普通微生物学医学知识专家讲座

第一节微生物生长测定微生物生长概念及常规测定方法（原理和操作）第二节细菌群体生长繁殖细菌生长繁殖规律（标准生长曲线）及控制技术（连续培养概念和方法）各种常见物理、化学原因对微生物生长影响第三节微生物生长繁殖控制普通微生物学医学知识专家讲座第1页生长：繁殖：细胞物质有规律地、不可逆地增加，造成细胞体积扩大生物学过程。微生物生长到一定阶段因为细胞结构复制与重建并经过特定方式产生新生命个体，即引发生命个体数量增加生物学过程。参见P132普通微生物学医学知识专家讲座第2页生长是一个逐步发生量变过程，繁殖是一个产生新生命个体质变过程。在高等生物里这两个过程能够显著分开，但在低等尤其是在单细胞生物里，因为个体微小，这两个过程是紧密联络又极难划分过程。参见P132普通微生物学医学知识专家讲座第3页一个微生物细胞适当外界条件，吸收营养物质，进行代谢假如同化作用速度超出了异化作用个体生长原生质总量（重量、体积、大小）就不停增加假如各细胞组分是按恰当百分比生长时，则到达一定程度后就会发生繁殖，引发个体数目标增加群体内各个个体深入生长群体生长普通微生物学医学知识专家讲座第4页个体生长个体繁殖群体生长群体生长=个体生长+个体繁殖微生物生长：在一定时间和条件下，细胞数量增加（微生物群体生长）在微生物学中提到“生长”，普通均指群体生长，这一点与研究大生物时有所不一样。普通微生物学医学知识专家讲座第5页大肠杆菌一个细胞重约10-12克，平均20分钟繁殖一代24小时后：4722366500万亿个后代，重量到达：4722吨48小时后：2.2×1043个后代，重量到达2.2×1025吨相当于4000个地球重量一头500kg食用公牛，24小时生产0.5kg蛋白质，而一样重量酵母菌，以质量较次糖液（如糖蜜）和氨水为原料，24小时能够生产50000kg优质蛋白质。普通微生物学医学知识专家讲座第6页第一节微生物生长测定微生物生长概念及常规测定方法（原理和操作）普通微生物学医学知识专家讲座第7页微生物生长：单位时间内微生物数量或生物量（Biomass）改变微生物生长测定个体计数生物量测定重量测定生理指标测定评价培养条件、营养物质等对微生物生长影响；评价不一样抗菌物质对对微生物产生抑制（或杀死）作用效果；客观地反应微生物生长规律；参见P151普通微生物学医学知识专家讲座第8页一、计数法参见P152通惯用来测定样品中所含细菌、孢子、酵母菌等单细胞微生物数量。1、培养平板计数法对样品进行适当稀释单个微生物在适宜固体培养基表面或内部生长、繁殖肉眼可见菌落对菌落数目计数推测样品中微生物细胞数普通微生物学医学知识专家讲座第9页普通微生物学医学知识专家讲座第10页因为无法确保细菌细胞在分离过程中彻底分开，所以，一个菌落可能是多个细胞一起形成，所以在科研中普通用菌落形成单位（colonyformingunits，CFU）来表示，而不是直接表示为细胞数（个）。菌落形成单位（colonyformingunits，CFU）：

采取菌落计数时，因为不能绝对确保一个菌落只是由一个活细胞形成，计算出活细胞数称为CFU。CFU并不完全等同于样品中活菌数。普通微生物学医学知识专家讲座第11页普通微生物学医学知识专家讲座第12页普通微生物学医学知识专家讲座第13页普通微生物学医学知识专家讲座第14页采取培养平板计数法要求操作熟练、准确，不然难以得到正确结果；样品充分混匀；每支移液管及涂布棒只能接触一个稀释度菌液；同一稀释度三个以上重复，取平均值；每个平板上菌落数目适当，便于准确计数；普通微生物学医学知识专家讲座第15页普通微生物学医学知识专家讲座第16页普通微生物学医学知识专家讲座第17页2、膜过滤培养法怎样对菌数低样品，如水，中细菌数量进行计数？菌数低样品膜过滤培养菌落计数参见P153普通微生物学医学知识专家讲座第18页水中细菌总数：124cfu/100ml普通微生物学医学知识专家讲座第19页普通微生物学医学知识专家讲座第20页3、显微镜直接计数法利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物数量。参见P152普通微生物学医学知识专家讲座第21页1）常规方法缺点：

