分子诊断技术在结核病诊治中的应用

分子诊断技术在结核病诊治中的应用第一页，共63页。全球结核病流行状况WHOreport，2013第二页，共63页。全球结核病流行状况全球结核感染人数2004年后处于下降趋势HIV患者并发结核病数量处于平稳阶段中国结核感染人数全球排名第二WHOreport，2013第三页，共63页。全球结核病流行状况WHOreport，2013第四页，共63页。全球结核病流行状况全球结核死亡人数处于下降趋势斯威士兰结核病感染率最高WHOreport，2013第五页，共63页。全球结核病流行状况Globally,anestimated3.6%ofnewcasesand20.2%ofpreviouslytreatedcaseshaveMDR-TBTherewereanestimated450,000newcasesofMDR-TBworldwidein2012Onaverage,anestimated9.6%ofMDR-TBcaseshaveXDR-TBWHOreport，2013第六页，共63页。全球结核病流行状况

2012年全球新发结核病例为860万人，中国占总数的12%在860万新病例中约110万人（13%）为HIV阳性，这些病例的75%在非洲每年约有130万人死于结核病，我国为25万结核病每24秒钟就杀死1人预计未来20年还将有3600万人死于结核病。全球每年有45万新发MDR-TB，大约万为XDR-TB流行现状感染人数多死亡人数多耐药患者多潜伏感染多“4多”WHOreport，2013第七页，共63页。结核病诊治中存在的问题

预防问题诊断问题治疗问题医疗问题检验人员最关心的问题第八页，共63页。根据不同分子水平及技术特点来选择诊断检测体系第九页，共63页。细菌载体疫苗DNA疫苗灵敏度特异性标本类型目的用途费用实验平台检测时间方法选择方法选择的影响因素第十页，共63页。Sputum

涂片MTB培养—孵育4-8周（阳性）药敏试验—观察

孵育4周观察生长情况

涂片（阳性）分子诊断技术液体培养及药敏试验

平均时间2-3个月平均时间20天

只需2小时-2天涂阳=60-98%有结核分枝杆菌，因此涂阳后最好用分子生物学方法进行快速鉴定第十一页，共63页。IGRAs、TST等RNA水平DNA水平蛋白质水平恒温扩增变温扩增

鉴定

鉴定+耐药结核病分子诊断扩增杂交LAMP、SDA芯片、RT-PCRSAT、TMAFISH、Probe第十二页，共63页。分子诊断适宜技术的选择第十三页，共63页。与QFT-GI为IGRAs实验潜伏性结核（LTBI）结核菌素试验（TST）QuantiFERON-TBGoldin-tube(QFT-GI)蛋白质水平第十四页，共63页。全血IFN-γ释放分析技术(IGRA)结核感染者体内存在特异的效应T淋巴细胞，效应T淋巴细胞再次受到结核抗原刺激时会分泌多种细胞因子（IFN-γ）。因此，检测效应T淋巴细胞可用于结核病或结核潜伏感染者的诊断。由于效应T细胞存活时间很短，而且具有特异性，因此可以作为机体是否正处于被感染的指标，无论是否有临床症状。基于IGRA原理的产品目前已被美国、加拿大、英国、德国、意大利、瑞士、法国、荷兰、日本等二十余个国家写入本国的结核诊疗指南中第十五页，共63页。γ-干扰素释放实验酶联免疫斑点技术培养滤液蛋白10（CFP10）早期抗原靶6（ESAT-6）一、T-SPOT技术基础T-SPOT第十六页，共63页。由结核杆菌基因组RD1区相同的操纵子编码的蛋白所有的卡介苗（BCG）均丢失该基因序列绝大多数的环境分枝杆菌也不存在RD1区结核杆菌特异抗原ESAT-6与CFP10抗原第十七页，共63页。PlamaPBMCsGelBarrierErythrocytes检测过程分离PBMCs加入PBMCs与结核特异抗原37℃孵育16-20小时PBMCs特异抗原Γ-干扰素抗体加入标记二抗，孵育1小时加入显色液，终止反应观察结果：1个斑点=1个效应T细胞第十八页，共63页。结果判断图阴性结果阳性结果空白对照抗原AESAT-6抗原BCFP10阳性对照（PHA）第十九页，共63页。潜伏性结核（LTBI）诊断技术比较IGRAs与TST相比，具有更高的灵敏度和特异性IGRAs与BCG,NTM无交叉反应，TST有交叉反应难以从感染者中鉴别出活动性肺结核患者小于5岁儿童、免疫力低下患者不适合采用IGRAs检测试剂成本非常高第二十页，共63页。costs（费用）

