【教学】第十四章-长期毒性作用及其试验方法

第十四章长期毒性作用及其试验方法

long-termtoxicityimpactandtestmethod

5/1/20231.第一节基本概念和目的第二节试验设计原则及方法5/1/20232.

第一节基本概

念

和目的5/1/20233.

长期毒性作用是指药物以一定的等级剂量连续多日给予受试动物所产生的有害作用。为观察这种有害作用而设计的毒理学试验称之为长期毒性试验。一、定义

急性毒性试验

是为观察和评价急性毒性的有害作用或中毒反应而设计的一种毒理学试验。研究药物一次或24小时内多次给予受试药物后，一定时间内所产生的毒性反应。5/1/20234.123给

药

的

期

限

不

同长期毒性试验与急性毒性试验的根本差别5/1/20235.根据给药期限的长短，可分为：亚慢性毒性试验——给药期限不超过90天或不超过试验动物平均寿命的10%；慢性毒性试验——给药期限超过90天或超过试验动物平均寿命的10%；终生毒性试验数代毒性试验5/1/20236.123给

药

的

期

限

不

同给

药

的

剂

量

范

围

不

同长期毒性试验与急性毒性试验的根本差别5/1/20237.蓄积作用(accumulationaction)

当较长时间连续、反复给药时，或者说给药的时间间隔和剂量超过机体消除药物的能力，就会出现药物进入机体的速度

(或总量)超过排除的速度(或总量)的现象，此时药物就有可能在体内逐渐增加并贮存起来，即蓄积作用。

5/1/20238.

蓄积作用的表现形式作用量积蓄功能性蓄积5/1/20239.123给

药

的

期

限

不

同给

药

的

剂

量

范

围

不

同观

察

的

毒

效

应

不

同长期毒性试验与急性毒性试验的根本差别5/1/202310.急性毒性试验是以死亡为观察终点的质反应过程长期毒性试验重点观察体重、血液生化等量反应指标（量变→质变）5/1/202311.二、目的与意义5/1/202312.1预测受试物可能引起的临床不良反应2判断受试物反复给药的毒性靶器官或组织提示临床试验中需重点监测的指标43推测临床试验的起始剂量和重复用药的安全剂量范围为临床试验中的解毒或解救措施提供参考5长期毒性试验的目的5/1/202313.第二节试验

设

计

原

则

及

方

法5/1/202314.一、一般原则和要求基本原则全面、严谨、合理整体性随机、对照、重复5/1/202315.一、一般原则和要求基本原则整体性长期毒性试验不能与药效学、药代动力性和其他毒理学研究割裂，试验设计应充分考虑其他药理毒理研究的试验设计和研究结果。长期毒性试验的结果应该力求与其他药理毒理试验结果互为印证、说明和补充。5/1/202316.一、一般原则和要求选用两种实验动物三个剂量给药途径应与临床拟用途径相同基本要求5/1/202317.一、一般原则和要求

至少在两种动物体上进行，兼顾雌雄性别。选用两种实验动物基本要求5/1/202318.一、一般原则和要求三个剂量剂量至少分为高、中、低三个档次。高剂量组应能充分反映药物的毒性，低剂量组不出现毒性反应。同时设一溶剂(或赋形剂)对照组或已知药物毒性对照组。基本要求5/1/202319.一、一般原则和要求给药途径应与临床拟用途径相同口服给药大鼠一般常用灌胃，灌胃的容量为每天1~2ml/100g，也可将受试药物混在饲料或水中给予，但要保证每只动物按规定剂量在一定时间内服入。静脉注射大鼠时可采用腹腔或皮下代替，各剂量组采用等容量不等浓度给药。特殊情况另作说明。基本要求5/1/202320.理想动物的标准：对受试物的生物转化与人体相近；对受试物敏感；已有大量历史对照数据。二、实验动物