不能区分死菌与活菌；

不适于对运动细菌计数；

需要相对较高细菌浓度；

个体小细菌在显微镜下难以观察。普通微生物学医学知识专家讲座第22页2）其它方法百分比计数:已知浓度样品（如血液）+待测浓度样品；显微镜下依据二者之间百分比直接推算待测微生物细胞浓度。过滤计数:菌数低样品（如水）膜过滤对细菌进行荧光染色荧光显微镜计数活菌计数:采取特定染色技术对活菌和死菌分别计数普通微生物学医学知识专家讲座第23页二、生物量测定1、比浊法在一定波长下，测定菌悬液光密度，以光密度（opticaldensity，即O.D.）表示菌量。测量时应控制在菌浓度与光密度成正比范围内，不然不准确。参见P153普通微生物学医学知识专家讲座第24页2、重量法以干重、湿重直接衡量微生物群体生物量；经过样品中蛋白质、核酸测定间接推算微

生物群体生物量。测定多细胞及丝状真菌生长情况有效方法参见P153普通微生物学医学知识专家讲座第25页3、生理指标法参见P154生理指标：呼吸强度耗氧量酶活性生物热等，与其群体规模成正相关普通微生物学医学知识专家讲座第26页第二节细菌群体生长繁殖细菌生长繁殖规律（标准生长曲线）及控制技术（连续培养概念和方法）参见P134普通微生物学医学知识专家讲座第27页微生物特点：个体微小除真菌外，我们肉眼看到或接触到微生物已不是单个，而是成千上万个单个微生物组成群体。微生物接种是群体接种，接种后生长是群体繁殖生长对细菌群体生长规律了解是对其进行研究与利用基础参见P134普通微生物学医学知识专家讲座第28页一、生长规律在微生物学中提到“生长”，均指群体生长。生长曲线（growthcurve）：细菌接种到定量液体培养基（封闭系统）中，定时取样测定细胞数量，以时间为横座标，以菌数为纵座标作图，得到一条反应细菌在整个培养期间菌数改变规律曲线普通微生物学医学知识专家讲座第29页普通微生物学医学知识专家讲座第30页细菌生长曲线普通以菌数对数为纵坐标作图普通微生物学医学知识专家讲座第31页普通微生物学医学知识专家讲座第32页普通微生物学医学知识专家讲座第33页1、迟缓期将少许菌种接入新鲜培养基后，在开始一段时间内菌数不马上增加或增加极少，生长速度几近于零，也称延迟期、适应期普通微生物学医学知识专家讲座第34页迟缓期细胞特点：细胞形态变大或增加，比如巨大芽孢杆菌，在迟缓期末细胞平均长度比刚接种时长6倍。通常处于迟缓期细菌细胞最大。细胞内RNA，尤其是rRNA含量高，合成代谢活跃。核糖体、酶类和ATP合成加紧，易产生诱导酶。对外界不良条件反应敏感。分裂迟缓，代谢活跃以上特征说明，细胞处于活跃生长中，只是分裂迟缓。在此阶段后期，少数细胞开始分裂，曲线略有上升。普通微生物学医学知识专家讲座第35页迟缓期出现原因：调整代谢微生物接种到一个新环境，暂时缺乏能量和必需生长因子，“种子”老化（即处于非对数生长久）或未充分活化，接种时造成损伤等。调整代谢需要一段适应期。迟缓期长短与菌种遗传性、菌龄及移种前后所处环境等原因相关，有只需几分钟，有需要几小时。普通微生物学医学知识专家讲座第36页在生产实践中缩短迟缓期惯用伎俩：经过遗传学方法改变菌种遗传特征利用对数生长久细胞作为“种子”尽可能使接种前后所使用培养基组成不要相差太大适当扩大接种量普通微生物学医学知识专家讲座第37页2、对数生长久也称指数生长久（exponentialphase）普通微生物学医学知识专家讲座第38页代时（generationtime）：在细菌个体生长里，每个细菌分裂繁殖一代所需时间，通常以G表示。倍增时间（doublingtime）：在群体生长里细菌数量增加一倍所需时间。参见P137

