宏基因组测序技术检测方法

宏因序术方

宏因测技检标简介：宏基因组测介绍宏基因学是以环境品中的生物群体基组为研对象，通过代基因组技手段包括功基因的选和测序分，对环中微生物多性、种结构、化关系、功活性、互协作关系及环境间的关系进研究的的微生研究方法。着高通测序技术的展，为基因组学研提供了的理想究方法。高量测序方法无需分环境中种微生物，无需构克隆文就可以直接环境中有微生物进测序。以真实客观反映环中微生的多样性、群结构进化关系等目前又以分为针对DNA/18sDNA/ITS测序和针对基因组全序的测序究。下面就对这两的具体绍。一、DNA/18sDNA/ITS测序16sDNA是最常用的微物物种分子定的标过对样品中测序可鉴定其中微物物种丰度和分布况。前，普使用454平台来环境样品进16sDNA序。因为DNA列比较似，读长短的话，以进行有效比对，454平台平均读在左右，以很好的避免类问题。二、宏基因全测序在这种序方式中，们可以定一个环境的所有生物就是一整体，然对其中所有微生物行测序。这我们就以研究样品的功能因以及在环境中所的作用不用关心其自哪个生物。可以现新的因，可进行基因的测，甚有可能得到个细菌因组的全序。此外该项测不单可以针平，也以针对全RNA进行因表达平的究。样品处：宏基因样品收集主有口腔下呼吸道痰，下呼道灌洗液，肤和粪。样品采遵照样品采规范（）所规定的作来进。尽量留足份样品

核酸提：宏基因核酸提取主有两种法：膜过滤和直接解提取。对液体样如痰液灌洗液两种法都适，对于固体品如粪宜采用直接解的方。核酸提后用NanoDropND-1000定260/280=1.8-2.0，260/230=1.8-2.0，电泳检DNA是完整一条。测序Sequencing1)16S/18S测序Sanger序：用于低量的16S/18S测序提宏基组后首通过PCR将16S/18S序列扩出来，再将连接到隆载体上，入感受细胞，涂平做蓝白筛选选阳性克提质粒质粒进测序反应测反应后化后ABI3130或3730进行毛管电泳序。由于其序准确率比高，而量非常低，通常用二代测序结的验证。454Platform454台主要括两种测序统：454FLX+System和454GSSystem454FLX+System序读长以达600-1000bp，通量450-700M，GSJuniorSystem测读长在400bp左，通量35M文库构：

用fusionPrimer扩增核体RNA，将已扩增的rRNA接做乳液PCR，GSFLX+和GS统上进测序。测序深：数据分：使用免的软件包对生物的群多样性进鉴定，进行比较。1.MEGAN：一个宏因组分析工，可以大量的测序据中对序结进行聚类分。2.MG-RAST：于注释基因组样品全自动件。3.IMG/M基于宏因组序列微物群体功能性。4.CAMERA：致力于生物生学研究。5.CARMA：可以通未拼接序列来进行种组成微生物的遗潜力的究。6.GALAXY：用于高真核生的研究，例昆虫等7.GreengenesrRNA数据库可以用来做rRNA的对。8.QIIME针对454序数据的宏因组分。9.TheRibosomeDatabase（RDP针对焦酸测序的分方法。Miseq：Miseq平台读可以是2X250bp2X300bp使用MiseqReagentKit可以产7.5-8.5Gb数据，用MiseqKit可以出13.2-15Gb的数据

文库构：根据感趣的片段设引物，过PCR增出片做为模板构文库。用NexteraXTSamplePrepKit构文库，照试剂盒说书操作将建好的文库归化处理并将混到一。在Miseq系统里动进行簇反应，进完成测序文库检：用Agilent2100检测文库大小段是否与预一致。库片段是否中。测序深：16S测序深应至少50,000条以上以保证好的覆盖度数据分：对微生生态进行定观察GreengenesrRNA因数据库和析工具宏基因分析工具：MEGAN核糖体据库计划(RDP)IonTorrentPlatform：Ion平台主要有个测序系统IonPGM和IonSystem。IonPGM有两种读，200bp，IonPGM主要应用三种片，

Ion314Chip316和IonChip最多数据产可以达2Gb。Ion长为200bp，最多据产出达到10Gb。文库构：使用PlusFragmentLibrary为rRNA扩增产物加上标签，一共以选择。上标签使用Ion™TemplateOT2200在OneTouch™DLSystem上进行乳液PCR完成文构建。序时根据需不同的读长择不同测序试剂盒测序深：对于人肠道微生物rRNA测，对于检测丰度的品，每个样至少要测10000条，而对检测低度的样品，需要1,000,000以的reads。2)宏基因组测Whole-metagenomicsSequencingRoche454platform:文库构：提取宏因组DNA，总量低于10ug且样品DNA应相完整使用GSFLXTitaniumLibraryPreparationKit构建文，按照明书进行相操作。文库检：DNA数与微的比例在左右，以达到较理想的测结果。测序深：每个样应至少保证条以的reads数。Hiseqplatform:Hiseq平台要有HiseqHiseq2500两个序系统。Hiseq2000测序读是2X100bpPaired-end测序，一次行通量达600Gb上，Hiseq2500两种运行式：快运行和高通，快速行可以达到2X150bp，产生最多180Gb的数据高通量长在2X125bp，数据产出在600Gb以上文库构：将提取宏基因组CovarisM220片段化后，使TruseqDNAXT/LT

SampleKit按照protocol进行文构建，DNA起始投入量应在上。文库检：将建好宏基因组文使用

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