禽病实验室诊疗专家讲座

禽病诊疗河南农业职业学院动物科学系闫民朝TEL病实验室诊疗专家讲座第1页试验室诊疗一、血清学试验(一)凝集试验

1.直接凝集试验凝集反应即细菌、红细胞(Hb)等颗粒性抗原与对应抗体在电解质参加下,抗原颗粒相互凝集形成团块,这种现象称为凝集反应。参加反应抗体称为凝集素,抗原称凝集原。常有平板法、试管法、玻片法及微量凝集法等。

禽病实验室诊疗专家讲座第2页(1)平板凝集试验取洁净玻板一块,用蜡笔按试验要求划成数个方格,并注明待检血样号码;用生理盐水倍比稀释血清,加入抗原,用牙签(或火柴棍之类)自血清量最少(血清稀释度最高)一格起,将血清与抗原混匀,注意抗原用前摇匀,并置室内,使其温度达20℃以上。混合完成用酒精灯稍微加温,使达30℃左右,5~8min内统计结果。禽病实验室诊疗专家讲座第3页按以下标准统计反应强度：＋＋＋＋:出现大凝集块,液体完全透明。＋＋＋:有显著凝集片,液体几乎完全透明,即75%凝集。＋＋:有可见凝集片,液体不甚透明,即50%凝集。＋:液体混浊,有小颗粒状物,即25%凝集。－:液体均匀混浊,即不凝集。该法为一个定量方法,惯用于检测待检血清中对应抗体及其效价。如普通以＋＋以上血清最高稀释度为该血清凝集价。也用定性作为禽病阳性判定,帮助临床诊疗及流行病学调查。注意：每次试验须用标准阳性血清和阴性血清作对照。禽病实验室诊疗专家讲座第4页(2)试管凝集试验既可用已知抗原(细菌混悬液)检测待检血清,又可用阳性血清检测待检抗原。①每份血清用4支试管,另取3支对照管。②用0.5%石炭酸生理盐水将被检血清稀释成四个稀释度。第5管中不加血清,设为抗原对照。第6管中加1:25稀释阳性血清0.5ml个阳性血清对照。第7管中加1:25稀释阴性血清0.5ml作为阴性对照。③各管中加入用0.5%石炭酸生理盐水稀释20倍抗原0.5ml,并充分混匀。④放入37℃下作用4~10h,取出后放室温18~24h观察并统计结果。禽病实验室诊疗专家讲座第5页试管凝集试验操作示意表

单位:ml管号1234567最终血清稀释度1:251:501:1001:200抗原对照阳性对照1:25阴性对照1:250.5%石炭酸生理盐水2.30.50.50.50.5--

}

}

}

}弃去0.50.20.50.50.5-0.50.5被检血清抗原(1:20)0.50.50.50.50.50.50.5弃去1.5放入37℃温箱中作用4~10h,取出后放室温18~24h观察并统计结果弃去1.5禽病实验室诊疗专家讲座第6页(3)玻片凝集法又称快速凝集反应,为一个定性试验,惯用于鸡白痢诊疗及流行病学调查中,也用于鸡传染性鼻炎,鸡慢性呼吸道病(霉形体病)等诊疗。现以鸡白痢玻片凝集试验为例进行示范说明：用滴管吸收标准诊疗液(即鸡白痢凝集标准抗原)一滴(约0.05毫升)滴在洁净玻片或洁净普通玻璃上。刺破鸡冠或翅静脉或剪一鸡冠齿,采血一滴(约0.04毫升),使之与诊疗液混匀,可用牙签或火柴棍搅匀,或稍微靠在桌边缘摇动玻片,频频变动玻板水平位置,使混合均匀。禽病实验室诊疗专家讲座第7页如在1~3min内细菌和红细胞从混合液滴边缘开始逐步凝集成较大颗粒,呈片状、团块状,将红细胞凝集成许多小区,液体几乎完全透明,外观是花斑状,则判为阳性反应;如在2~3min之内不出现凝集现象,而且玻板上混合液均保持原来状态,或者中间部分较浓,四面较稀薄混悬物,则可判为阴性反应。该反应温度条件在室温20~30℃进行。禽病实验室诊疗专家讲座第8页类似还可用血清进行快速凝集反应,其方法为选取洁净玻片或载玻片,下面衬以黑色展板,在玻片上滴一滴血清或相当凝集价稀释血清,再滴一滴鸡白痢凝集标准抗原(诊疗液)混合均匀,几分钟后观察凝集成块情况,判定阴阳反应。如阴性反应,则混和液保持一致混浊红色。禽病实验室诊疗专家讲座第9页(4)微量凝集法该方法原理均同试管凝集法,只是操作在微量滴定板(反应板)上进行,抗原、抗体用量极少,故称微量凝集试验,即用数根稀释棒并排在Ｕ型或Ｖ型微量滴定板上揉搓,将待测血清作系列倍比稀释,随即滴加抗原振荡混合,置37℃温箱或温室内一定时间(12~24h),判定结果方法同平板法。禽病实验室诊疗专家讲座第10页2.间接凝集试验即将颗粒性抗原(或抗体)吸附于与免疫无关小颗粒(载体)表面,此吸附抗原(或抗体)载体颗粒与对应抗体(或抗原)结合,在有电解质存在适宜条件下发生凝集现象。亦称被动凝集试验,惯用载体有动物红细胞,聚苯乙稀乳胶活性炭等,吸附抗原后颗粒称为致敏颗粒。禽病实验室诊疗专家讲座第11页现将最惯用间接血凝试验介绍以下：间接血凝试验是以红细胞为载体,将抗体(或抗原)吸附在红细胞表面,用来检测微量抗原(或抗体),吸附有抗体(或抗原)红细胞也称致敏红细胞。间接血凝试验当前多采取微量法,可选取Ｕ型或Ｖ型微量反应板,将待检血清在血凝板试验用反应板上用稀释棒或定量移液管作倍比稀释,再加等量致敏红细胞悬液,振荡混匀后,置于一定温度数小时或于25~30℃放置过夜,观察凝集程度。以出现50％凝集血清最大稀释度为该血清血凝价。试验应设以下对照:①致敏红细胞加稀释液空白对照;②已知阳性血清对照;③已知阴性血清对照;④未致敏红细胞加阳性血清对照。

