孕妇艾滋病、梅毒和乙肝检测技术

孕妇艾滋病、梅毒和乙肝检测技术第一页，共96页。

前言

对于我们医务工作者在医疗活动中针对符合一定条件的就诊者提供艾滋病和梅毒、乙肝的检测，我们称之为“筛查”。筛查是预防艾滋病和梅毒、乙肝的一项重要策略，为世界卫生组织和我国所倡导。它的目的是早期发现感染者，及早得到诊断和治疗，达到治愈感染者、消除传染源、阻断进一步传染的目的。同时，这种筛查也是“有的放矢”的，它是针对特定的人群、特定的情况而进行的，并非乱检查、乱收费。第二页，共96页。传染病传染过程：病原体侵入病原体与机体相互作用与斗争结局隐性感染病原携带显性感染

死亡宿主病原体被清除3第三页，共96页。传染病传播的基本条件

三个基本环节：传染源易感人群传播途径4第四页，共96页。5第五页，共96页。传染病的流行过程

传染源

自然和社会因素传播途径易感人群6第六页，共96页。潜伏期传染期病原侵入排出病原体出现症状时间过程潜伏期停止排出病原体（痊愈、死亡等）传染期7第七页，共96页。

传染病种类繁多，为了保障公众的健康与安全，国家以法律的形式将某些传染病列为法定传染病以加强管理。

2004年新颁布的《中华人民共和国传染病防治法》规定了甲类、乙类和丙类共37种法定传染病。其中：

1、甲类传染病2种：鼠疫、霍乱

法定传染病8第八页，共96页。

乙类传染病25种：传染性非典型肺炎、艾滋病、病毒性肝炎、脊髓灰质炎、人感染高致病性禽流感、麻疹、流行性出血热、狂犬病、流行性乙型脑炎、登革热、炭疽、细菌性和阿米巴性痢疾、肺结核、伤寒和副伤寒、流行性脑脊髓膜炎、百日咳、白喉、新生儿破伤风、猩红热、布鲁氏菌病、淋病、梅毒、钩端螺旋体病、血吸虫病、疟疾。(其中传染性非典型肺炎、炭疽中的肺炭疽和人感染高致病性禽流感按甲类管理。)

9第九页，共96页。艾滋病和梅毒、乙肝离我们远吗？

艾滋病和梅毒、乙肝是一种危害性极大的传染病，尤其是近年来,我国艾滋病和梅毒、乙肝感染者和病人呈逐年上升趋势，从2005年的0.4%上升到2017年的21.45%；并从高危人群向一般人群扩散,通过母婴传播途径感染的比例也在增加。若不采取预防干预措施，感染了艾滋病和梅毒、乙肝病毒的母亲，生下染有艾滋病和梅毒、乙肝病毒婴儿的比例很大,严重威胁着广大妇女和儿童的健康。因此,预防艾滋病和梅毒、乙肝母婴传播是保护儿童免遭艾滋病和梅毒、乙肝侵害、减少儿童感染艾滋病和梅毒、乙肝的重要措施，这就需要我们提高警惕，认识到艾滋病感染的危险性，而接受专业人员的咨询和筛查是有效的解决途径。第十页，共96页。艾滋病、梅毒、乙肝--概况

艾滋病梅毒乙肝病原体HIV病毒梅毒螺旋体HBV病毒传染源HIV感染者/AIDS梅毒患者急慢性乙肝患者和携带者传播途径血液/性/母婴传播性/母婴传播/接触/血液血液/母婴传播/性预防献血员筛查/高危行为改变/孕妇筛查献血员筛查/高危行为改变/孕妇筛查主动免疫与被动免疫/孕妇筛查第十一页，共96页。母婴传播途径1、艾滋病：约15～35%

HIV阳性孕妇会发生母婴传播。90%以上儿童HIV感染者是由母亲垂直传播而感染。2、梅毒：流产、早产、死胎或马鞍鼻、先天性耳聋等。3、乙肝：在我国，人群中40-50%是由母婴传播积累而成。第十二页，共96页。

