细胞工程论文

细胞工程论文植物组织与细胞培养技术摘要本文主要通过实验对外植体、灭菌方式、基本培养基、植物生长调节剂、培养条件等方面来介绍胡萝卜组织与细胞培养技术，提出了一些实验过程中存在的问题，并针对这些问题作了一定的分析。实验主要包括以下几部分：1、器械清洗与消毒；2、植物组织培养基的配制；3、胡萝卜愈伤组织的诱导与继代；4、植物细胞的悬浮培养与其次生代谢产物β-胡萝卜素的分离检测；5、愈伤组织再分化的诱导。关键词胡萝卜，组织培养，外植体，愈伤组织，悬浮培养，再分化。1.引言植物组织细胞培养是以植物细胞的全能性为理论基础，运用无菌操作技术，在附加生长调节剂的人工培养基上，控制培养条件，使植物细胞或组织得以离体生长，快速无性繁殖。作为实验体系，可以进行植物组织细胞的生长、发育、分化、基因转移、细胞代谢和遗传规律等基础研究。作为生产方式，可以进行优良种质资源快速繁殖和脱毒苗的工厂化生产，以及大规模次生代谢物的工业化生产。现代植物组织培养技术还包括原生质体培养，人工种子的制备和应用，优良种质资源的长期低温保存等，并且作为一种生物新技术在农业。园林。中药材等领域广泛应用并不断完善和创新。2.胡萝卜组织和细胞培养的过程2.1器械清洗与消毒细胞培养技术与其他一般实验室工作的主要区别在于要求保持无菌操作，避免微生物及其他有害因素的影响。一般标准的细胞培养室应包括配液室、准备室和培养室。三室既相互连接又相对独立，各自完成培养过程中的不同操作。在组织培养过程中，离体细胞对任何毒性物质都十分敏感。毒性物质包括解体的微生物及细胞残余物以及非营养的化学物质，因此对新采用和重新使用的培养皿等培养用品都要严格清洗和消毒。在此主要介绍玻璃器皿的清洗与消毒。2.1.1玻璃器皿的清洗步骤：按浸泡→刷洗→浸酸→冲洗等四步程序进行。①浸泡：新购进的玻璃器皿常带有灰尘，呈弱碱性，或带有铅、碑等有害物质，故先用自来水浸泡过夜、水洗，然后再用2%~5%盐酸浸泡过夜或煮沸30min，水洗。要领：培养用后的玻璃器皿要立即泡入清水中，使下道刷洗工作能顺利进行。用后的玻璃器皿常带有大量的蛋白质附着，干涸后不易刷洗掉，用后要立即用清水浸泡。②刷洗：用软毛刷、优质洗涤剂，刷去器皿上的杂质，冲洗晾干。要领：浸泡后的玻璃器皿用毛刷沾洗涤剂去器皿上的杂质、刷洗次太多，会损害器皿的表面光洁度，洗涤剂有使pH上升的趋势，所以易选用软毛刷和优质洗涤剂。禁止用去污粉。因其中含有砂粒。会严重破坏玻璃器皿的光洁度。特别注意刷洗瓶角部位。酸浸之前要把洗涤剂冲干净。③浸酸：将器皿浸泡于清洁液24h，如急用也不得少于4h。清洁液由重铬酸钾、浓硫酸及蒸馏水配制而成，具有很强的氧化作用，去污能力很强。经清洁液浸泡后，玻璃器皿残留的末刷洗掉的微量杂质可被完全清除。④冲洗：先用自来水充分冲洗，吸管等冲流10min，瓶皿需每瓶灌满、倒掉，反复10次以上。然后再经蒸馏水漂洗3次,不留死角。晾干或烘干备用。对已用过的器皿，凡污染者必先经煮沸30min或放3%盐酸中浸泡过夜，未污染者可不需灭菌处理，但仍要刷洗、清洁液浸酸过夜，冲洗等。2.1.2玻璃器皿的消毒严格的消毒灭菌对保证细胞培养的成功是极为重要的，其方法分为物理法和化学法两类。前者包括干热、湿热、滤过、紫外线及射线等，后者主要指使用化学消毒剂等。玻璃器皿的消毒主要用到以下两种方法：①热灭菌：玻璃器皿，160~170℃，90~120min或180℃45~60min。②蒸气灭菌：用于玻璃器皿、滤器橡胶塞、解剖用具、耐热塑料器具、受热不变性的溶液等，不同物品其有效灭菌压力和时间不同，如培养用液、橡胶制品、塑料器皿等用68kPa(115℃)高压灭菌10min；布类、玻璃制品、金属器械等用103kPa(121.3℃)高压灭菌15~20min。2.2植物组织培养基的配制离体植物组织、细胞生长与分化所需要的营养物质、激素等由培养基供给。基本培养基通常包括大量元素、微量元素、有机物以及糖和水。完全培养基是在基本培养基的基础上，附加植物生长调节剂，以及椰乳、香蕉汁、番茄汁、酵母提取物和麦芽膏等天然提取物。不同物种、不同部位的外植体以及不同的培养阶段，要求的营养和激素等条件不同。以下为本次实验所需培养基的配制方法与过程。2.2.1母液的配制为了避免每次配制培养基时都要对所需的各种成分进行称量，人人们便把培养基中必需的一些物质按原量的10倍、100倍或1000倍称量后放在一起，成为一种浓缩液。这种浓缩液就叫“母液”。必需的物质有：⑴大量元素；⑵微量元素；⑶铁盐；⑷有机物质；⑸生长调节物质。2.2.2配制培养基（1）吸取各种母液，按培养基配方吸取一定量的各种母液混合在一起。大量及微量元素的母液吸取量为：母液吸取量（ml）=配制培养基的数量（ml）/母液扩大倍数有机物及生长调节物质的母液吸取量为：配制每升培养基母液吸取量（ml）=每升培养基要求的含量（mg）/每毫升母液中的含量（mg）（2）称取一定量的蔗糖（或葡萄糖等），溶解后与上述溶液混合；（3）称取一定量的琼脂，加蒸馏水，加热使其熔化成透明状后，和上述溶液合并注：胡萝卜愈伤组织诱导用：MS+2，4-D0.5mg/L+KT0.4mg/L+3%（30g/L）白砂糖+0.9%（9g/L）琼脂，pH5.8胡萝卜愈伤组织悬浮培养用：MS+2，4-D0.4mg/L+3%（30g/L）白砂糖，pH5.8（4）用热蒸馏水定容到一定体积，继续加热，不断搅拌，直至琼脂完全溶解；（5）用精密pH试纸测pH值，用1mol/L或0.1mol/L氢氧化钠或盐酸将培养基的pH值调至5.8~6.0；（6）将配好的培养基用分装器分装到干净的培养瓶内。琼脂约在40℃时才凝固，所以有足够的时间来进行分装工作；（7）用封口膜或瓶盖封口，并对不同的培养基及时做好标记。2.2.3灭菌通常培养基应