细胞培养实验

一、基本目标了解细胞培养常规知识和无菌操作基本标准掌握贴壁细胞复苏方法；掌握镜下观察贴壁细胞生长状态方法了解细胞培养基础知识细胞培养实验第1页二、试验内容细胞复苏细胞观察细胞培养实验第2页三、试验材料及仪器1、材料：人肺癌细胞细胞培养基（RPMI1640液体培养基,10％胎牛血清,双抗100单位/ml）PBS

细胞培养耗材2、仪器：二氧化碳培养箱倒置显微镜生物安全柜液氮罐

离心机细胞培养实验第3页四、细胞复苏方法（1）从液氮中取出冷冻管，快速投入37～38℃水浴中，使其融化（1分钟左右）；（2）5分钟内用培养基稀释至原体积10倍以上；（3）低速离心10分钟；（4）去上清，加新鲜培养基培养刚复苏细胞。细胞培养实验第4页基本概念细胞系（Cellline）：原代培养物经首次传代成功后即为细胞系。细胞株（Cellstrain）：经过选择法或克隆法从原代培养物或细胞系中取得含有特殊性质或标志培养物称细胞株。细胞培养实验第5页有限细胞系（finitecellline）：细胞系形成后仅能维持有限传代次数，最终死亡。连续或无限细胞系（continuouscelllineorinfinitecellline）：含有没有限繁殖能力（取得不死性）和能重复进行传代细胞系。细胞培养实验第6页细胞培养优点可长时间监控、检测，定量评定一部分活细胞情况。研究条件可人为控制。研究样本能够到达比较均一性。研究内容便于观察、检测和统计。研究范围比较广泛。研究费用相对较经济。细胞培养实验第7页细胞培养缺点生存在人工培养环境中，即使模拟体内环境，但仍有很大差异。细胞培养实验第8页培养细胞形态学方面检测肉眼观察培养基颜色改变桃红色：正常情况橙黄色:细胞生长状态良好淡黄色:培养时间过长,营养不足,死亡细胞过多紫红色:细胞没有生长、生长状态不好、或已死亡细胞培养实验第9页相差显微镜观察活细胞细胞生长状态良好：透明度大，细胞内颗粒少，没有空泡，胞膜清楚。培养上清清澈透明，看不到悬浮细胞或碎片。细胞生长状态不良：胞质中常出现空泡、脂滴和颗粒物质，细胞形态可变得不规则，甚至失去原来特点。细胞培养实验第10页无菌操作技术（一）试验前准备依据试验要求，将所需物品及试剂灭菌消毒。清点所需用具，一并放入超净台内；细胞培养实验第11页（二）无菌室和操作野消毒

试验前，将试验器材放人超净台内，打开超净台紫外线灭菌灯，照射30分钟，关闭紫外线灯，同时起动超净台风机细胞培养实验第12页（三）无菌操作基本要求洗手、着装与外科临床要求相同；手指不能触及器材使用端；一切操作都要在火焰周围进行，瓶口要顺风斜放在支架上，试剂使用后马上封闭瓶口；细胞培养各用液要专管专用，并要勤换吸管瓶口液滴不能再进入瓶内；动作要准确灵敏，尽可能防止空气流动；在试验过程中，不要面向操作野讲话或咳嗽。细胞培养实验第13页（四）试验后要求关闭超净台风机和电源；用过玻璃器材投入清水中浸泡，包装纸叠卷，绳成束分类归放；最终用酒精纱布或棉球擦拭工作台面。细胞培养实验第14页细胞培养基本条件无菌条件细胞生长条件细胞检测条件细胞保留条件试验室安全细胞培养实验第15页细胞培养无菌环境

无菌室结构：普通由更衣间、缓冲间、操作间三部分组成。（使用前）紫外照射（1小时）每七天甲醛、乳酸、过氧乙酸熏蒸（2小时）和每个月新洁尔灭擦拭地面和墙壁一次方式进行消毒细胞培养实验第16页生物安全柜