介绍相关检测技术一.艾滋病实验室检测技术HIV抗体检测核酸检测CD4+T淋巴细胞检测二.梅毒检测技术显微镜检查法血清学检查法三.乙肝检测技术HBV免疫标志物检测HBV-DNA

第十三页，共96页。检测时要注意什么？

作为受检者，应该注意的是：一是要向医生提供较为详尽的病史，特别是危险的性行为，不要因为不好意思而隐瞒。只有这样，医生才能正确判断感染的危险性，有助于分析检测结果并做出诊断和处理的决断。二是注意检测的“窗口期”问题，也就是从病原体进入人体到血液中产生足够量的、能用检测方法查出抗体的这段时期。对于艾滋病“窗口期”，随着新一代、敏感的艾滋病抗体检测手段出现后，艾滋病窗口期已经缩短到最为保守的艾滋病抗体峰值出现的第6周。第十四页，共96页。就目前广泛采用的第三、四代双原夹心法和酶联法以及化学发光法等检测手段而言，艾滋病的窗口期可以缩短到14～21天。而梅毒虽无“窗口期”说法，但从感染到可检测到抗体也需要3～4周甚至更长时间。因此，在有高危的性行为后接受检测，结果虽为阴性但未渡过“窗口期”，仍不可掉以轻心，需要继续随访直到确认已渡过“窗口期”。三是结果的解释和分析要听从医生的专业建议。艾滋病、梅毒检测结果的意义随受检者不同的情况而有差别。因此受检者应该听从医生对结果的解释和建议，不可盲目悲观或盲目乐观。乙肝，丙肝，梅毒，艾滋检测的必要性第十五页，共96页。

艾滋病、梅毒、乙肝实验室检测技术第十六页，共96页。艾滋病抗体检测及

样品处理实验室质量管理生物安全质量控制梅毒乙肝

检测要点第十七页，共96页。检测技术一、艾滋病检测技术HIV抗体检测酶联免疫吸附试验（ELISA）核酸检测CD4+T淋巴细胞检测快速检测（RT）（建议配备合格的快速检测试剂，灰区。）第十八页，共96页。HIV抗体检测试剂有国家食品药品监督管理局注册批准文号试剂在有效期内酶联免疫试剂应批批检合格证件采购试剂选择敏感性和特异性高的试剂第十九页，共96页。HIV抗体筛查样品血清/血浆/全血滤纸干血斑唾液尿液第二十页，共96页。一般筛查方法酶联免疫吸附试验（ELISA）化学发光或免疫荧光试验：采用发光或荧光底物，用发光或荧光仪测定结果。快速检测（RT）及其它检测试验

(1)明胶颗粒凝集试验(PA)(2)免疫渗滤试验

(3)免疫层析试验第二十一页，共96页。(1)酶联免疫吸附试验（ELISA）HIV抗体检测试剂：检测HIV-1/2抗体HIV抗原抗体联合检测试剂：可同时检测血液中HIV-1P24抗原和HIV-1/2抗体用酶标仪测定结果第二十二页，共96页。四代艾滋病酶联免疫试剂比较solidphasespecificdetectionofconjugate第一代病毒裂解液HIV-1IgG抗体HIV-1-IgG抗体第二代病毒裂解液重组抗原合成肽HIV-1/-2IgG抗体HIV-1/-2IgG抗体第三代病毒裂解液重组抗原合成肽HIV-1/-2/-OIgM/IgG抗体HIV-1/-2/-O病毒裂解液重组抗原合成肽HIV-1/-2/-O第四代病毒裂解液重组抗原合成肽HIV-1/-2/-Oanti-p24AbIgM/IgG抗体HIV-1/-2/-Op24抗原病毒裂解液重组抗原合成肽HIV-1/-2/-Oanti-p24抗体第二十三页，共96页。ELISA酶联免疫吸附实验