禽病实验室诊疗专家讲座第12页(二)免疫琼脂扩散试验(AGP)

抗原与对应抗体在含有电解质琼脂凝胶中会自由扩散,形成肉眼可见沉淀带称为免疫琼脂扩散试验(沉淀试验)。可用已知抗原沉淀未知抗体,也可用已知抗体测定未知抗原,特异性强,可用于禽流感(AI)、禽霍乱、鸡白痢、马立克(MD)、传染性法氏囊炎(IBD)、传染性支气管炎(IB)、传染性鼻炎(IC)、传染性脑脊髓炎(AE)、病毒性关节炎(REO)、鸡包涵体肝炎(IBH)等诊疗。禽病实验室诊疗专家讲座第13页1.琼脂制备方法

琼脂凝胶中含1%优质琼脂粉、0.1%石炭酸、8%NaCl,水浴加热至全溶,分装于三角瓶中,于4℃条件下冷藏备用。用前将其置入沸水浴中融化,待温度下降至50~60℃时倒入培养皿中(或玻片上),厚度为3~5mm。然后打孔(孔直径4mm,孔距3~4mm)。结束后在火焰上轻轻烘烤(封底),即可加样。禽病实验室诊疗专家讲座第14页2.操作方法：用已知抗原测定血清抗体时,中央孔加入已知抗原,1、4孔加阳性血清对照,2、3、5、6孔加待检血清;用已知阳性血清测未知抗原时,中央孔加已知阳性血清,1、4孔加已知抗原对照,2、3、5、6孔加待检抗原材料(加满即可,不可外溢)。然后加盖,置于37℃恒温箱中反应24~48h后观察。禽病实验室诊疗专家讲座第15页3.结果判定：阳性者在两孔之间会出现一条肉眼可见沉淀带。阴性者无此现象出现。1.抗原抗体分子量相同,浓度也相同。2.抗原分子量小扩散系数大浓度相同。3.抗体分子量小。4.分子量相同,但抗原浓度高。5.抗原分子量高且浓度高。6.抗原浓度高,抗体分子量小。禽病实验室诊疗专家讲座第16页(三)血凝(HA)和血凝抑制试验(HI)1.原理正副粘病毒科病毒(如ND、AI、IB、EDS-76等)可凝集红细胞,而特异性抗体可抑制这种凝集,即凝集抑制。禽病实验室诊疗专家讲座第17页2.HA操作方法:①1~12孔先加50μLpH为7.20.01mol/LPBS液或生理盐水;②第1孔中加入50μL抗原(如ND病毒)振荡混匀;③逐层稀释至第11孔时弃去50μL,第12孔不加抗原,做为红细胞对照;④1~12孔各加0.5%鸡红细胞悬液50μL,振荡15~30s,使其混匀,静置于37℃作用20~40min观察结果;⑤待对照孔中红细胞全部沉入孔底中间,即可判定各孔红细胞凝集情况,以病毒最大稀释度孔出现100%凝集现象者为这个病毒凝集价,即一个血凝单位。禽病实验室诊疗专家讲座第18页禽病实验室诊疗专家讲座第19页HA试验操作示意表

