第七章放射免疫技术

第七章放射免疫技术第一页，共35页。第二节放射免疫分析一、基本原理二、实验方法及测定第三节免疫放射分析一、基本原理二、IRMA与RIA的比较思考题小结第二页，共35页。免疫技术：以抗原-抗体反应原理为基础，对样品中相应抗原或抗体进行检测。标记技术：将可被探测的示踪物质用化学方法与化合物连接。标记免疫分析：用可微量或超微量检测的示踪剂标记抗原、抗体，检测免疫反应结果并确定待检物。标记免疫技术－基本概念第三页，共35页。常见标记免疫技术放射免疫技术酶免疫技术荧光免疫技术

第四页，共35页。

第一节放射免疫技术

第五页，共35页。早期的放射免疫技术是基于竞争性结合反应原理的放射免疫分析(RIA)，稍后又发展了非竞争性结合的免疫放射分析(IRMA)。该类技术具有灵敏度高、特异性强、重复性好、样品及试剂用量少、操作简便且易于标准化等优点，广泛应用于生物医学研究和临床诊断领域中各种微量蛋白质、激素、小分子药物和肿瘤标志物的定量分析，对相关学科的发展起到了极大地推动作用。

第六页，共35页。放射免疫RIA以标记抗原与反应系统中未标记抗原竞争结合特异性抗体来测定待检样品中抗原量。

免疫放射IRMA以过量标记抗体与抗原非竞争结合，采用固相免疫吸附载体分离游离和结合标记抗体。放射受体分析RRA放射配体结合分析RBA其它一、放射免疫技术－原理及分类第七页，共35页。二、放射免疫技术－常用的放射性核素

125I

3H射线γβ理化性活泼差核素丰度>90%－标记方法简单复杂标记设备低廉昂贵测量条件简单复杂常用标记核素第八页，共35页。125碘-标记物的制备－标记125I-化学或酶促反应，将放射性负电碘离子氧化成碘原子或正电碘离子，通过取代反应置换被标记物分子中酪氨酸或酪胺残基以及组胺残基上的氢原子。125I或125I+125I-标记物（混合物）Ch-T、LPO氧化取代反应直接标记法三、放射免疫技术－标记物制备及鉴定第九页，共35页。使用无还原剂的高比放射性碘源被标记物用量要少ch-T用量要低控制总反应体积<200μl反应时间1-2分钟弱碱性反应条件第十页，共35页。间接标记法联接标记(bolton-Hunter)预先将125I用ch-T法标记琥珀酰胺酯，制成的125I化脂功能基团可与蛋白分子上的氨基酸残基反应，从而使待标记物被碘化。bolton-Hunter第十一页，共35页。125碘-标记物的制备－纯化凝胶过滤法离子交换层析法

聚丙烯酰胺凝胶电泳

高效液相色谱法聚合、损伤物标记蛋白游离125I第十二页，共35页。125碘-标记物的制备－鉴定

标记物质量高比放射性高纯度完整免疫活性

放射化学纯度单位标记物中结合于被标记物上的放射性占总放射性的百分率应大于95%

免疫活性标记物与抗体结合的能力标记物与过量抗体反应百分比该值越大,标记物免疫活性好第十三页，共35页。

比放射单位化学量标记物中所含的放射性强度单位：Ci/gmCi/mgCi/mmol比放射性过高，将影响标记物免疫活性计算法：依据标记反应中放射性核素的利用率（标记率）来计算标记物的比放射性.自身置换法：比较标记抗原与标准抗原的免疫活性来测定标记物的比放射性

结果准，测定复杂第十四页，共35页。比放射性－计算法

结果欠准，计算简便第十五页，共35页。

自身置换曲线

反应系统：限量Ab和递增剂量(cpm)的标记抗原标记抗原的结合率(B/T%)随标记抗原总量的增加而减少两条曲线平行,若标记抗原与标准品抗原具有相同的免疫活性标准曲线

反应系统:抗体（限量）、标记抗原（定量）和剂量递增的标准抗原组成标记抗原与抗体的结合率(B/T%)随标准抗原的增加而竞争抑制性减少第十六页，共35页。比放射性－自身置换法