ELISAHIV抗原包被平板病人抗体酶显色剂+ve-ve第二十四页，共96页。阴性对照阳性对照阴性阳性质控第二十五页，共96页。酶联免疫吸附试验（ELISA）优点：准确性高、价格低廉、判断结果标准客观、结果便于记录和保存用途：流行病学监测及临床大量标本的检测第二十六页，共96页。(2)化学发光或免疫荧光试验采用发光或荧光底物既可检测抗体，也可联合检测抗原抗体酶或荧光标记的HIV抗原或抗体，加发光或荧光底物用发光仪或荧光仪测定结果第二十七页，共96页。全血样品加50ul样品于样品垫中手指血方法静脉血方法加一滴缓冲液15分钟内读取结果（3）快速检测（RT）及其它检测试验第二十八页，共96页。快速检测（RT）及其它检测试验优点:试验简便快速，适用于应急检测、门诊急诊检测。不需专门设备和人员培训,一般可在10～30分钟内得出结果。缺点:肉眼判断较主观、价格较贵、结果不易保存。第二十九页，共96页。样品初筛试验一阴一阳均阳性反应报告阴性确证试验复检试验报告阴性均阴性反应阳性反应原有试剂＋另一不同原理（或厂家）试剂或另外两种不同原理（或厂家）试剂选用筛查试剂阴性反应HIV抗体筛查检测流程图第三十页，共96页。HIV抗体确证试验确证试验的试剂：必须是经国家食品药品监督管理局注册批准、在有效期内的试剂。确证样品：可采用血清、血浆、滤纸干血斑确证试验方法：免疫印迹试验(WB)、条带免疫试验(LIATEKHIVⅢ)、放射免疫沉淀试验(RIPA)及免疫荧光试验(IFA)。国内常用的确证试验方法是WB。第三十一页，共96页。HIV抗体确证实验结果a强阳性对照（HIV-1和HIV-2）b弱阳性对照（HIV-1）c阴性对照d典型的HIV-2血清阳性反应abcdgp160gp120p66p55p51gp41p39p31P24p17

血清对照HIV-2特异带第三十二页，共96页。初筛检测阳性标本两种筛查试剂报告阴性阴性反应一阴一阳阳性反应确证试剂复检试验根据具体情况进一步检测HIV-2报告阴性出现HIV-2指示条带阴性反应不确定反应报告HIV-1阳性HIV-1阳性反应结合流行病学资料，可以在4周后随访检测，如带型没有进展或呈阴性反应，则报告阴性；如随访期间出现阳性反应，则报告阳性；如随访期间带型有进展，但不满足阳性标准，应继续随访到8周。如带型没有进展或呈阴性反应则报告阴性；满足HIV抗体阳性诊断标准则报告阳性，不满足阳性判断标准可视情况决定是否继续随访。HIV抗体确证检测流程图第三十三页，共96页。实验室需备有：1～2种HIV-1/2抗体ELISA（化学发光）试剂2种HIV-1/2抗体快速试剂百度网每年进行体外诊断试剂评估如：“HIV抗体试剂临床评估”第三十四页，共96页。HIV抗体母亲HIV抗体经胎盘进入胎儿，出生时新生儿和婴儿早期抗体阳性，不一定是感染出生时母亲的抗体，80~90%在生后9~12个月消失，出生后18个月基本上全部消失18个月后儿童HIV抗体仍然阳性，视为自身感染产生的抗体18个月以下婴幼儿的HIV诊断第三十五页，共96页。婴幼儿HIV感染的抗体检测适用于：HIV感染产妇所生婴幼儿；母亲HIV感染状态不详，儿童出现HIV相关临床表现，临床怀疑HIV感染的儿童。婴儿12个月时进行HIV抗体检测

