第四章 抗生素的提取和纯化

第四章抗生素的提取和纯化第1页，共45页，2023年，2月20日，星期三4.1概述生物合成药物的分离纯化，目的在于从发酵液或培养液中分离纯化具有一定纯度、符合药典或其他法定标准规定的各种药物，又称发酵液的后处理或下游加工过程。这是个非常繁复的过程.生物合成药物的一般分离纯化方法第2页，共45页，2023年，2月20日，星期三4.2发酵液的预处理发酵(培养)液的预处理根据所要获得的目标物质性质的不同，预处理方法也不同，比如对酸、碱和热的稳定性，是蛋白质还是非蛋白质等。以下为以抗生素为目标产物的发酵液的处理。杂质：①可溶性胶体物体，其中主要是杂蛋白、多糖和核酸②含有高价金属离子的无机盐这些杂质不仅使发酵液粘度增大，降低液固分离速度，还会影响到后续的提取与纯化工作和产品质量。因此应通过预处理的方法，尽可能的去除这些杂质。第3页，共45页，2023年，2月20日，星期三4.2发酵液的预处理和固液分离微生物细胞的破碎由微生物产生的产物，大都处于细胞内部，要分离和提取这些产物，则首先需要收集菌体，进行细胞破碎。破碎细胞的方法：①机械法有高压匀浆法、高速珠磨法及超声波法。②非机械法有化学渗透法、酶解法、冻结一融化法、干燥法等。第4页，共45页，2023年，2月20日，星期三4.2发酵液的预处理①调整pH值改变发酵液的胶体状态，使产物转入液相。②高价金属离子的去除：如加入草酸调pH的同时可以去除Ca2+

，加入三聚磷酸钠可以去除Mg2+,黄血盐可以去除Fe3+。③杂蛋白质的去除方法主要有：等电点沉淀法（蛋白质在等电点时溶解度最低）、变性沉淀法（常用加热法）、加各种沉淀剂沉淀（三氯乙酸、水杨酸、鞣酸或者Cu2+、Zn2+、Fe3+

）、加絮凝剂(壳聚糖、海藻酸钠、聚丙烯酰铵等)。

第5页，共45页，2023年，2月20日，星期三4.2发酵液的预处理④多糖的去除方法：可用酶将其转化为单糖，降低粘度，提高过滤速度⑤发酵液中有色物质的去除，常用吸附法（离子交换树脂、离子交换纤维、活性炭）。第6页，共45页，2023年，2月20日，星期三4.3发酵(培养)液的固液分离常见方法有过滤和离心。常见的过滤设备有真空鼓式过滤机和板框压滤机，常见的离心设备有管式离心机、碟片式离心机、倾析式离心机、第7页，共45页，2023年，2月20日，星期三4.4抗生素的提取提取的目的是从发酵液中制取高纯度的符合药典规定的抗生素成品。由于多数抗生素不很稳定，且发酵易被污染，故整个过程要求：时间短、强度低、pH宜选择合适的范围、勤清洗消毒。常用的提取方法：溶媒萃取法、离子交换法、吸附法、沉淀法第8页，共45页，2023年，2月20日，星期三4.4.1溶媒萃取法一、溶媒萃取法是用一种溶剂将物质从另一种溶液中提取出来的方法，这两种溶剂不能互溶或只部分互溶，能形成便于分离的两相。有机相水相第9页，共45页，2023年，2月20日，星期三分配系数K0当体系达到平衡时，溶质在两相中的浓度比:K0=C1/C2分配定律须符合下列条件:1.必须是稀溶液;2.溶质对溶剂的互溶没有影响;3.溶质在两相中必须为同一种分子类型，即不发生缔合或离解。第10页，共45页，2023年，2月20日，星期三二、萃取方式单级萃取只有一个混合器和一个分离器的萃取。混合器分离器sLFR第11页，共45页，2023年，2月20日，星期三二、萃取方式多级错流萃取是由数个萃取器串联组成，料液经萃取后的萃余液依次流人下一萃取器用新鲜萃取剂继续萃取第12页，共45页，2023年，2月20日，星期三二、萃取方式多级逆流萃取由多个萃取器串联组成，其特点是料液与萃取剂分别由两端加入，溶剂与料液互成逆流接触，故称多级逆流萃取。此法收率最高，溶剂用量最小，工业普遍采用。第13页，共45页，2023年，2月20日，星期三三、乳化现象和去乳化

