干扰素生产工艺副本

（优选）干扰素生产工艺副本目前一页\总数三十四页\编于二十点干扰素的理化性质143-166aa；MW:18-40ku；；乙醚、氯仿敏感容易吸附玻璃、淀粉、醋酸纤维膜、琼脂和塑料等介质。目前二页\总数三十四页\编于二十点工艺流程基因工程假单胞杆菌的构建摇瓶培养发酵罐培养菌体收集菌体裂解预处理-沉淀初级分离溶解粗干扰素沉淀

与疏水层析阴离子交换层析与浓缩阳离子交换层析与浓缩凝胶过滤层析无菌过滤分装检测

30℃，pH7.018±2h30℃，pH7.016000r/min离心2℃～10℃16000r/min目前三页\总数三十四页\编于二十点干扰素生产工艺路线（1）体外诱生干扰素制备工艺：

Sendai病毒诱导人白细胞1989年：IFNα-n3/Alferon，批准上市产量低：1gIFNα，需要3亿ml人血白细胞来源困难，工艺复杂，收率低，价格昂贵潜在的血源性病毒污染的可能性目前四页\总数三十四页\编于二十点干扰素生产工艺路线（2）人源转化细胞系培养生产工艺：

1999年：IFNα-n1/Wellferon,批准用于临床。优点：首次实现大规模商业化生产。缺点：活性低，退出临床应用。目前五页\总数三十四页\编于二十点干扰素生产工艺路线（3）上市产品：重组人干扰素rhuIFN1986，rhuIFNα-2a，rhuIFNα-2b；

2001－2002：PEG化IFN，PEG-Intron,Pegasys表达产物：无糖基化，N-met，无活性包涵体工艺特点：发酵过程，随后变性、复性过程。基因工程大肠杆菌发酵生产工艺:目前六页\总数三十四页\编于二十点干扰素生产工艺路线（4）上市产品：rhuIFNβ-1a1996，Avonex(Biogen)；

2002，Rebif(Serono)表达产物：166aa糖基化蛋白，22.5ku工艺特点：分泌表达，产量低，成本高,过程严格动物无限细胞系培养生产工艺：目前七页\总数三十四页\编于二十点干扰素生产工艺路线（5）宿主：腐生型假单胞杆菌（Pseudomonasputida）上市产品：IFNα-2b/安福隆表达产物：无糖基化可溶性蛋白质，具有天然分子结构和生物活性工艺特点：①发酵周期短（几个小时）②无需变性、复性过程，获得有活性产品纯化过程：淘汰抗体亲和层析基因工程假单胞杆菌发酵生产工艺目前八页\总数三十四页\编于二十点一、基因工程假单胞杆菌的构建

基因工程假单胞杆菌菌种建立基因工程假单胞杆菌菌种特性目前九页\总数三十四页\编于二十点（一)-基因工程假单胞杆菌菌种建立第一步：干扰素α-2b基因的克隆第二步：表达载体的构建第三步：工程菌的构建目前十页\总数三十四页\编于二十点第一步：干扰素基因的克隆(RT-PCR)

制备白细胞，病毒诱导，分离mRNA,反录酶合成cDNA,PCR，基因连接质粒,转化E.coli,筛选鉴定克隆。测序：编码人IFNα-2b基因序列,501bp，165aa。目前十一页\总数三十四页\编于二十点第二步：表达载体构建IFN基因与表达载体连接转化大肠杆菌筛选阳性克隆获得序列正确表达载体目前十二页\总数三十四页\编于二十点第三步：工程菌构建转化假单胞杆筛选高表达、稳定遗传的工程菌获得原始菌种目前十三页\总数三十四页\编于二十点（二）基因工程菌的特性（1）具有宿主菌的特征：细菌：革兰氏阴性菌，有荚膜，无芽孢，杆状。菌落：直径2.5-3.0mm，灰绿色半透明状,粘稠。生化特性:Ser-，L-Val、D/L-Arg和L-Thr为（2）工程菌的特征：SmR、TcR、ApR（3）具有生产干扰素能力：放射性免疫学效价不低于2.0×109IU/L。目前十四页\总数三十四页\编于二十点二、干扰素α-2b的发酵工艺过程目前十五页\总数三十四页\编于二十点1、摇瓶培养取保存工作种子批菌种，室温融化摇瓶培养：30℃，pH7.0，250r/min，18±2h检测：OD值和发酵液杂菌检查。目前十六页\总数三十四页\编于二十点2、种子罐培养接种：接入50L种子罐，接种量10%。培养：30℃，pH7.0。控制：级联调节通气量和搅拌转速，DO为30%，3～4h，OD>4.0。检测：显微镜和LB培养基划线检查，控制杂菌。目前十七页\总数三十四页\编于二十点3、发酵罐培养接种：通入300L培养基的发酵罐，接种量10%。控制：级联调节通气量和搅拌转速。前4h：30℃，pH7.0，DO为30%。4h后：20℃，pH6.0，DO为60%，5～6.5h。终点控制：OD值达9.0±1.0，5℃冷却水快速降温至15℃以下。检测：发酵液杂菌检查目前十八页\总数三十四页\编于二十点4、菌体收集连续流离心机：冷却的发酵液，16000r/min离心收集。菌体保存：－20℃冰柜，不超过12个月。检测：干扰素含量、菌体蛋白含量、菌体干燥失重、质粒结构一致性、质粒稳定性。目前十九页\总数三十四页\编于二十点