标准曲线与自身置换曲线平行表明在相同的放射性结合水平上，二实验中抗体上结合的抗原物质总量相同计算置换曲线平行段某结合率的放射性强度(cpm/ml换算为nCi/ml)计算标准曲线平行段相应结合率对应的标准抗原化学量(ng/ml)以平行段多点结合率对应的放射强度和标准抗原量进行直线回归，其斜率即为比放射性(nCi/ng)第十七页，共35页。四、放射免疫技术－抗血清鉴定抗体分子上一个抗原结合部位与相应的抗原决定簇之间的结合强度用亲和常数Ka表示。单位为稀度单位（LM-1）Ka值高（109～12L/mol）有助于提高灵敏度、精确度和准确度亲和性亲合力高亲合力低第十八页，共35页。放射免疫技术－抗血清鉴定特异性:指一种抗体识别相应抗原决定簇的能力交叉反应率：将反应的最大结合率抑制下降50%时特异性抗原与类似物的剂量（ED50）之比抗体交叉反应程度直接影响测定结果的准确性特异性效价第十九页，共35页。五、方法学评价除了常规的灵敏度、精密度、准确性、特异性和稳定性之外，应注意以下指标：可靠性剂量-反应曲线高剂量钩状效应第二十页，共35页。第二节放射免疫分析第二十一页，共35页。一、放射免疫分析－基本原理竞争性结合反应的经典标记抗原（Ag*）和非标记抗原（Ag）与限量抗体(Ab)竞争性结合Ag*和Ag具有等同的与Ab结合能力第二十二页，共35页。Ab限量，Ag*定量,Ag*和Ag的量大于Ab结合位点，二者通过竞争方式与Ab结合；随着Ag增加，Ag*与Ab结合形成Ag*Ab复合物的放射量降低,二者变化成函数关系。

第二十三页，共35页。以未结合的Ag*为F，Ag*Ab复合物为B，则B/F或B/(B＋F)与Ag的量变存在着函数关系－剂量反应曲线注：T即是B与F的总和第二十四页，共35页。二、放射免疫分析－实验方法及测定抗原抗体反应Ag*Ag反应条件体积温度时间pHAb(标准Ag/样品Ag)平衡非平衡一步法二步法第二十五页，共35页。分离结合、游离标记物二抗体沉淀法

PEG沉淀法PR试剂法活性炭吸附法分离彻底，迅速分离试剂和过程不影响反应平衡效果不受反应介质影响操作应简单、重复性好经济第二十六页，共35页。测量、数据处理晶体闪烁计数器包括了NaI闪烁晶体、光电倍增管以及计数器测量的放射性信号是仪器输出的电脉冲数：每分钟计数(cpm)

计算参数cpmB/T(%)F/T(%)B/F(%)B/B0(%)拟合注：T即是B与F的总和第二十七页，共35页。第三节免疫放射分析第二十八页，共35页。一、免疫放射分析－基本原理以过量125I标记抗体与待测抗原进行非竞争性免疫结合反应,用固相免疫吸附剂对B或F进行分离，其灵敏度和可测范围均优于RIA操作也较RIA简单。第二十九页，共35页。单位点IRMA先用过量标记抗体与待测抗原进行反应，形成抗原抗体复合物；用固相抗原结合未结合标记抗体并将其分离,测定上清液的放射量第三十页，共35页。双位点IRMA先用固相抗体与抗原结合，再用过量的标记抗体与抗原的另一决定簇结合，形成固相抗体-抗原-标记抗体复合物，洗弃剩余标记抗体，测固相上放射性。第三十一页，共35页。二、IRMA与RIA比较第三十二页，共35页。放射免疫分析技术的灵敏度高、特异性强、精密度好,常用于各种激素、微量蛋白质、肿瘤标志物和药物等微量物质的测定。但由于放射污染和危害，常用核素半衰期短，试剂盒稳定期不长等诸多不足,RIA将逐渐被取代。放射免疫分析技术的应用第三十三页，共35页。1.放射免疫技术的核心是什么？125I标记物的基本原理是什么？有哪些方法？125I标记物质量的指标有哪些？4.用于放射免疫技术的抗体应满足哪些质量标准？5.放免分析中标记/