阴性排除感染，纳入正常儿童保健；

阳性者继续追踪随访，至18个月再次进行HIV抗体检测，结果阴性排除感染。第三十六页，共96页。艾滋病病毒感染产妇所生儿童阳阴用另一种不同原理或不同厂家生产的筛查试剂再次检测12个月进行HIV抗体筛查试验确证试验18个月时再进行HIV抗体筛查试验报告HIV抗体检测结果阴性艾滋病感染产妇所生儿童HIV抗体检测流程阳性阴性阴性阳性用另一种不同原理或不同厂家生产的筛查试剂再次检测阴性阴性阳性报告HIV抗体检测结果阳性提供咨询，继续随访，4周后再次进行确证试验不确定阳性第三十七页，共96页。18个月以下婴幼儿的HIV诊断核酸检测HIV前病毒DNA（HIVDNA）检测已整合到外周血液中血细胞基因组上的HIVDNA基于PCR技术高特异度(98%)和高灵敏度(>99%)第三十八页，共96页。18个月以下婴幼儿的HIV诊断HIV病毒载量（HIVRNA）用来监测已知的HIV感染病人的病毒载量试验；真阳性的结果通常>100,000拷贝/毫升,而假阳性结果<1,000拷贝/毫升RT-PCR、NASBA、CDNA、荧光定量PCR第三十九页，共96页。婴幼儿HIV感染的核酸检测可检测HIVRNA也可检测HIVDNA首选检测HIVDNAHIVDNA检测不受母亲围产期抗逆转录病毒治疗和人乳汁中抗逆转录病毒药物以及婴幼儿预防性抗逆转录病毒治疗的干扰考虑母亲血液污染因素，不推荐使用脐带血进行HIV核酸检测

。第四十页，共96页。婴儿的早期诊断

HIV感染母亲所生小于18个月龄的婴儿，不同时间的两次HIV核酸检测均为阳性即可作出诊断。18个月龄以上儿童诊断与成人相同：有急性HIV感染综合症或流行病学史，且不同时间的两次HIV核酸检测结果均为阳性，即可诊断。

第四十一页，共96页。HIV感染产妇所生婴儿婴儿满3个月，再次采集血标本，送检尽快采集第二份血标本，送检出生后6周采集第一份血标本（可制备成滤纸片干血斑（DBS），或EDTA抗凝全血），送检继续随访报告阳性产妇所生儿童HIV感染早期诊断检测流程呈阴性反应呈阳性反应呈阳性反应呈阴性反应呈阳性反应尽快再次采集血样，送检报告阴性呈阳性反应呈阴性反应呈阴性反应第四十二页，共96页。婴幼儿HIV感染的核酸检测需要注意：不同时间“婴儿HIV感染早期诊断”检测均呈阴性反应的喂哺母乳的儿童，应在完全停止喂哺母乳后的6周和3个月（若6周时检测结果为阳性可尽快）再次采血进行核酸定性检测。儿童满18个月后则可直接进行抗体检测。第四十三页，共96页。婴幼儿HIV感染的核酸检测方法

HIV-DNA1）RocheAmplicorHIV-1DNAPCR,version1.5试剂盒2）IN-HOUSE（国内开展，2009年检测技术规范）第四十四页，共96页。AmplicorHIV-1DNA简介样本：滤纸片干血斑、EDTA抗凝全血方法学：PCR-ELISA结果类型：定性靶物质：感染宿主细胞中的pro-viralHIV-1DNA第四十五页，共96页。滤纸片干血斑将全血滴在特定的滤纸片上制备。它主要应用于临床医学中新生儿先天性缺陷疾病的早期筛查。如：苯丙酮尿症，先天性甲状腺机能低下，维生素缺乏和一些感染性疾病的检测。

第四十六页，共96页。滤纸片干血斑用于婴儿HIV诊断样本量非常小，(20lto200l)特别适宜采集婴儿样本。容易收集: 指尖血、后跟血。能提取全血，血浆、血清。短期运输可在常温下长期可贮存在–20C样本可在常温下运输:不需要干冰DBS可作为一种无感染性材料运输（在美国）第四十七页，共96页。滤纸片的选择

Whatman903滤纸片（可用于HIV抗体、HIV前病毒DNA和HIVRNA检测）FTA标准卡滤纸片（可用于HIV前病毒DNA检测）第四十八页，共96页。采集样本所需要的材料血样本采集卡片(滤纸片)；可密封的塑料袋；湿度指示卡；干燥剂（1-2g/袋）；第四十九页，共96页。怎样采集末梢血DBS应用通用的安全防护措施；清晰准确地在卡片上标记识别码；完成针刺指尖程序；均一地使每个印圈饱和地吸附血液；

