记具1．放阴射免疫分析烤放射免叛疫分析法(锦radio识—悄immun蕉oassa使y，RIA桃)的应用始索于60年代切末，广泛用鞭于激素、药蝶物等小分子啦化合物的定喉量分析，是帝灵敏、可靠膜的免疫分析画方法之一。幕常用来标记楼抗原或抗体珍的同位素有撒125I，悦131I，素3H和35症S。放射活灶性的检测液岂相反应体系钩用液体闪烁互仪计数，而昨固相体系可呜用X射线胶甚片显影。鸦育125雀I为观γ吓射线(0.拘035me闪V)，猪131旗I有硬妨β枯射线(0.探608me删V)和及γ什射线(0.祸36meV穗)两种，半适衰期为60恰d，放射害性碘标记常腥用氯胺T法请(定chlor罗amine坚s框—弊T)。氯胺研T是氯代酰柄胺类氧化剂陕，在水中不音稳定，产生爹的氯离子将跪碘离子(I财-动)氧化为单逢质碘(I沉2谜)，单质碘绘与抗原或抗蚁体分子上的诞苯丙氨酸及如酪氨酸残基炉的苯环或组娃氨酸的咪唑油基共价相连惭，使之发生弱碘化反应：已氚(家3手H)因其放玻射性损伤小虑(软咐β脖射线、0.看0185m抄eV)，物创理半衰期长宅(12辨—议26年)而原生物半衰期洗短，属低毒趋型放射性同去位素，用于漏标记免疫分婶子更合适。纱常用粗N列—介琥珀酰亚胺胖[2，3代—脖3刊H]丙酸酯孤标记抗原或督抗体分子，列其活泼酯基拥易和蛋白质段的游离氨基苗反应：乳标记雨反应完成后详，需除去未迅反应的放射企性试剂和其沸他产物，一亦般用电泳，闯沉淀，离子判变换层析，篮高压液相层取析及超速离纠心等方法将味标记物纯化攻，但最方便伪的方法是凝绑胶过滤，透孙析及超滤。遇放鲁射标记的抗透原或抗体可纤直接用于抗递原抗体反应银，形成的抗船原抗体反应毙复合物，用悼第冠—吉抗体或聚乙念二醇沉淀分省离后，测定浩其放射活性权．用于定量晨抗原或抗体票。为了提高径灵敏度，应颗用竞争法进则行抗原或抗妨体定量，其些放射活性与典被测抗原或锋抗体呈反比兆(图7贯—占17)。今2．酶颈联免疫吸附及试验坐同谈位素标记的枣免疫分析方捉法，虽然有摘较高的灵敏应度，但同位悦素具有不稳旋定，需要特宪殊设备。安啦全性差，废境物处理麻烦解等缺点限制碗了其使用。灾非放射性标蔑记方法逐步接得到发展，狗其中酶标记兄免疫试验是照广泛使用的狗方法。因酶评促反应使测姨定的结果被活放大，反应讽的灵敏度接艘近放射免疫棍分析法。用帜于标记的酶宽的种类也越淡来越多，较恳常用的有碱涛性磷酸酶(仓alkal支inep啄hosph炮atase舌)、辣根过删氧化物酶(脑horse竟radis驻hper末oxida蒜se)、麦β慌半乳糖苷酶进β牲—恩galac呼tosid批ase)和也脲酶(ur努ease)初等。雅酶慢免疫试验法跳(enzy伞meim哈munoa坏ssay，描EIA)有义两类方法，捎一类为均相图法，即抗原持与抗体反应自后，不必将匠结合的与游撞离的抗原或誓抗体分离，险就可测定被低测分子的含食量。如酶放盛大免疫分折楚技术(en鸭zyme砍multi巨plied组immu祸noass茄ay，EM佣IT)，将假小分子抗原瞧连接在酶分色子的活性位愈点附近，当炒抗体与这些慈抗原结合后钓，封闭了酶氏催化位点，识使酶失去活岩性。如果被宗测溶液中元敢相应抗体，挎则酶能催化跟底物形成产悄物。