availabilityforcliniciansandotherhealthworkers（医疗水平）patientacceptability（患者是否接受）easeofdistributionandstorage（实验平台）

第二十一页，共63页。核酸扩增技术核酸扩增技术反应条件扩增产物检测方法代表公司RT-PCR热循环DNA实时RocheRT-LAMP恒温DNAEikenGenoType®MTBDRplus热循环DNAHainLifescienceCPA恒温DNA优思达NASBA恒温RNAbioMerieuxTMA恒温RNA终点Gen-ProbeSAT恒温RNA实时仁度SAT：SimultaneousAmplificationandTesting(RNA仁度)CPA:CrossPrimingAmplification(DNA/RNA,优思达)LAMP:Loop-MediatedIsothermalAmplification(DNA,Japan)TMA:TranscriptionMediatedAmplification(RNA,Gen-Probe)GenoType®MTBDRplus：(HainLifescience)

NASBA:NucleicAcidSequence-BasedAmplification(RNA,OT)

RCA:RollingCircleAmplification(DNA,MolecularStaging)

HDA：Helicase-DependantAmplification(DNA,Biohelix,NEB)第二十二页，共63页。RNA拷贝数≥DNA拷贝数生命力旺盛的病原体RNA转录活跃较好的愈后指标交叉污染少TMA、SAT优点RNA作为临床分子诊断靶标第二十三页，共63页。二、SAT技术同一温度下（42℃），以RNA为起始模板，通过M-MLV反转录酶产生一个双链DNA拷贝，然后利用T7RNA多聚酶从DNA拷贝上产生多个（100～1000个）RNA拷贝；每一个RNA拷贝再从反转录开始进入下一个扩增循环；同时，带有荧光标记的探针和这些RNA拷贝特异结合，产生荧光。该荧光信号可由荧光检测仪器实时捕获，直观反映扩增循环情况RNA(+)ForwardPrimerRTRNaseHactivityReversePrimerRTT7100-1000copiesMolecularBeaconReversePrimerForwardPrimerRT/RNaseHactivityRNA(+)DNA(-)DNA(-)DNA(-)DNA(-)DNA(+)RNA(-)RNA(-)RNA(-)DNA(+)DNA(+)第二十四页，共63页。TB-SAT操作步骤阳性结果阴性结果恒温扩增--42°CRNA检测--起始靶标与扩增产物都是RNA扩增产物的污染更少--RNA环境中易降解更高的扩增效率--30分钟内扩增10亿倍反应稳定--抑制物少高灵敏度、特异性活菌检测操作简单、快速第二十五页，共63页。第二十六页，共63页。MTBDRsl-鉴定XDRMTBDRplus-鉴定MDRMTBC-鉴定MTB复合群MTBCM-鉴定MTB和NTM分类Gene-Probe(TMA/Hain)技术第二十七页，共63页。三、MTBC-鉴定MTB复合群(TMA技术)方法名称：

HPV（HybridizationProtectionAssay）-杂交保护分析法为Gen-probe公司专利原理：

以rRNA为靶标，采用线性探针技术检测结核分枝杆菌复合群检测设备：

LEADER50iHPA-MTD(MycobacteriumTuberculosisDirect):