乳化现象有机相乳化层水相2）乳状液及其类型乳状液——一种液体以细小液滴分散在另一种互不相溶的液体中所构成的分散体系，也称乳浊液。类型——油包水（W/O）型和水包油（O/W）型两大类第14页，共45页，2023年，2月20日，星期三三、乳化与去乳化乳状液的消除方法：⑴加热升高温度⑵加入电解质，利用电解质来中和乳状液分散相所带的电荷而促使其聚沉。(3)吸附过滤，由于乳状液中的溶剂相与水相对吸附介质的润湿性不同，其中水分被吸附也可引起去乳化作用。(4)加入去乳化剂，最主要的破乳化方法。第15页，共45页，2023年，2月20日，星期三四、影响溶媒萃取的

主要因素(1)pH值正确选择pH值要考虑会影响弱酸或弱碱性产物的分配系数，及对产物的稳定性的影响。(2)温度随温度的升高，使萃取效果降低；产物一般在高温下不稳定，因此萃取一般应在低温下进行。(3)盐析作用氯化钠、硫酸铁等盐析剂的影响有三个方面:①导致游离水分减少，降低了产物在水中的溶解度;②盐析剂能降低有机溶剂在水中的溶解度;③盐析剂能使萃余相密度增大，有助于相分离。但盐析剂用量要适当，过多会使杂质转入有机溶剂相中。(4)溶剂的选择应有以下特性:①K０要大，对杂质的分离因素要大于1;②溶剂与料液的互溶度要小;③化学稳定性高，挥发性小，安全低毒;④回收处理方便，价廉易得。第16页，共45页，2023年，2月20日，星期三4.4.2离子交换法离子交换法是利用某些生物药物能在溶液中形成带电粒子，与合成离子交换树脂之间结合力的差异来进行分离的方法。带电粒子与离子支换树脂间的作用力是静电力，它们的结合是可逆的。一、离子交换法的基本概念

二、离子交换的机理与速度三、树脂和操作条件的选择四、大网格离子交换树脂第17页，共45页，2023年，2月20日，星期三离子交换过程离子交换：R—A++B+=R—B++A+洗脱：R—B++C+=R—C++B+再生：R­—C++A+=R—A++C+第18页，共45页，2023年，2月20日，星期三一、离子交换法的基本概念离子交换树脂是一种具有网状立体结构的高分子多元酸或多元碱的聚合物。离子交换树脂的分类（1）强酸性阳离子交换树脂以磺酸基作为活性基团，在pH1－14范围内均能进行离子交换反应。典型反应：（2）弱酸性阳离子交换树脂这类树脂的活性基团主要有羧酸基和酚羟基等，交换能力随溶液的pH升高而递增。对于羧酸型树脂只有在pH＞7的溶液中才能正常进行，而对于酚羟基型树脂，溶液的pH值应大于9。典型交换反应为：第19页，共45页，2023年，2月20日，星期三一、离子交换法的基本概念（3）强碱性阴离子交换树脂活性基团有两种：一种含三甲氨基称为强碱I型，另一种含二甲基–β–羟基–乙基氨基称为强碱II型。使用的pH值没有限制，其典型的交换反应如下：

（4）弱碱性阴离子交换树脂活性基团有伯胺、仲胺、和叔胺以及吡啶等。其交换能力随pH值的变化而变化，pH值愈低交换能力愈大。其典型的交换反应如下：

第20页，共45页，2023年，2月20日，星期三

二、离子交换树脂的理化性质外观珠球形颗粒度（粒度）颗粒度是指树脂颗粒在溶胀状态下的直径大小,粒度小其交换速度快，但流体阻力增加，粒度过大会使交换速度降低。膨胀性确定树脂装填量时应考虑到其膨胀性能。密度干树脂的密度称真密度，而膨胀树脂酌密皮称视密度，由视密度可以估计树脂的装填量和离子交换柱所承受的压力。交联度

指离子交换树脂中交联剂（二乙烯苯简称DVB）含量的质量分数。一般来说交联度大，机械强度高，树脂的孔度小，大分子的物质就不易被交换。交换容量

表征树脂交换能力的重要参数。所谓交换容量是指一定量树脂所能交换离子的毫克当量数（meq），其表示方法有质量交换容量（meq/g干树脂）和体积交换容量（meq/ml湿树脂）两种。第21页，共45页，2023年，2月20日，星期三三、离子交换的机理与速度交换机理