两个充分吸附血液的印圈比五个不完全吸附的印圈要好第五十页，共96页。第五十一页，共96页。第五十二页，共96页。第五十三页，共96页。怎样采集抗凝静脉血DBS静脉血充分与EDTA混合；最好采集后立即制备干血斑；血浆与血细胞分层的全血在制备干血斑前，应轻柔地上下颠倒采血管（避免血细胞破裂），使血液混匀后制备；第五十四页，共96页。用移液枪加代滤芯枪头移取75-80ul血液；枪头对准印圈的中心缓慢将血液滴于滤纸上；避免有气泡；第五十五页，共96页。怎样干燥DBS避免触摸或涂抹血斑；室温空气中水平干燥（至少4个小时）；避免阳光直晒；在干燥过程中不允许加热，叠加或将DBS接触其他表面；第五十六页，共96页。在包装前充分干燥DBS第五十七页，共96页。滤纸片干血斑的包装与运输将完全干燥的滤纸片干血斑样本用塑料袋进行独立包装，或者用秤量纸隔开，以避免样本之间的污染。已独立包装好的样本一起放入密封塑料袋中，加入几包干燥剂,加入湿度指示卡。将包装好的滤纸片干血斑，连同相应的文件（如采样/送样单等）放入大信封中。密封后可邮寄运输。第五十八页，共96页。放入密封袋第五十九页，共96页。加入干燥剂第六十页，共96页。加入湿度指示卡第六十一页，共96页。第六十二页，共96页。标记袋中内容物第六十三页，共96页。核酸检测2次检测阳性可早期诊断HIV感染，如果不具备条件，也可用HIV病毒载量法来代替，2次检测阳性也可诊断HIV感染，18个月龄以后再做抗体检测确认。

第六十四页，共96页。HIV核酸定量检测

通过SFDA审批的试剂盒、方法

NASBAEasyQAmplicorTaqmanbDNA340440M2000PG第六十五页，共96页。CD4+T淋巴细胞检测第六十六页，共96页。CD4+T淋巴细胞计数广泛应用于HIV感染者的临床管理中，协助判断感染者的预后、指导实施抗病毒治疗和疗效观察以及药物预防机会性感染等方面。第六十七页，共96页。CD4+T淋巴细胞检测对于免疫功能相对较好，CD4+T淋巴细胞计数>350/mm3的艾滋病感染孕产妇，采用预防性抗病毒用药方案；对于CD4+T淋巴细胞计数≤350/mm3的艾滋病感染孕产妇，采用治疗性抗病毒用药方案。第六十八页，共96页。常规CD4+T淋巴细胞检测的方法和程序