同一标臂记物也可以沃竞争方式检概测抗原的含瑞量，另一类狗为固相法，龄即将抗原或只抗体吸附在干固相表面，乞如聚苯乙烯朴微量板，磁缩珠等表面，夸抗原与抗体有反应后，将割固相与液相丽分离除去游还离的抗原或样抗体，而结歼合的抗原或酒抗体上被标柔记的酶仍保弱持活性，催绝化底物形成消有色产物，阿即酶联免疫弓吸附试验(迷enzym傍e耀—娃linke肚dimm高unoso阅rbent籍assa痒y，ELI陈SA)。糕ELI晋SA有直接鱼法、间接法把及夹心法等搏不同反应方似式。直接法蛾(dire独ctEL形ISA)是骄指用酶标记拍的抗原或抗化体直接检测严包被在酶标移板上的抗体挨或抗原，被很检抗原或抗济体的量与产勒物颜色成正架比(图7扑—子18A极)；间接法是(indi袜rect影ELISA介)是将酶标记记在第二抗上体上，当抗去原与第一抗北体结合后，构再用酶标第昼二抗体来检恒查第一抗体驾是合与抗原妥结合。有酶伏底物显色的舰反应为正反渣应，反之为陵负反应(图们7姻—桃18B)。缘夹心法(s勿andwi片chEL颠ISA)先啊用一种未标差记的抗体包躺被酶标板，麻用于捕获抗杠原分子，再主用标记的具贪有相同抗原毯特性但来源丢于不同种类员动物的抗体盖与之反应。尸也可用间接引法中的第二迷抗体进行该秃项反应(间终接夹心法)印(图7丑—氧18C岩)。夹心法之可用于检测湖抗原，尤其还是小分子的室抗原，也可励以用于检测越抗体。馅用酶标记的军第二抗体进凳行间接EL芝ISA，避怠免了用酶标零记每一种抗葬原或抗体的严复杂过程，俩因而得到更好广泛的应用院。常用的羊荷抗鼠IgG动、羊抗免I诊gG及羊抗避人IgG的派酶交联物已钥经商品化，捞可根据需要值选择合适酶恐标第二抗体侨。不同的酶子催化的底物绒不同，显色怜产物的吸收踪波长也不一诸样(表17舌—绸4)。酶标湿比色仪呵进龟行光吸收的鸽测量。副斑袜点酶免疫试报验(dot识—疏ELISA盖)：ELI改SA一般是粪在液相中进雅行酶底物显痒色反应的，甩所以反应产寨物都是有色幼的可溶性化王合物，便于趁用光吸收法鲁测定反应的遥强度。do与t赌—拍ELISA纽的原理与普族通ELIS笔A相同，只床是把反应全暑部移到硝酸闲纤维素膜上尝进行，而不洁是在聚苯乙岗烯酶标板上靠进行。即把应抗原、第一模抗体、第二心抗体都依次筐加到膜上，菊洗脱未反应言物及封闭反贩应物以外的接膜表面都与鸟普通ELI弟SA相同。牧最后的显色竖反应是用另羡外一类底物写，这类底物汪反应的产物霜是不溶于水唉的有色沉淀揉物，如碱性养磷酸酶的底姑物要用BC于IP／NB肚T，而不能僚用pNPP输。根据膜上胶沉淀物颜色鱼有无与深浅嫩判断反应的辱正负和量的壁多少。斑点趣扫描仪也可木以帮助定量谅。dot尾—俯ELISA寒的优点是灵金敏度比普通算ELISA得高10量—宏100倍，别与放射免疫腥的灵敏度水饮平相当。及3．等荧光与发光傍免疫分析祖用御于标记抗体台的荧光化合梦物有异硫青展荧光素(F脉ITC)和觉罗丹明(r喇hodam令ine)荧哗光素等，适凶用于抗原细乓胞和组织的仔定位分析。牲近年来用稀巾土元素(镧许系元素)的者铕离子(E陆u警3+多)、片铽臂离子科(Tb长3+鞋)等代替荧六光素标记抗修体，将时间珍分辨技术引馆入生物检测芦领域，建立隶了时间分辨企荧光免我疫分析法(弱time戚—呈resol禾vedf惜luoro晶mmuno做assay搂，TrFI烛A)，明显缓提高了荧光之免疫分析技辉术的灵敏度胜和特异性。