2.5h报告，直接从标本中检测结核菌HPA-Accuprobe:<1h报告，用菌落或自动培养系统的菌第二十八页，共63页。样本细胞溶解目标r-RNA释放MTD技术路线杂交体rRNAAEAEAEAEAEAEAEAE60°C15分钟加入探针探针杂交AEAEAE选择性试剂60°C化学发光读数仪荧光检测第二十九页，共63页。MTD技术特点第三十页，共63页。MTD结核分枝杆菌检测技术特点采用分子技术快速鉴定（小时）结核分枝杆菌复合群标本可以是涂片阴性或者阳性的痰标本；也可以是培养物唯一获得FDA推荐的凃阴样本快速检测技术检测RNA，RNA只能来源于活的细菌，可鉴定活动性结核病人）采用TMA恒温扩增，不使用PCR仪器，无需专业的PCR实验室认证HPA杂交保护分析技术：灵敏、特异严格的实验室防污染技术：整个实验过程所有试剂和样本全部在同一个反应管内进行，杜绝交叉污染第三十一页，共63页。MTD结核分枝杆菌的直接检测意义TB与其他分枝杆菌区分AIDS患者鸟分枝杆菌小肠黏膜感染龟分枝杆菌引起严重院内感染（南方某医院）提高TB检出率CSF、胸腹水等疑似患者

长期低热、ESR持续增快，排除肿瘤和免疫性疾病患者，做血、痰TB菌MTD检测第三十二页，共63页。DNA作为临床分子诊断靶标第三十三页，共63页。四、MTBDRplus-鉴定MDR方法名称：耐多药结核病(MDR-TB)快速诊断为HainLifescience公司专利原理：采用线性探针技术（Line-Probe或称DNA-Strip）检测结核分枝杆菌复合群利福平(rpoB)和异烟肼(katG和inhA)等结核治疗药物的耐药基因来判断TB体内耐药性MTBDRplus:

6h报告结核分枝杆菌复合群鉴定与耐药结果第三十四页，共63页。抗结核药物靶基因编码的产物靶区域和突变率最常见突变位点耐药水平RFPrpoBRNA聚合酶β亚单位RRDR81bp，95％Codon531，30-75％高INHkatG过氧化氢酶-过氧化物酶整个基因，60-95％S315T，60-95％高INHinhA烯酰基还原酶调节区，25％inhA-15低INHahpC-Promoter过氧化物酶启动区，12%低PZApncA吡嗪酰胺酶整个基因，68-97％无特定位点高EMBembB阿拉伯糖基转移酶ERDR少数密码子，47-94％Codon306，47-89％高SMrpsL核糖体蛋白S12Codons43和88，40-95％K43R，40-90％高SMrrs16SrRNA多个碱基，29%513位、905位碱基，各占10.3%低喹诺酮类gyrAgyrBDNA旋转酶67~106位,75-94%Codon90,94高结核耐药的分子机制第三十五页，共63页。MTBDRplus技术路线DNA提取PCR扩增探针杂交结果判读第三十六页，共63页。结果解释野生型：有杂交带显色为“+”，表示未发生突变耐药突变位点：有杂交带显色为“+”，表示发生突变敏感：所有野生型探针“+”和所有耐药位点探针“-”耐药：对应药物有1条野生型探针“-”或有1条耐药位点“+”第三十七页，共63页。

优势快速检测RFP和INH的耐药时间短、操作简单、安全高特异性和灵敏度较高、重复性好主观因素影响小、更为可靠不足不能检测所有药物的耐药基因型缺少ahpC-oxyR间隔序列范围不能取代传统细菌学检测、只能作为参考技术特点MTBDRplus技术第三十八页，共63页。方法结果比例法药敏结果耐药敏感灵敏度（%）特异度（%）符合率（%）MTBDRplusRFP耐药48098.0100.098.5敏感116RFP（涂阳）耐药391295.192.192.7敏感2140INH耐药45086.5100.089.7敏感716INH（涂阳）耐药63098.4100.099.5敏感1129MTBDRplus技术性能参数JClinMicrobiol.2010Aug;45(8):2635-40.Epub2007May30第三十九页，共63页。MTBDRplus技术性能参数中国人群存在一定数量的KatGS315N突变第四十页，共63页。WHO、盖茨基金会推荐使用的快速线性探针技术，可以在6小时内给出药敏鉴定结果可以做一线结核药物（异烟肼利福平）、二线结核药物的耐药检测（乙胺丁醇、氟喹诺酮类药物、可注射结核药物）标本可是涂片阳性的痰标本，或是培养物技术步骤简单：核酸提取、PCR扩增、核酸杂交仪检测每个试剂条上自带质控：CC杂交质控、AC扩增质控、TUB结核分枝杆菌质控，确保整个实验流程的可信度