单位:μl孔号123456789101112抗原稀释倍数

Hb对照稀释液505050505050505050505050抗原5050505050505050505050振荡片刻,使其混匀0.5%红细胞505050505050505050505050振荡15~30s,37℃作用20~40min判定举例++++++++----弃去50禽病实验室诊疗专家讲座第20页3.HI操作方法:①1~11孔先加25μL稀释液;②1孔中加入25μL待检血清(或已知阳性血清);③逐层稀释至第10孔时弃去,第11孔不加血清,为阴性对照第12孔不加血清和抗原,为红细胞对照;④1~11孔各加25μL4单位抗原,振荡30秒,37℃作用20min;⑤1~12孔各加0.5%红细胞悬液,振荡1min,37℃作用20~30min观察结果;⑥待第11抗原对照孔红细胞均匀铺在管壁上(100%凝集)时,检验孔中完全不凝集为该血清血凝抑制价。禽病实验室诊疗专家讲座第21页禽病实验室诊疗专家讲座第22页HI试验操作示意表

单位:μl孔号123456789101112血清稀释倍数

抗原对照Hb对照稀释液252525252525252525252550

弃去25被检血清252525252525252525254单位抗原2525252525252525252525振荡30s,37℃作用20min0.5%红细胞252525252525252525252525振荡1min,37℃作用20~40min判定举例------+++++-禽病实验室诊疗专家讲座第23页4.HA和HI试验应用①用于AI、ND、IB、EDS-76等病毒判定这些病毒都能使家禽红细胞发生凝集,然后用特定抗体来抑制,若出现凝集抑制则可确定是该种病毒。禽病实验室诊疗专家讲座第24页②HI试验可用于发病禽群诊疗

比如用ND疫苗免疫过鸡群中,ND抗体水平为7~8lg2,最高不超出10lg2,其群体中抗体水平呈正态分布,10lg2以上仅占10%以下,4lg2以下仅占1%。而被ND强毒感染并发病鸡群中,HI抗体可高达11~13lg2,而且鸡群中抗体水平不呈正态分布,10lg2以上占25%,4lg2以下占10~30%。同时结合其它诊疗方法以确诊。禽病实验室诊疗专家讲座第25页③能够进行抗体检测

可检测家禽血清抗体或卵黄抗体(母源抗体),对禽群免疫状态进行评价,以指导免疫。首次进行ND免疫时,母源抗体(半衰期为5d)水平应在3lg2时进行,以后再免时应在4~5lg2之间时进行,过高时则会产生免疫干扰,过低则易发病。禽病实验室诊疗专家讲座第26页④可检测抗体效价

可检测高免血清或高免卵黄抗体效价,从而对其进行质量评价。高免血清或高免卵黄抗体效价在9lg2以上时,才可用于传染病紧急预防或发病早期治疗。禽病实验室诊疗专家讲座第27页(四)红细胞吸附和红细胞吸附抑制试验又称红血球吸附和红血球吸附抑制试验。一些病毒如鸡痘病毒、正、副粘病毒等,在培养细胞内增殖后,可使培养细胞吸附一些动物红细胞,而且只有感染细胞表面吸附红细胞,不感染细胞不吸附红细胞,所以能够作为这种病毒增殖衡量指数。红细胞吸附现象也可被特异抗血清所抑制,故可作病毒判定方法,尤其对一些不产生细胞病理改变病毒,不失为一个快速有效判定方法。禽病实验室诊疗专家讲座第28页操作方法：细胞经培养长成单层后,常规接种病毒,经一定时间培养,弃培养液,加0.4~0.5%已洗涤红细胞悬液,置室温(18~20℃)作用一刻钟(一些病毒置4℃或37℃);加少许生理盐水,轻轻洗涤,去未吸附红细胞,放在低倍显微镜下观察。如红细胞粘附于单层细胞中感染细胞表面,病毒大量增殖时,可见整个单层细胞粘满红细胞,则均判为阳性。进行抑制试验时,用Hank's液将经病毒接种培养后培养液洗涤2次,然后加入1:10稀释抗血清,室温或37℃30分钟后,弃血清,加入红细胞悬液,如上进行红细胞吸附试验,镜检红细胞吸附强度,与对摄影比,完全抑制为阳性。禽病实验室诊疗专家讲座第29页附：Hank’s(汉克斯氏)液：原液甲1:NaCl160g,MgSO4·7H2O2g,KCl8g,MgCl2·6H2O2g,按次序加入到800ml双蒸溜水中,一物溶解后再加另一物。原液甲2:CaCl22.8g溶于100ml双蒸溜水中。以上两液混合,加双蒸溜水达1000ml,加2ml氯仿防腐,保留于5℃。原液乙1:Na2HPO4·12H2O3.04g葡萄糖20gKH2PO41.20g按次序加入到800ml双蒸溜水中。原液乙2:0.4%酚红液100ml(0.4%酚红液将是0.4g酚红置乳钵中,边研磨边涂加入0.1NNaOH11.8ml;酚红应完全溶解,置于100ml量杯中,最终加双蒸水至100ml)。将酚红液与葡萄糖等混合液混合,加双蒸溜水至1000ml,加入2ml氯仿防腐,保留于5℃。按以下方法配成汉克斯氏液:原液甲1份,原液乙1份,双蒸溜水18份,此液在5℃下可存1个月。使用前以1.4%NaHCO3(9磅10min灭菌过),无菌操作,校正pH到7.4(依需要定),大约每20mlHank's液加0.5mlNaHCO3可达pH7.4,此时颜色为黄红色。禽病实验室诊疗专家讲座第30页(五)补体结合试验可溶性抗原,如蛋白质、多糖、类脂类、病毒等,与对应抗体结合后,其抗原抗体复合物可结合补体(是球蛋白,主要是r球蛋白),但这一反应肉眼无法观察到,而经过加入溶血系统作指示系统,包含绵羊红细胞、溶血素和补体,经过观察是否出现溶血,来判断反应系统是否存在对应抗原抗体,该过程称补体结合试验。参加补体结合抗体称补体结合抗体。