5/1/202321.☆我国药政部门规定的基本原则是选用两种动物,一种为啮齿类，首选大白鼠；另一种为非啮齿类，首选狗。1.种类及品系二、实验动物

5/1/202322.☆我国药政部门规定的基本原则是选用两种动物,一种为啮齿类，首选大白鼠；另一种为非啮齿类，首选狗。1.种类及品系二、实验动物

Wistar大鼠SD大鼠

5/1/202323.☆我国药政部门规定的基本原则是选用两种动物,一种为啮齿类，首选大白鼠；另一种为非啮齿类，首选狗。1.种类及品系二、实验动物

一类新药：Beagle犬二类新药：杂种狗

5/1/202324.☆我国药政部门规定的基本原则是选用两种动物,一种为啮齿类，首选大白鼠；另一种为非啮齿类，首选狗。1.种类及品系二、实验动物

☆在吸入给药时，猴是首先推荐的动物，因为它在呼吸系统的解剖学和生理学方面比其它动物更接近人类。☆如研究计划生育用药，应选择猴或其他大动物。5/1/202325.5/1/202326.5/1/202327.

Beagle犬：原产英国，纯种小猎兔犬Beagle犬的特点：体型小,毛短,性情温和,亲人,抗病力强

缺点：价格昂贵5/1/202328.2.起始月(周)龄一般选择较年轻的或正处于生长发育阶段的动物。二、实验动物

5/1/202329.2.起始月(周)龄二、实验动物

长期毒性试验的给药期限较长；1原因：处于生长发育阶段的动物对药物的毒性反应较敏感；2年龄较大的动物反应性降低,存在许多自发性疾病干扰试验结果。3一般选择较年轻的或正处于生长发育阶段的动物。5/1/202330.啮齿类动物最好在断奶后不久即开始给药

大鼠起始周龄要求在4~9周龄；

犬的起始月龄为4~9月龄，一般不超过12月龄；如选用杂种狗，起始年龄可稍大些。二、实验动物

2.起始月(周)龄5/1/202331.起始体重应在体重均值±

20%的范围内。二、实验动物

2.起始月(周)龄5/1/202332.3.性别及数量（1）性别二、实验动物

☆一般来讲是兼用两种性别的动物，每个剂量组中雌雄性别的动物数必须一致。5/1/202333.在特殊情况下如药物对雄性（或雌性）生殖细胞的毒效应已确知，或者急性试验已证明药物对雌雄两性动物的毒性有明显差别时，就应主要选用敏感性别的动物进行试验。二、实验动物

3.性别及数量（1）性别5/1/202334.超过90天的试验啮齿类动物每组至少40只（雌雄各20只）；非啮齿类每组8~10只（雌雄各4~5只）。90天以内的试验啮齿类动物每组至少20只（雌雄各10只）；非啮齿类每组6只（雌雄各3只）；二、实验动物

3.性别及数量（2）数量5/1/202335.超过90天的试验啮齿类动物每组至少40只（雌雄各20只）；非啮齿类每组8~10只（雌雄各4~5只）。90天以内的试验啮齿类动物每组至少20只（雌雄各10只）；非啮齿类每组6只（雌雄各3只）；二、实验动物

3.性别及数量（2）数量《指导原则》：一般大鼠为雌、雄各30只，Beagle犬或猴各3~6只。5/1/202336.恢复期观察的动物数；给药期的长短，过长，试验过程中的自然死亡动物数。注意5/1/202337.4.饲养管理严格控制环境条件，避免不必要的干扰因素是非常重要的。二、实验动物

5/1/202338.酮症酸中毒室内温度饲料或饲料配方湿度光照通风条件饮水质量环境因素4.饲养管理二、实验动物

5/1/202339.光照通风条件酮症酸中毒室内温度饲料或饲料配方湿度饮水质量环境因素4.饲养管理二、实验动物

适宜温度为18~26℃。相对湿度为40%~70%。光照宜持续12h明亮，12h黑暗。通风条件良好。所用饲料应符合动物的营养标准。5/1/202340.光照通风条件酮症酸中毒室内温度饲料或饲料配方湿度饮水质量环境因素4.饲养管理二、实验动物

啮齿类动物雌雄动物应分开饲养，每笼不宜超过5只5/1/202341.酮症酸中毒4.饲养管理二、实验动物

犬光照通风条件酮症酸中毒室内温度饲料或饲料配方湿度饮水质量环境因素单笼饲养，定量喂食。

Beagle犬实验前至少驯养1~2周;

杂种狗应先检疫，驱虫。5/1/202342.试验前观察记录动物的行为活动、饮食、体重、精神状况、心电图，检测心、肝、肾功能2次；选择正常、健康、雌性无孕的动物作为受试动物。5/1/202343.