赛T例rFIA的哲测定原理与垫荧光免疫分么析法不同，谨当铕离子螯每合物标记抗粘体后，抗体腔与固相化的啊特异性抗原紧结合，抗体纹上的Eu霞3+锋在紫外光(脚340nm蹲)激发下，懂与增强液中狮的生β脚二酮体重新穷形成气—情种微胶体螯校合物，发出梅长寿命的高好强度荧光(外613nm雄)，比未激土发时增强了郑100万倍至(图7查—抬19)，可劫用时间分辨厉荧光计记录该下来。稀土掌元素的荧光除激发波长范剧围较宽〔3栽00符—个380nm粉)，有利于盛增高激发能而，提高标记订抗体的灵敏摧性；而发射曲波长很窄(亿613nm煎)，造成激衡发波长和发振射波长之间蚊的差别很大稀(270n季m)，有利门于降低背景赏，利用干涉物滤片排除散籍射荧光的干授扰。稀土元显素产生的荧嘴光不但强度悼高，而且半竖衰期长(1陈0～100减μ垂s)，比普煌通荧光素高霉出5鹿—腥6个数量级播。利用延迟叶测量时间可著消除来自样恒品，试剂等宰的干扰。稀文土元素用双宫功能基团螯霉合剂，如异菠硫酸愁—捎苯基斑—寄乙二胺四乙鉴酸可标记至挑抗体的酪氨安酸和组氨酸梯残基上。标扩记方法简单支方便，稳定伟性好，可使教用1俗—寇2年的时间估。近发歼光免疫分析咐(lumi愁nesce毯ntim击munoa躺ssay，律LIR)也污是近年发展爽起来的一项安免疫分析新旦技术。用发恒光物质标记液抗体或抗原匪。其反应原脉理与ELI捡SA、RI浓A、FIA尼等类似。根施据发光物的鼓来源不同，接有化学发光脑(che露’腾milum灶iness牵ence)谨和生物发光难(biol继umine斯scenc楚e)不同方缘法。一些化届学发光剂如坐荧光醇(1专umino赤l)，可用涉于标记抗原欠或抗体，反橡应时发光剂饮发生高能化颈学反应，形盆成处于电子饥激发态的分饰子，当这些电产物分子回熊到基态时，县伴随着光子吗的释放，发外生化学发光货现象。荧光及醇在标记过听程中易丢失兴发光能力，访异荧光醇(浊iso1u住minol热)相对更稳浑定一些。一幕些发光分子卫的发光反应来需要阳离子佛或酶的催化营，还有一些遗化学发光分档子如吖啶酯价(acr骂idine糠este符r)则不需钳催化剂的作樱用，只需在诵酸性条件下呼用过氧化氢崖诱导化学发公光。目前把均化学发光剂痰与发光增强热剂结合使用姓，使光强度当达到X光胶哈片曝光的要当求。北生贸物发光常见窝的反应系统宿为虫荧素(群lucif循erin)点在虫荧酶(饰lucif安ase)的悔催化下，有葛ATP，M呆g肃2+桶及O豆2胀存在．发生枪瞬时发光反喜应：剧发光反搜应可用瞬时筹荧光仪检测亲记录，也可标用胶片显影距。朵4秒．亲和标记卡的免疫分析班金愁黄色葡萄球渠菌的A蛋白椅与IgG涉Fc段有高锋度的亲和力诉。用酶、同块位素、荧光抚素等标记A晒蛋白，替代贩第二抗体直克接与抗体结喊合，可用于躲抗原抗体反置应的分析。潜A蛋白对不拘同种动物来失源的IgG蜂均有亲和性改，可用于多船数抗原抗体灯反应的分析央，但有些动建物的IgG备或少数亚类效不与A蛋白巾结合，选择星时应注意(闹见第三章)赛。躁生萍物素(bi乔otin)时是一种维生培素，存在于库多种生物组偏织中，也可萌以人工合成狐，能特异性挤地与来自卵价蛋白的亲和桌素(avi童din)或会链霉菌的链旗亲合素(s抽trepa罚vidin嘱)结合。生题物素与亲和配素有很高的仔亲和力，比术抗原抗