注意在预备试验及正式试验中,均需已知强阳性血清、弱阳性血清和阴性血清供滴定补体、滴定抗原或作对照用。禽病实验室诊疗专家讲座第31页(六)病毒中和试验中和试验在家禽病毒病诊疗工作中,惯用于用已知病毒来检验未知血清,也可用已知血清来判定未知病毒,还可用于中和抗体效价测定,其原理：病毒(抗原)与对应抗体中和以后,可知病毒丧失感染力,该反应含有高度种、型特异性,而且一定量病毒必须有对应量中和抗体才能被中和。禽病实验室诊疗专家讲座第32页(七)免疫标识技术利用一些能够经过某种理化原因易于检测物质标识抗体,这些被标识抗体与对应抗原相结合,经过对标识物测定,从而确定抗原存在部分和定量。该技术当前广泛应用主要有：免疫荧光技术、同位素标识技术(即放免沉淀)和免疫酶标技术(包含ELISA)等等。禽病实验室诊疗专家讲座第33页二、病原学检验1.病料采集

应从发病早期比较经典病例中采集,通常在有显著病变不一样器官和不一样部位采取,如发生AI时气管粘膜、肺、脑等组织,高热期血液。禽病实验室诊疗专家讲座第34页2.病料涂(抹)片镜检

用有显著病变不一样器官、不一样部位涂(抹)数片,固定染色后镜检。可对含有特征形态病原微生物或虫卵作出诊疗。禽病实验室诊疗专家讲座第35页3.病料处理每克组织中加入5~10ml灭菌生理盐水研磨(若为病毒性病料,可于每ml研磨液中加青、链霉素各1000IU),之后于4℃下作用2~4h,或37℃下作用1h,然后以1500转/min离心15min,取上清液作为接种、培养材料。禽病实验室诊疗专家讲座第36页4.病原培养和判定

细菌、真菌、螺旋体等可用人工培养基培养。而病毒因为没有完整酶系统,不能在无生命培养基中生长,可用禽胚、动物或组织进行培养。病原培养后,依据其形态学特征、培养特征、动物接种试验及免疫血清学试验等方法作出判定。禽病实验室诊疗专家讲座第37页5.动物接种试验

选择对该种传染病病原体最敏感SPF动物进行人工感染试验。将病料用适当方法进行人工接种,然后依据对不一样动物致病力、发病后症状和病理改变特点来诊疗。禽病实验室诊疗专家讲座第38页家禽寄生虫病诊疗诊疗方法有：流行病学、临床症状、剖检改变、试验室检验等。要确诊必须找到病原。如虫体、卵囊、虫卵、或虫体片段等。禽病实验室诊疗专家讲座第39页一、蠕虫病诊疗1.虫体检验：

大虫体可直接用肉眼在粪便中观察,较小虫体,可用水洗沉淀法检验：将粪便少许置于一大平皿内,加适量水并搅拌均匀,静置5分钟,虫体将下沉(密度较大),将上层粪渣弃去。重复3~4次,每次沉淀5分钟,在最终含虫体粪渣中查找虫体,较小虫体也可涂片镜检。禽病实验室诊疗专家讲座第40页2.虫卵检验(1)水沉淀法用于吸虫虫卵(密度大)。取约5g粪便置于100ml大小烧杯内,加10倍量水,用玻棒搅拌均匀后,用双层纱布过滤到另一烧杯内,再倒入试管内,将滤液静置约15min,弃去上清液,保留沉渣,加水混匀。重复2~3次。吸收试管底部沉渣,涂片盖上盖片后置于低倍镜下镜检。为节约时间,可将上述滤液注入