雪貂作为实验动物的资料介绍，还在本世纪，虽然它还未被广泛应用，但它对人类健康的贡献无疑是很重要的（北美常用）。

5/1/202344.

雪貂是食肉类动物，属于鼬科。经驯化供实验的雪貂毛色呈野生色或白化的。它缺乏盲肠、汗腺，雄貂缺乏前列腺。通常雪貂的实验和繁殖期为5至6年，而整个寿命约14年。雄貂体重可为雌貂的两倍。

雪貂在早期用于传播病毒性疾病的研究，如犬瘟和人类流感，对其它一些病毒性疫病，雪貂也提供了独特的、合适的模型，如麻疹、疱疹性口炎，阿留申病和牛鼻气管炎。雪貂已应用于病毒学、生殖生理、药理学等研究，最近报导特殊适合毒理学试验。还可作为小脑发育不全、流行性感冒等动物模型来研究人类相应的疾病。5/1/202345.三、给药期限按我国药政管理部门的要求，长期毒性试验的给药期限一般为临床疗程的3~4倍时间。创新药品试验周期应不少于90天，超过180天的新药可以在试验开始90天后，同时进行I期临床试验。创新药物是指具有自主知识产权专利的药物。相对于仿制药，创新药物强调化学结构新颖或新的治疗用途，在以前的研究文献或专利中，均未见报道。5/1/202346.我国药政部门关于一般药物重复给药毒性试验期限的规定临床拟用毒性试验期限给药时间啮齿类动物非啮齿类动物﹤5天

2周

2周﹤2周

1月

1月

2-4周

3月

3月

1-3月

6月

6月

﹥3月

6月9月

5/1/202347.我国药政部门关于一般药物重复给药毒性试验期限的规定临床拟用毒性试验期限给药时间啮齿类动物非啮齿类动物﹤5天

2周

2周﹤2周

1月

1月

2-4周

3月

3月

1-3月

6月

6月

﹥3月

6月

9月

每天给药最好固定时间。5/1/202348.四、剂量水平的选择

三个剂量组是必不可少的：一个是足以引起明显的毒性反应的高剂量，但死亡率应控制在10%以内；一个是不引起毒性作用的低剂量(一般为动物有效剂量或临床治疗量的2~3倍)；为表明毒性作用的量—效关系，在上述两个剂量之间插入一个(或多个)中间剂量。5/1/202349.亚慢性毒性试验基础最大剂量：选择90天试验中体重增长不到10%的剂量；中剂量：1/4最大剂量；低剂量：1/8最大剂量。5/1/202350.最高剂量组的基本要求仅出现轻度毒性，不改变试验动物的正常寿命，或至少在给药的前四分之一时间内不影响动物的体质，外观无异常，可有血清酶活力的改变或轻度体重增长抑制（＜10%）。5/1/202351.在选择合适的剂量时还应考虑到：

①药物在体内的生物蓄积作用。对于高蓄积性药物应适当减少其剂量，否则在长期毒性试验结束时各剂量均有可能出现毒性作用；②药物是否有可能被特殊的酶所“解毒”或“活化增毒”，而这些酶又是否易被药物本身所诱导或抑制。③药物在消化道中的稳定性。与胃肠道内容物有亲和性的药物，则应酌情增加剂量。

5/1/202352.可供参考的具体方法（1）半数致死量（LD50）法根据急性毒性的LD50值决定三个剂量。一般在大鼠3个月长期毒性试验中，高、中、低三个剂量可分别采用约LD50的1/10、1/50和1/100剂量，狗各剂量组可采用大鼠相应各组的1/2~1/3剂量。5/1/202353.可供参考的具体方法（1）半数致死量（LD50）法（2）短期蓄积试验过渡法根据急性毒性试验所提供的相关信息，如毒性的量—效关系，毒性出现的剂量范围及敏感动物等，先过渡到7天至21天的短期蓄积性试验，再将获得的参数外推于长期毒性试验。5/1/202354.急性毒性试验蓄积毒性试验和/或7天短期重复给药试验90天重复给药试验180天或更长期重复给药试验5/1/202355.可供参考的具体方法（1）半数致死量（LD50）法（2）短期蓄积试验过渡法