使用前开启柜内紫外灯照射30分钟，预工作10－15分钟，以除去臭氧和使用工作台面空间呈净化状态。使用完成后，要用70%酒精将台面和台内四面擦拭洁净。还要定时用福尔马林熏蒸。细胞培养实验第17页细胞培养实验第18页火焰消毒在无菌环境进行培养时，首先关键点燃酒精灯。以后一切操作，如打开或封闭瓶口等，都需在火焰近处并经过烧灼进行。培养瓶滴管、试管、吸管细胞培养实验第19页细胞培养试验用具

细胞培养瓶

25平方厘米，正方斜颈25平方厘米，三角斜颈75平方厘米，正方斜颈75平方厘米，三角斜颈150平方厘米，正方斜颈

细胞培养实验第20页细胞培养板

6孔12孔24孔48孔96孔

细胞培养实验第21页细胞培养皿

35mm

60mm

100mm

细胞培养实验第22页冻存管

1.2ml2ml5ml细胞培养实验第23页离心管

15ml

50ml细胞刮细胞培养实验第24页滤器细胞培养实验第25页液氮罐细胞培养实验第26页细胞培养实验第27页细胞培养实验第28页细胞营养碳水化合物、氨基酸和脂类三大类也需要一定量无机盐、维生素和微量元素细胞培养实验第29页细胞培养液

水平衡盐溶液pH调整液消化液抗生素溶液培养基细胞培养实验第30页平衡盐溶液主要由无机盐和葡萄糖配制而成作用：维持渗透压、缓冲和调整酸碱度惯用缓冲液：生理盐水

PBSHanks液

（D-Hank‘s惯用于配制胰酶溶液）细胞培养实验第31页pH调整液(1)碳酸氢钠液(2)Hepes缓冲液是一个能够保持细胞培养过程中pH值较长时间稳定氢离子缓冲剂通常使用浓度为10～15mM细胞培养实验第32页

消化液胰蛋白酶溶液主要作用是使细胞间蛋白质水解，从而使贴壁细胞从瓶壁上脱落并使细胞游离分散开来惯用浓度为0.25%或5%胰蛋白酶。(2)EDTA溶液作用机制是破坏细胞间连接。对于一些贴壁尤其牢靠细胞，可用EDTA和胰酶混合液

EDTA溶液使用浓度为0.02%，配制时应加碱助溶(3)胶原酶溶液胶原酶在上皮类细胞原代培养时经常使用，胶原酶作用对象是胶原组织，所以不轻易对细胞产生损伤。细胞培养实验第33页抗生素溶液通常是青霉素和链霉素联合使用，俗称“双抗溶液”。青霉素主要是对革兰阳性菌有效，链霉素主要对革兰阴性菌有效。加入这两种抗生素可预防绝大多数细菌污染。

培养基内青霉素、链霉素最终使用浓度为每毫升100单位。庆大霉素：每毫升100单位细胞培养实验第34页培养基分天然培养基和合成培养基天然培养基：血清血浆组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）

细胞培养实验第35页合成培养基

依据细胞生存所需物质种类和数量，用人工方法模拟合成。包含四大类物质：无机盐、氨基酸、维生素、碳水化合物当前惯用培养基：RPMI-1640、DMEM、MEM另有没有血清培养基、无蛋白培养基细胞培养实验第36页牛血清胎牛血清应取自剖腹产胎牛新牛血清取自出生24小时之内新生牛小牛血清取自出生10－30天小牛使用浓度：普通为5－20％，最惯用是10％

细胞培养实验第37页无机盐CaCl2

、KCl、MgSO4、

NaCl、NaHCO3

、NaH2PO4对调整细胞渗透压、一些酶活性及溶液酸碱度都是必须。细胞培养实验第38页氨基酸

缬氨酸、亮、异亮、苏、赖、色、苯丙、蛋、组、酪、精氨酸、胱氨酸(L型)细胞用以合成蛋白质必需原料，不能由其它氨基酸或糖类转化合成谷氨酰胺含有特殊作用，补加一定量谷氨酰胺。L-谷氨酰胺降解造成氨形成，而氨对于一些细胞含有毒性。细胞培养实验第39页真核细胞