:A离子自溶液扩散到树脂表面(膜扩散)A离子自树脂表面再扩散到树脂内部的活性中心(粒子扩散)A离子与树脂活性中心RB上的B离子进行交换反应B离子自活性中心扩散到树脂表面B离子再从树脂表面扩散到溶液中。影响交换速度的因素：（1）树脂的粒度与交联度减少树脂的粒度，有利于交换速度的提高。（2）离子的大小与化合价离子的水合半径增大，交换速度下降。（3）溶液的浓度交换体系如果是稀溶液（0.001mol／L离子价数），交换速度随离于浓度的上升而增大，但达到一定浓度（0.01mol／L离子价数）后，交换速度不再随浓度上升而增大。（4）搅拌速度与温度搅拌能影响膜扩散速度，加快搅速会使交换速度增加。温度升高，交换速度增大，温度从25℃上升至50℃，交换速度约提高1倍。第22页，共45页，2023年，2月20日，星期三四、树脂和操作条件的选择树脂的选择对强碱性产物宜选用弱酸性树脂。对弱碱性产物宜选用强酸性树脂；同理，弱酸产物宜用强碱性树脂，强酸性产物宜用弱碱性树脂。对树脂的选择还应要求对产物与主要杂质的吸附力有足够的差异。离子交换操作条件的选择（1）交换（吸附）：选取交换过程的pH值。合适的pH值应在产物稳定的范围内，并能使产物离子化和树脂活性功能基解离。（2）洗脱（解吸）选择合适的洗涤剂如水、稀酸、盐或其他络合剂来洗净交换废液及夹带的杂质。（3）树脂的再生第23页，共45页，2023年，2月20日，星期三4.4.3吸附法

吸附法是利用一些吸附剂，在适宜的pH条件下，使发酵液中所需的产物被吸附剂吸附，然后再用适当的洗脱剂将产物解吸，以达到浓缩和提纯的日的。吸附法的基本概念影响吸附过程的因素几种常用的吸附剂大网格聚合物吸附剂及其应用第24页，共45页，2023年，2月20日，星期三一、吸附法的基本概念

吸附作用：固体内部的分子（或原子）受到邻近分子的作用力是对称的，故分子处干平衡状态。界面上的分子，受力是不对称的，处于不平衡状态。，因此能从外界（液相）吸附分子、原子或离子，从而达到分离的过程称为吸附作用。吸附的类型:（l）物理吸附

这是吸附剂和吸附物通过分子间引力所产生的吸附作用。（2）化学吸附由吸附剂和吸附物之间生成化学键，发生了化学反应所产生的吸附作用。

（3）离子交换吸附

第25页，共45页，2023年，2月20日，星期三二、影响吸附过程的因素

吸附剂的性质：（l）表面积：空隙度越高，比表面积越大，吸附容量就越大。（2）颗粒和孔径分布：颗粒度越小，吸附速度就越快。（3）对极性化合物应选用极性吸附剂，对非极性化合物应选用非极性吸附剂。吸附物的性质：（l）溶解度：吸附物在介质中的溶解度愈小，则愈易被吸附。溶剂和温度的影响：温度会影响吸附物的溶解度，其溶解度随温度升高而增大的则不利于吸附，反之则有利于吸附。pH值和其他组分的影响：控制某些化合物pH的解离度，使溶液中的化合物呈分子状态

第26页，共45页，2023年，2月20日，星期三三、几种常用的吸附剂

有机吸附剂如活性炭、纤维素，聚酰胺，大孔树脂等。无机吸附剂如白土、氧化铝、硅藻土等。第27页，共45页，2023年，2月20日，星期三4.4.4沉淀法

利用某些沉淀剂使所需产物在溶液中生成难溶性的无定形固体而沉降析出，此法有时也可用于杂质的去除。一、盐析沉淀法二、有机溶剂沉淀法三、等电点沉淀法四、其他沉淀方法第28页，共45页，2023年，2月20日，星期三一、