①Traina法

第一步：确定大鼠亚急性毒性试验的最高剂量

根据大鼠的急性毒性试验找出最大无症状剂量，再分别以该剂量及其1/3和1/10量给三组大鼠（雌雄各半）连续服药2~3周。（此剂量下的动物仅出现轻微的毒性反应，如食耗量略减，体重增长率略慢等）5/1/202356.可供参考的具体方法（1）半数致死量（LD50）法（2）短期蓄积试验过渡法

①Traina法

①Traina法

第一步：确定大鼠亚急性毒性试验的最高剂量

第二步：确定犬亚急性毒性试验的最高剂量

以大鼠亚急性毒性试验的最高剂量为起点，给狗单次服用，根据观察结果适当增减剂量（对数间隔），找出狗单次服药的最大无症状剂量，再分别以此剂量及其1/3和1/10量给少数狗连续服药2~3周。5/1/202357.可供参考的具体方法（1）半数致死量（LD50）法（2）短期蓄积试验过渡法

①Traina法

②Homburger法

选择一个剂量给雌雄各5只大鼠，连续服药2周。如果无动物死亡，再成倍增加剂量，直至出现死亡；如果第一个剂量就出现动物死亡，再成倍减少剂量，直至无死亡出现。5/1/202358.可供参考的具体方法（1）半数致死量（LD50）法（2）短期蓄积试验过渡法

①Traina法

②Homburger法

选择一个剂量给雌雄各5只大鼠，连续服药2周。如果无动物死亡，再成倍增加剂量，直至出现死亡；如果第一个剂量就出现动物死亡，再成倍减少剂量，直至无死亡出现。以无动物死亡的剂量为最大非致死量，以首次出现动物死亡的剂量为最小致死剂量，求算最大耐受量（MTD）。5/1/202359.可供参考的具体方法（1）半数致死量（LD50）法（2）短期蓄积试验过渡法

①Traina法

②Homburger法

选择一个剂量给雌雄各5只大鼠，连续服药2周。如果无动物死亡，再成倍增加剂量，直至出现死亡；如果第一个剂量就出现动物死亡，再成倍减少剂量，直至无死亡出现。以无动物死亡的剂量为最大非致死量，以首次出现动物死亡的剂量为最小致死剂量，求算最大耐受量（MTD）。MTD=lg-1[(lg最小致死剂量+lg最大非致死剂量)/2]5/1/202360.可供参考的具体方法（1）半数致死量法（LD50法）（2）短期蓄积试验过渡法

①Traina法

②Homburger法

③Weil法

取初断乳大鼠30或40只，随机分为3~4组，每组雌雄各5只。连续给药7天。观察死亡率、体重、肝肾指数和进食量的改变。找出7天药物最小有效量（MIE）。MIE90天=MIE7天/6.25/1/202361.可供参考的具体方法（1）半数致死量（LD50）法（2）短期蓄积试验过渡法（3）药代动力学（MBS）法

根据药代动力学最大有效安全浓度（MCD）大鼠3个月长期毒性试验时，低、中、高三个剂量可分别采用大鼠的1.0、3.3~6.6和10~20MCD;狗一般可采用大鼠1/2~1/3的剂量。注意：国内应用不多。5/1/202362.可供参考的具体方法（1）半数致死量法（LD50法）（2）短期蓄积试验过渡法（3）药代动力学（MBS）法根据大鼠急性毒性试验的最大耐受量(MTD)(最大无症状剂量)大鼠长期毒性试验的三个剂量分别为1、1/3及1/10MTD；狗和猴可采用大鼠1/2~1/3的剂量。（4）最大耐受量（MTD）法注意：蓄积性大的药物参考价值小。5/1/202363.可供参考的具体方法（1）半数致死量（LD50）法（2）短期蓄积试验过渡法（3）药代动力学（MBS）法根据临床拟用剂量（3个月长期毒性试验）