流式细胞仪检测方法双平台方法单平台方法样品：EDTA、枸橼酸（ACD）或肝素抗凝全血运送条件：室温（18～25℃）保存和运输样品避免极端温度（结冰或大于37℃）高温季节，需用隔热容器盛装样品，并将其置于有冰袋和吸热物质的容器中。第六十九页，共96页。常规CD4+T淋巴细胞检测的方法和程序48小时内染色，染色后6小时内分析；如采血后24小时内染色，可在染色后24小时内分析；利用CD45单克隆抗体设淋巴细胞门，可检测放置72小时的样品；在血球分析仪生产商允许的样品采集时间范围内检测。第七十页，共96页。FACSCalibur流式细胞仪第七十一页，共96页。二、梅毒检测技术显微镜检查法血清学检查法梅毒特异性抗原血清学检测梅毒非特异性抗原血清学检测第七十二页，共96页。各期梅毒的取材部位和检查方法临床表现取材部位检查方法一期梅毒溃疡、淋巴结暗视野检查血液血清学检查二期梅毒皮损、淋巴结暗视野检查血液血清学检查三期梅毒血液、脑脊液血清学检查隐性梅毒血液血清学检查胎传梅毒皮损、胎盘暗视野检查血液血清学检查第七十三页，共96页。（一)、显微镜检查法1.暗视野显微镜检查2.直接免疫荧光试验（DFA）3.渡银染色检查第七十四页，共96页。1.暗视野显微镜检查暗视野显微镜下，典型的梅毒螺旋体呈白色发光,其螺旋较密而均匀。运动规律，运动性较强，其运动方式包括①旋转式，围绕其长轴旋转；②蛇行式,全身弯曲如蛇行；③伸缩其螺旋间距离而移动。观察其运动形式有助于与其他螺旋体相鉴别。未检出螺旋体不能排除梅毒的诊断，阴性结果可能说明：①螺旋体数量不足(单次暗视野显微镜检查阳性率小于50%)。②患者已接受抗生素或杀灭梅毒螺旋体的药物治疗。③损害接近自然消退。④损害不是梅毒。第七十五页，共96页。2.直接免疫荧光试验（DFA)在荧光显微镜下可见到发苹果绿色的梅毒螺旋体。临床意义与暗视野显微镜检测相同。DFA的特异性及敏感性均大于暗视野显微镜检测。第七十六页，共96页。3.梅毒螺旋体渡银染色检查梅毒螺旋体具有亲银性，显微镜下可见到染成棕色的梅毒螺旋体。临床意义基本同暗视野显微镜检查法。第七十七页，共96页。(二)、血清学检查法血清学检查是辅助诊断梅毒的重要手段。当人体感染梅毒螺旋体后4～10周左右，血清中可产生一定数量的抗类脂质抗原的非特异性反应素（主要是IgM、IgG）和抗梅毒螺旋体抗原的特异性抗体（主要是IgM、IgG）。这些抗体均可用免疫学方法进行检测。第七十八页，共96页。梅毒血清学检测方法第七十九页，共96页。1.非梅毒螺旋体抗原血清试验1.1性病研究实验室试验（VenerealDiseaseResearchLaboratorytest，VDRL）1.2快速血浆反应素环状卡片试验（Rapidplasmareagincirclecardtest，RPR）1.3甲苯胺红试验（Toluidineredunheatedserumtest，TRUST）方法简便、快速，敏感性和特异性较好。对一期梅毒的敏感性为74％～87％，二期梅毒达100％，三期梅毒34％～94％。特异性96％～99％。第八十页，共96页。非梅毒螺旋体抗原血清试验临床意义适用于各期梅毒的诊断。早期梅毒经治疗后血清滴度可下降或转阴，故可用于疗效观察、判愈、判定复发或再感染。也适用于人群的筛查、产前检查及健康体检等。VDRL试验适用于神经梅毒的脑脊液检查,特异性高，但敏感性低。可在某些传染病及胶原病时出现假阳性反应，因此对阳性反应应结合临床进行鉴别，或做梅毒螺旋体抗原血清试验以进一步证实之。第八十一页，共96页。2.梅毒螺旋体抗原血清试验

采用梅毒螺旋体作抗原，为特异性抗原，检测血清中抗梅毒螺旋体IgG或IgM抗体。敏感性和特异性均较高。一期梅毒的敏感性为70％～100％，二期梅毒达100％，三期梅毒95％～98％，特异性94％～100％。第八十二页，共96页。梅毒螺旋体明胶颗粒凝集试验（TPPA）原理

TPPA试验用梅毒螺旋体致敏明胶颗粒，此致敏颗粒与人血清中的抗梅毒螺旋体抗体结合，产生可见的凝集反应。明胶颗粒为玫瑰红色，便于肉眼观察结果。第八十三页，共96页。梅毒螺旋体酶联免疫吸附试验（TP-ELISA）原理用经纯化及超声裂解处理的梅毒螺旋体为抗原包被固相板条加入待检血清和辣根过氧化酶标记的抗人IgG抗体，利用酶免疫法检测患者血清中的抗梅毒螺旋体特异性抗体。采用特异的梅毒螺旋体重组蛋白作为抗原，使试验更加敏感、特异。第八十四页，共96页。梅毒IgM抗体血清学试验梅毒特异性IgM抗体是梅毒感