培养、冻存、计数试验（下）指导老师：巩丽云

杨一生物化学和分子生物学教研室医学院712细胞培养实验第40页传代将细胞从一个培养瓶转移到另一个培养瓶即称为传代培养原代培养细胞在生长、繁殖一定时间后，因为空间不足或细胞密度过大造成营养枯竭，会影响细胞生长，所以需要进行扩大培养，即传代或称为传代培养。

HepG2细胞

细胞种类：人肝肿瘤细胞；

培养天数：传代培养2天；

细胞状态与特征简述：呈多角型、不规则贴壁生长，成团聚集。

细胞培养实验第41页传代注意事项接种数量为5×104～8×105个/ml

传代密度太低，细胞轻易死亡，表现出细胞在到达增加前有较长滞留期。培养液因为pH下降而展现黄色，表明细胞已经到达最大密度需要换液或进行传代培养。假如是单层贴壁细胞，等长满培养瓶表面，即可进行传代。细胞培养实验第42页体外培养细胞分型

细胞培养实验第43页贴附型大多数培养细胞贴附生长，属于贴壁依赖性细胞，大致分成以下四型：成纤维细胞上皮型细胞游走细胞型多型细胞型细胞培养实验第44页1、成纤维细胞型

名称：凡在培养中形态与成纤维细胞类似起源：由中胚层间充质组织起源组织如：真正成纤维细胞，心肌，平滑肌，成骨细胞，血管内皮形态：胞体梭形或不规则三角形，胞质向外伸出2—3个长短不等突起，中有卵圆形核生长特点：排列成放射状，漩涡状细胞—细胞接触易断开而单独行动，游离单独成纤维样细胞，常有几个伸长细胞突起细胞培养实验第45页成纤维细胞细胞培养实验第46页

HUVECs人脐静脉内皮细胞

1.细胞种类：人脐静脉内皮细胞；

2.培养天数：4d；原代培养；

3.放大倍速：倒置显微镜X20；

4.培养基种类：DMEM+15％胎牛血清；

5.细胞状态与特征简述：细胞呈梭形，扁平形或多角形，贴壁生长。

骨髓间充质干细胞

1.细胞种类：人骨髓间充质干细胞原代；

2.培养天数：7天；

3.放大倍数：200倍，倒置显微镜；

4.培养基种类：DF12+10％FBS；

5.细胞状态与特征简述：使用percoll密度梯度离心法分离人骨髓细胞。首次换液48h，这是7天后骨髓间充质干细胞扩增情况。

细胞培养实验第47页2、上皮型细胞名称：仅形态上似体内，实际上不完全相同起源：起源于外胚层、内胚层细胞,如：皮肤及其衍生物,消化道，乳腺，肺泡,上皮性肿瘤形态：类似体内上皮细胞扁平，不规则多角形，中有圆形核生长特点：易相连成片，相靠—紧密相连—成薄层—铺石状