大鼠低、中、高三个剂量可分别采用50~100倍、25~50倍和10~20倍临床拟用剂量狗可分别采用30~50倍、15~25倍和5~10倍临床拟用剂量猴可采用与狗相近的剂量或略低于狗的剂量进行试验（4）最大耐受量（MTD）法（5）临床拟用剂量（ACD）法5/1/202364.可供参考的具体方法（1）半数致死量法（LD50法）（2）短期蓄积试验过渡法（3）药代动力学法（MBS法）根据人和动物的等效剂量比值，再按一定倍数扩大。（4）最大耐受量法（MTD法）（5）临床拟用剂量法（ACD法）（6）等效剂量法5/1/202365.不同动物的剂量折算系数

动物种属小鼠大鼠豚鼠兔猫猴狗人标准K(剂量折算系数)

1

7

12.3

27.5

29.7

64

124

388体重K(kg体重剂量折算系数)

1

0.71

0.62

0.37

0.30

0.32

0.21

0.11任何R(动物体型系数)

0.059

0.09

0.099

0.093

0.082

0.111

0.104

0.1体重W(标准体重kg)

0.02

0.2

0.4

1.5

2

4

12

70注：有些资料记载的动物体型系数（R）为此表中R值的1000倍，如小鼠R为59，大鼠R为90，这不影响药物剂量的折算。5/1/202366.对于标准体重的动物：

每只用量（mg/只）DB＝DA·KBKA千克体重剂量（mg/kg）dB＝dB·KBKAKA，KB，RA，RB值由上表查找5/1/202367.对于任何体重的动物：

每只用量（mg/只）DB＝DA·RB·(WB)2/3RAWA千克体重剂量（mg/kg）dB＝dA·RB·(WB)2/3RAWA式中DB、dB分别是欲计算的B种动物的每只剂量及公斤体重剂量，DA、dA分别是已知A种动物的每只剂量及公斤体重剂量，WA、WB是已知动物体重，RA、RB是体型系数，可由上表查得。5/1/202368.可供参考的具体方法（1）半数致死量法（LD50法）（2）短期蓄积试验过渡法（3）药代动力学法（MBS法）（4）最大耐受量法（MTD法）（5）临床拟用剂量法（ACD法）（6）等效剂量法5/1/202369.五、给药方法长期毒性试验的给药途径一般应尽量与预期临床使用的途径相一致。临床用药途径为静脉或肌注时，3个月及以上的试验，由于试验周期长大鼠给药有困难，可用腹腔或皮下注射代替。临床用药途径为口服时，可采用口服、灌胃或片剂、胶囊给药，也可混于饲料中给予。5/1/202370.五、给药方法灌胃给药可将供试药物制成一种溶液或混悬液，但必须注意给药容量不应超过1~2ml/100g体重/天。优点：给药剂量精确；时间易于掌握；从药动学角度出发符合临床给药的实际情况。缺点：技术要求高（误入气管）；属外界刺激。5/1/202371.五、给药方法混于饲料给药则需计算食耗。食耗：从断奶至成年期食耗不同。药物量：要求每周或每两周根据各组动物的平均体重进行调整。灌胃5/1/202372.预计动物体重（W）W3rd=W2nd+1/2(W2nd-W1st)预计食耗（FC）FC3rd=FC2nd+1/2(FC2nd-FC1st)预计食耗率（R）R3rd=FC3rd/W3rd=g饲料/kg体重/动物/天

预计药物浓度（C）C3rd=给药剂量（mg/kg体重/动物/天）R3rd（

g饲料/kg体重/动物/天）5/1/202373.注意事项药物在饲料中的含量不应超过5%；药物的异味对饲料进行阶段性检查，确保药物在饲料中的稳定性。饲料抽样：新鲜配制存放一定时间5/1/202374.五、给药方法混于饲料稀释剂：惰性的，如乳糖、甘露醇、干酪、淀粉、白陶土、碳酸钙、磷酸钙。灌胃胶囊或片剂给药，将受试物与稀释剂混合。明胶胶囊，（赋型剂）片剂5/1/202375.五、给药方法一般情况：长期毒性试验均强调每天给药，每周必须给药7天。给药期限长（≥3个月）的药物每周至少应给药6天。给药频率特殊情况：参考体内代谢速度。5/1/202376.六、观察及测定指标