盐析沉淀法

盐析法的基本原理盐析法主要适用于酶、蛋白质等生物大分子物质。在高浓度中性盐存在下，它们在水溶液中的溶解度降低而产生沉淀，称为盐析法。机理：高浓度的中性盐中存在着大量带电荷的盐离子，可中和酶和蛋白质等生物大分子表面的电荷，使双电层受损，破坏了分子外围的水化层。大量盐离子自身的水合作用降低了自由水的浓度，削弱了水化层。盐析剂的种类与用量几种盐析效果排序为：MgSO4,(NH4)２SO4,NaH2PO4。一般含有多价阴离子的中性盐的盐析效果较好。工业生产上用得最多的盐析剂是(NH4)２SO4。第29页，共45页，2023年，2月20日，星期三二、有机溶剂沉淀法概念：在水溶液中加入一定量亲水性有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出的方法。常用于蛋白质、酶、核酸、多糖等物质的分离。机理：与蛋白质或酶在有机溶剂作用下，其空问结构发生某种程度的变形，使疏水基团尽露于表面，并与有机溶剂的疏水基团结合形成疏水层而沉淀。影响沉淀的因素（1）溶剂的种类和用量常用甲醇、乙醇、异丙醇和丙酮等，乙醇是最常用。（2）沉淀的温度和pH值①有机溶剂与水混合产生的溶解热，易使蛋白质变性，沉淀过程应注意冷却降温，且低温也有利于沉淀。②沉淀pH值应首先满足蛋白质稳定性的条件。（3）溶液中的盐类和金属离子少量中性盐的存在，由于盐溶作用会增大蛋白质的溶解度，所以用有机溶剂沉淀时应减少无机盐第30页，共45页，2023年，2月20日，星期三

三、等电点法主要用于两性电解质产物，它们在等电点时的净电荷为零，分子间排斥电位降低，因而吸引力增大，相互聚集起来产生沉淀。四、其他沉淀方法：形成难溶性盐或复合物的沉淀法加高分子聚合物沉淀第31页，共45页，2023年，2月20日，星期三4.5抗生素的精制色谱分离法脱色和去热原质结晶和重结晶膜分离法成品干燥第32页，共45页，2023年，2月20日，星期三4.5.1色谱分离法

（Chromatography）

一、概述定义——也称色谱层析、色谱、色层；是利用混合物中各组分理化性质的差异，使其在相对运动着的两相间经反复多次分配，以不同速度移动，从而获得分离的方法。。特点——分离精度高、适用范围广、设备简单、操作方便；处理量小、间歇操作等发展史——1903年一位俄国植物学家首次提出。1931年首次应用于制备；1938年适用范围扩展至无色物质；……

第33页，共45页，2023年，2月20日，星期三石油醚CaCO3颗粒植物叶石油醚提取物石油醚CaCO3颗粒1903年俄国植物学家Tswett实验示意图叶绿素叶黄素胡萝卜素石油醚第34页，共45页，2023年，2月20日，星期三二、色谱法分类分离机理吸附层析——物质吸附力差异分配层析——物质分配系数差异凝胶层析——物质分子量差异第35页，共45页，2023年，2月20日，星期三吸附层析的种类物理吸附层析离子交换层析亲和层析疏水作用层析金属螯合层析有机染料层析第36页，共45页，2023年，2月20日，星期三2.按两相所处的状态分；①液相色谱以液体作为流动相，可分为液－固色谱及液－液色谱；②气相色谱以气体作为流动相，可分为气－固色谱及气－液色谱。3.按操作形式分①柱色谱将固定相装在柱内，使混合物溶液沿一个方向移动而得以分离；②纸色谱用滤纸作为固定相载体，混合物溶液点样后，用流动相展开，以达到分离鉴定的目的；③薄层色谱在玻璃板（或其他材料）上涂布固体粉末薄层为固定相，点样后用流动相展开，以达到分离鉴定的目的。色谱法分类第37页，共45页，2023年，2月20日，星期三三、柱层析系统

工艺流程图第38页，共45页，2023年，2月20日，星期三4.5.2结晶与重结晶21．9．1结晶的基本原理

结晶是指溶质自动从过饱和溶液中析出形成新相的过程。同时由于表面分子化学键力的变化使分子有规律地排列在一定的晶格中，形成固体。21．9．2结晶过程的步骤(1)过饱和溶液的形成(2)晶核的形成(3)晶体的成长影响晶体大小的因素主要有溶液的过饱和度、温度、搅拌速度等。21．9．3重结晶重结晶就是将晶体用合适的溶剂溶解后再次进行结晶，以提高纯度。重结晶的关键是选择合适的溶剂。第39页，共45页，2023年，2月20日，星期三二、结晶的过程过饱和溶液的形成→晶核形成→晶体生长

第40页，共45页，2023年，2月20日，星期三4.5.3膜过滤

膜分离是利用天然或人工合成的半透性高分子薄膜，以外界能量或化学位差为推动力，对多组分混合物进行分离、提纯和富集的方法。膜过滤就是其中的一种，它是利用流体压力差作为椎动力的筛分分离方法。膜过滤的类型及其特点：见下页表第41页，共4