生长时呈膜状移动，极少脱离细胞群而单个活动细胞培养实验第48页上皮型细胞细胞培养实验第49页SKOv3（卵巢癌细胞）

1.细胞种类：SKOv3（卵巢癌细胞）2.培养天数：传代后3d；

3.放大倍速：倒置显微镜X10；

4.培养基种类：DMEM+5%胎牛血清；

5.细胞状态与特征简述：细胞贴壁生长，生长速度较快。

CCL-149

1.细胞种类：大鼠肺泡上皮细胞；

2.培养天数：1d（种在48孔板中）；

3.放大倍速：倒置显微镜X20；

4.培养基种类：F12K+10%胎牛血清；

5.细胞状态与特征简述：细胞呈梭形，透亮贴壁生长，3－4天传代一次，Giemsa染色。

细胞培养实验第50页3、游走细胞型：呈散在生长，普通不连成片，胞质常突起，呈活跃游走或变形运动，方向不规则。此型细胞不稳定，有时难以和其它细胞相区分。

CNE1

1.细胞种类：高分化鼻咽癌细胞系；

2.培养天数：3d；

3.放大倍速：相差100；

4.培养基种类：PMI1640+10%CS；

5.细胞状态与特征简述：贴壁细胞，梭型成团生长。细胞培养实验第51页4、多型细胞型有一些细胞，如神经细胞难以确定其规律和稳定形态，可统归于这类。

SD大鼠神经元原代

1.细胞种类：脑皮质细胞；

2.培养天数：4-5天；

3.放大倍速：电镜0；

4.培养基种类：DMEM+10%小牛血清+10%马血清；

5.细胞状态与特征简述：贴壁细胞，有多量轴突和树突。

细胞培养实验第52页悬浮型概念：培养时不贴附于底物而呈悬浮状态生长起源：自血，脾或骨髓，尤以血中白细胞癌肿细胞特点：在悬浮中生长良好细胞圆形，单个或小细胞团优点：生存空间大，提供数量大，传代方便(不需消化)，

易于收获，可取得稳定状态缺点：观察不方便，很多细胞不能悬浮生长(尤以正常细胞)细胞培养实验第53页HL-60分化细胞Giemsa染色1.细胞种类：HL-60；

2.培养天数：ATRA1微摩尔作用5天；

3.放大倍速：倒置显微镜X10；

4.培养基种类：1640+8％胎牛血清；

5.细胞状态与特征简述：悬浮细胞，分化细胞核浆百分比减小，核仁降低或消失，胞核呈杆状或分叶状。细胞培养实验第54页

KU812

1.细胞种类：人嗜碱细胞性白血病细胞系；

2.培养天数：5d；

3.放大倍速：倒置显微镜X20；

4.培养基种类：RPMI1640+10%新生牛血清；

5.细胞状态与特征简述：细胞呈圆形，悬浮生长。

细胞培养实验第55页

HeLa细胞

1.细胞种类：人HeLa细胞传代培养；

2.培养天数：7d；

3.放大倍速：倒置显微镜X200；

4.培养基种类：DMEM+10%小牛血清；

5.细胞状态与特征简述：细胞呈多角形，贴壁生长。细胞培养实验第56页

K562细胞

1.细胞种类：K562（人慢性红白血病细胞株）；

2.培养天数：传代后2天；

3.放大倍数：倒置显微镜X10；

4.培养基种类：RPMI1640+10%胎牛血清，4mMGlutamine；

5.细胞状态与特征介绍：悬浮生长，少数贴壁，喜爱成团悬浮。细胞培养实验第57页

每代贴壁细胞生长过程游离期贴壁期潜伏期对数生长久停顿期（平台期）细胞培养实验第58页游离期

悬浮，胞质回缩，全部细胞变为圆球形。吸附期

贴附底物，普通24小时内贴壁。潜伏期

此时细胞有生长活动，基本无增殖。细胞株潜伏期普通为6～24小时。对数生长久

细胞数随时间改变成倍增加，活力最正确，最适合进行试验研究。停顿期（平台期）

细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂机制：接触抑制、密度依赖性细胞培养实验第59页细胞培养污染和检测细胞污染种类细菌、酵母菌、霉菌和病毒污染源无菌操作技术不妥操作室环境不佳污染之血清污染之细胞

细胞培养实验第60页

细菌培养液被洋葱佰克霍尔德菌污染了。洋葱佰克霍尔德菌（Burkholderiacepacia）原属假单胞菌属，是植物病原菌。细胞培养实验第61页白色念珠菌污染

细胞培养实验第62页真菌感染

细胞培养实验第63页支原体污染电镜照片,煎蛋状和其它形状细胞培养实验第64页荧光染色法(33258)显示染色体，细胞周围亮点为支原体细胞培养实验第65页Giemsa染色法，附于胞质上黑点为支原体细胞培养实验第66页扫描电镜法显示支原体，附于细胞表面众多圆形颗粒为支原体细胞培养实验第67页依据细胞生长恃点，传代方法有3种：1．悬浮生长细胞传代离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。2．半悬浮生长细胞传代（Hela细胞）