试验前，啮齿类动物至少应进行5天的适应性观察，非啮齿类动物至少应驯养观察1~2周，应对动物进行一般观察及血液生化学指标的检测。

试验期间，至少应每天或每两天作一次详细的观察。

试验结束时，必须留1/3的动物做恢复期的观察试验，其观察期时间一般不超过28天（可逆性）。5/1/202377.（一）日常观察

1.一般观察内容

包括对实验动物被毛、皮肤、眼睛、粘膜、孔道(及其分泌物)、呼吸、循环、自主神经系统、躯体和肢体活动情况以及精神行为进行仔细地观察；对动物粪便的量、色泽和内含物，散失的食物，饮水瓶中残余的水以及一切可以反映动物生活情况变化的各种迹象，都必须加以注意。所有出现的症状都必须记录在案。观察及测定指标5/1/202378.1.一般观察内容

如果发现动物死亡，必须尽可能快地进行尸体剖检，以减少组织自溶。将组织置于10%的中性福尔马林或其它适宜的固定液中。如果尸体剖检不能立即进行，则必须将动物冷藏起来以延缓组织自溶。（一）日常观察

观察及测定指标5/1/202379.1.一般观察内容

对濒死的动物也应立即处死作尸体剖检。（一）日常观察

尸体剖检后行组织病理学检查、评价。观察及测定指标5/1/202380.2.生长率

（一）日常观察

观察及测定指标食耗量饮水量体重

低毒药物的毒性表现5/1/202381.（一）日常观察

观察及测定指标3.食耗食耗常用来评价给药对食欲及食物利用率的影响食耗的计算

将加入供食器具中饲料的重量减去剩余的饲料重量再除以给食天数5/1/202382.将给药组和对照组的食耗加以比较，有助于说明药物是否影响实验动物的食欲。（吸收、合成代谢）

（一）日常观察

观察及测定指标3.食耗食耗常用来评价给药对食欲及食物利用率的影响食耗的计算

5/1/202383.（二）测定指标

1.器官重量

观察及测定指标5/1/202384.２００５年ＳＦＤＡ组织编写

《药物研究技术指导原则》规定长期毒性试验中需称重并计算脏器系数的器官脑肝脏肾上腺脾脏附睾子宫心脏肾脏胸腺睾丸卵巢肺脏观察及测定指标目的：确定靶器官甲状腺、前列腺5/1/202385.长期毒性试验中进行病理组织学检查的组织或器官：脑（大脑、小脑、脑干）垂体甲状腺食管胃肝脏肾脏脾脏气管主动脉附睾卵巢前列腺坐骨神经眼（眼科检查发现异常时）＊给药局部淋巴结脊髓胸腺甲状旁腺唾液腺小肠和大肠胆囊＊肾上腺胰腺肺心脏睾丸子宫乳腺膀胱视神经＊骨髓注：＊为啮齿类动物可不进行组织病理学检查的组织或器官5/1/202386.

器官重量降低，表示该器官萎缩或发育不良；器官重量增加提示可能有充血、水肿、增生、肥大、酶诱导变

化或新生物等。

将动物处死后取出上述器官，除去附着的组织、除尽余血后立即称重（注意勿使组织干燥）。（二）测定指标

观察及测定指标

1.器官重量

5/1/202387.2.血液学（二）测定指标

常规的血液学参数骨髓涂片观察及测定指标

1.器官重量

5/1/202388.２００５年ＳＦＤＡ组织编写

《药物研究技术指导原则》规定血液学指标红细胞计数红细胞容积平均红细胞血红蛋白网织红细胞计数血小板计数血红蛋白平均红细胞容积平均红细胞血红蛋白浓度白细胞计数及分类凝血酶原时间红细胞压积观察及测定指标5/1/202389.

血液学指标观察时间非啮齿类动物一般于整个试验周期中每隔1.5~2个月采血测定一次各项指标。啮齿类动物

试验周期为6个月时，可于试验中期、试验末

期以及恢复期分别剖杀部分动物(约1/4、

2/4、1/4)，进行各项检查；试验周期为3个月时，可于试验未期以及恢复