三、干扰素的分离纯化工艺过程干扰素分离工艺过程干扰素的纯化工艺过程目前二十页\总数三十四页\编于二十点（一）干扰素α-2b分离工艺过程菌体裂解预处理初级分离目前二十一页\总数三十四页\编于二十点(1)菌体裂解

裂解缓冲液：纯化水配制，2℃～10℃（pH7.5）使用保护剂：EDTA，PMSF（苯甲基磺酰氟）破碎－20℃菌体：2厘米以下的碎块搅拌：加裂解缓冲液，2℃～10℃，2hr冻融:细胞完全破裂，释放干扰素。目前二十二页\总数三十四页\编于二十点(2)预处理-沉淀加絮凝剂聚乙烯亚胺:2℃～10℃，搅拌45min，对菌体碎片进行絮凝。加凝聚剂醋酸钙溶液:2℃～10℃,搅拌15min，对菌体碎片、DNA等进行沉淀。目前二十三页\总数三十四页\编于二十点(3)离心

连续流离心机：2℃～10℃，16000r/min收集上清液：含有重组干扰素蛋白质杂质沉淀：121℃、30min蒸汽灭菌,焚烧处理。目前二十四页\总数三十四页\编于二十点（4）初级分离

盐析:4M硫酸铵，2℃～10℃，搅匀,静置过夜。离心：连续流离心机，16000r/min保存：收集沉淀，粗干扰素，4℃保存。目前二十五页\总数三十四页\编于二十点（四）、干扰素纯化工艺过程溶解粗干扰素沉淀与疏水层析阴离子交换层析与浓缩阳离子交换层析与浓缩凝胶过滤层析无菌过滤分装目前二十六页\总数三十四页\编于二十点

(1)溶解粗干扰素

配制纯化缓冲液：超纯水，pH7.5磷酸缓冲液，0.45μm滤器和10ku超滤系统，百级层流下收集。冷却至2℃～10℃。检查:缓冲液的pH值和电导值。溶解：2℃～10℃，匀浆，完全溶解。目前二十七页\总数三十四页\编于二十点(2)沉淀与疏水层析

等电点沉淀（1）：磷酸调节至pH5.0，沉淀杂蛋白，离心收集上清液。疏水层析：干扰素吸附在疏水层析柱中

除非疏水性蛋白洗脱与收集：0.01M磷酸缓冲液（pH8.0）。目前二十八页\总数三十四页\编于二十点等电点沉淀（2）：磷酸调节pH4.5，调节电导值40ms/cm，2℃～10℃，静置过夜超滤：1000ku超滤膜过滤，除去大蛋白。透析除盐：调整溶液pH8.0，电导值，10ku超滤膜，0.005M缓冲液。目前二十九页\总数三十四页\编于二十点(3)阴离子交换层析与浓缩0.01M磷酸缓冲液（pH8.0）平衡树脂。盐浓度线性梯度5～50ms/cm进行洗脱，配合SDS收集干扰素峰。浓缩：调整溶液和电导，10ku超滤膜，0.05M醋酸缓冲液（pH5.0）中透析。目前三十页\总数三十四页\编于二十点（4)阳离子交换层析与浓缩用0.1M醋酸缓冲液（pH5.0）平衡树脂。上样，相同缓冲液冲洗。盐浓度线性梯度5～50ms/cm进行洗脱配合SDS收集干扰素峰。浓缩：10ku超滤膜进行。目前三十一页\总数三十四页\编于二十点(5)凝胶过滤层析洗涤液：0.15MNaCl的0.01M磷酸缓冲液（pH7.0）清洗系统和树脂上样，相同缓冲液进