HAIN-结核分枝杆菌耐药快速检测系统特点第四十一页，共63页。五、交叉引物恒温扩增技术

(CrossPrimingAmplification,CPA)本试剂盒将病原体DNA扩增、核酸杂交和核酸试纸条检测三种技术有机地融为一体，在恒温扩增反应中加入两对TB特异性引物、一对特异性探针，同时一次性完成TBDNA的扩增及杂交过程，然后用3号一次性核酸检测装置对TB感染进行定性诊断，其检测灵敏度为10个病原体，高特异引物设计确保了结果的可靠性。由于待测样本的扩增（PCR管盖和石蜡油双重保护）和检测过程均在物理封闭条件下完成，所以本试剂盒具有防止实验室扩增物交叉污染，防止假阳性的效果杭州优思达公司第四十二页，共63页。CPA技术原理图A:引入交叉引物位点B:交叉引物扩增C:检测产物第四十三页，共63页。CPA技术路线图核酸提取痰液石蜡油反应液试剂配制63±2℃恒温扩增金属浴防污染检测装置取出反应管15-30分钟读取结果第四十四页，共63页。有色颗粒抗A抗体双重标记的特异性扩增物阳性Ａ抗Ｂ抗体有色颗粒抗A抗体ＡＢ停留，显色试纸条检测结果判读原理图抗体包被的颗粒Ｂ有色颗粒抗A抗体阴性无特异性扩增物抗Ｂ抗体有色颗粒抗A抗体无抗Ｂ抗原有色颗粒流出Ｂ停留，但无色ＡＡ第四十五页，共63页。结果的判读

阳性：试纸条出现两条红色条带，一条位于质控区（C线），一条位于检测区（T线）且其强度≥L4（与附带的色卡比较）。表明样本中含有结核分枝杆菌，且其水平达到或超过本试剂盒的最低检出限

阴性：试纸条质控区（C线）出现一条红色条带，检测区（T线）没有条带或者其强度＜L4（与附带的色卡比较）。表明样本中不含结核分枝杆菌，或其水平低于本试剂盒的最低检出限

无效：试纸条质控区（C线）未出现条带。表明试剂盒已损坏、失效或者操作有误恒温扩增-CPA第四十六页，共63页。CAP技术CPA的优势：快速，简单，灵活，稳定Affordable低价:不需昂贵的设备和分子实验室Sensitive灵敏：10个菌/ml；与快培比较：87%Specific特异：能鉴别人型和牛型结核分枝杆菌User-friendly容易使用：不需PCR仪,操作简单Rapid/robust快速/稳定：样本到结果2小时Equipment-free无仪器：仅需离心机、水浴锅或金属浴Deliverable易储运：不需冷链运输。装置可储存于室温ASSURED

第四十七页，共63页。CPA技术性能参数第四十八页，共63页。六、环介导恒温扩增技术

(Loop-MediatedIsothermalAmplification，LAMP)环介导恒温扩增法是日本荣研化学独立研发的一种“简便、快速、准确、廉价”的基因扩增方法。它的特征是针对目标DNA链上的六个区段设计四个不同的引物，然后再利用链置换反应在一定温度下进行反应。反应只需要把基因模板、引物、链置换型DNA合成酶、基质等共同置于一定温度下（60-65）、经一个步骤即可完成。扩增效率极高，可在15min-1h内实现109-1010倍的扩增。而且由于有着高度的特异性，只需根据扩增反应产物的有无可对靶基因序列的存在与否作出判断

不需要使双链DNA先变性成单链

扩增反应在等温下可持续进行

扩增效率极高

针对六个区段使用两种不同的引物，可特异性扩增靶基因序列

仅使用一种链置换DNA聚合酶，成本低廉

扩增产物是在同一条DNA链上互补序列周而复始形成大小不一的结构

当模板是RNA时，仅需加入逆转录酶即可与DNA一样进行扩增第四十九页，共63页。LAMP技术原理动画图第五十页，共63页。第五十一页，共63页。LAMP方法建立阶段所需的试剂DNA扩增RNA扩增模板DNA引物FIPF3BIPB3BstDNA聚合酶dNTPs反应缓冲液模板RNA引物FIPF3BIPB3BstDNA聚合酶逆转录酶dNTPs反应缓冲液第五十二页，共63页。LAMP技术结果判读原理图LAMP法结果判断方式----目视检查混浊LAMP法结果判断方式/----目视检查绿色荧光/浊度检测仪第五十三页，共63页。扩增反应在等温条件（60～65℃）下连续进行

⇒可以使用简便、廉价的扩增装置扩增效率高、可在短时间内完成扩增⇒可在短时间内得出结果有非常高的特异性⇒可得出“扩增反应发生=有目的菌存在”的结论产生大量扩增产物，检测方法简便⇒无需用电泳、特殊探针等，可通过浊度仪、荧光目视方法确认扩增结果从扩增到检测可在1个反应试管内（封闭系统）完成⇒可防止由于扩增产物产生的污染从RNA经一步反应可完成扩增⇒无需另外进行逆转录反应小结LAMP技术特点第五十四页，共63页。LAMP技术的应用领域

食品领域・食物中毒致病菌的检测・食品的卫生管理・食物中毒的防止临床领域・病原菌、病毒的检测及鉴定・通过SNP多态性分型决定用药量农业领域・植物病害的早期发现及蔓延防止・转基因作物的检测环境领域・环境、水中病原微生物的检测工业领域・工业产品用大量DNA的生产成为可能畜牧业领域・雌雄性别判断・病原微生物的检测・遗传病的发现第五十五页，共63页。LAMP技术性能参数第五十六页，共63页。七、DNA微阵列（基因芯片）技术DNA微阵列或芯片技术是利用光导化学合成、照相平板印刷以及固相表面化学合成等技术，在固相表面合成成千上万个寡核苷酸探针，或将液相合成的探针由微阵列器或机器人点样于尼龙膜或硅片上，再与放射性同位素或荧光物标记的DNA或cDNA杂交，用于分析DNA突变及多态性、DNA测序、监测同一组织细胞在不同状态下多种组织细胞基因表达水平的差异、发现新的致病基因或疾病相关基因等多个研究领域博奥生物第五十七页，共63页。基因芯片技术操作流程样品制备试剂配制杂交激光共焦扫描软件判读第五十八页，共63页。分枝杆菌菌种鉴定试剂盒（DNA微阵列芯片法）

同时快速检测17种分枝杆菌：结核、胞内、鸟、戈登、堪萨斯、偶然、瘰疬、浅黄、土、龟-脓肿、草、不色、海-溃疡、金色、苏尔加、蟾蜍及耻垢。

分离株或者痰样本均可检测。通量：同时检测17种分枝杆菌速度：6小时versus

传统4周灵敏度：103CFU/反应特异性：防污染体系；对照设计严谨；自动判读结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒（DNA微阵列芯片法）

基于rpoB/katG/inhA的基因突变，快速检测分离株或者痰样本中结核分枝杆菌多药耐药（利福平、异烟肼）通量：两种一线抗结核药物、8个突变位点速度：6小时versus

传统4~8周灵敏度：103CFU/反应特异性：防污染体系；对照设计严谨；自动判读基因芯片技术特点第五十九页，共63页。基因