t－t0

G=－－－－－－－－－

3.322（lgNt

－lgN0)普通微生物学医学知识专家讲座第39页普通微生物学医学知识专家讲座第40页影响微生物代时原因：1）菌种，不一样微生物及同一微生物不一样菌株代时不一样；2）营养成份，在营养丰富培养基中生长代时短；3）营养物浓度，在一定范围内，生长速率与营养物浓度成正比；4）温度，在一定范围内，生长速率与温度成正相关；普通微生物学医学知识专家讲座第41页在一定范围内，生长速率与温度成正相关参见P149普通微生物学医学知识专家讲座第42页不一样微生物有不一样最适生长温度范围普通微生物学医学知识专家讲座第43页3、稳定生长久又称恒定时或最高生长久，此时培养液中活菌数量最高并维持稳定。营养物质消耗、代谢产物累积和pH等环境改变环境条件逐步不适于细菌生长细菌生长速率降低直至零（细菌分裂增加数量等于细菌死亡数量）普通微生物学医学知识专家讲座第44页对数期到稳定时转变是细胞主要分化调整阶段：1）开始储存糖原等内含物2）形成芽孢或建立自然感受态（芽孢杆菌）3）发酵过程积累代谢产物主要阶段

一些放线菌抗生素大量形成也在此期普通微生物学医学知识专家讲座第45页稳定时长短与菌种和外界环境条件相关生产上延长稳定时方法：

补充营养物质（补料）或取走代谢产物

调整pH、调整温度

对好氧菌进行通气、搅拌或振荡取得更多菌体物质或代谢产物普通微生物学医学知识专家讲座第46页营养物质耗尽或有毒代谢产物大量积累，细菌死亡速率超出新生速率，整个群体展现出负增加。

死亡细菌以对数方式增加，但因为部分细菌产生抗性也会使细菌死亡速率降低，在衰亡期后期仍会有部分活菌存在。4、衰亡期（decline或deathphase）普通微生物学医学知识专家讲座第47页衰亡期特点：细菌代谢活性降低；细菌衰老并出现自溶；产生或释放出一些产物，如氨基酸、抗生素、外肽酶等；菌体细胞也展现各种形态，有时出现畸形，细胞大小悬殊。有些革兰阳性菌此时染色呈革兰阴性。普通微生物学医学知识专家讲座第48页不一样微生物或同一个微生物对不一样物质利用能力是不一样。有物质可直接被利用（如葡萄糖或NH4+等）；有需要经过一定适应期后才能取得利用能力（如乳糖或NO3-等）。前者通常称为速效碳源（或氮源），后者称为迟效碳源（或氮源）。当培养基中同时含有这两种碳源（或氮源）时，微生物生长过程中会形成二次生长现象。普通微生物学医学知识专家讲座第49页普通微生物学医学知识专家讲座第50页普通微生物学医学知识专家讲座第51页普通微生物学医学知识专家讲座第52页普通微生物学医学知识专家讲座第53页普通微生物学医学知识专家讲座第54页二、同时培养理想试验材料：群体细胞能处于同一生长阶段，同时进行分裂生长。同时生长同时培养（synchronousculture）：使群体中细胞进行同时生长培养技术经过同时培养方法取得细胞称为同时细胞或同时培养物参见P138普通微生物学医学知识专家讲座第55页机械法环境条件控制技术离心法过滤分离法硝酸纤维素滤膜法温度培养基成份控制其它（如光照和黑暗交替培养）同时培养物：一个理想材料生理与遗传特征研究工业发酵种子普通微生物学医学知识专家讲座第56页因为细胞个体差异，同时生长往往只能维持2-3个世代，随即又逐步演变为随机生长。普通微生物学医学知识专家讲座第57页三、连续培养将微生物置于一定体积培养基中，经过培养生长，最终一次收获。分批培养（batchculture）或封闭培养（closedculture）培养基一次加入，不予补充，不再更换。迟缓期、对数期稳定时、衰亡期连续培养（continuousculture）在微生物整个培养期间，经过一定方式使微生物能以恒定比生长速率生长并能连续生长下去一个培养方法。在培养过程中不停地补充营养物质和以一样速率移出培养物是实现微生物连续培养基本标准。普通微生物学医学知识专家讲座第58页控制连续培养方法恒浊器连续培养恒化器连续培养不停调整流速，使培养液浊度保持恒定保持恒定流速普通微生物学医学知识专家讲座第59页（一）恒浊器连续培养测定所培养微生物光密度值自动调整新鲜培养基流入和培养物流出培养室速率使培养物维持在某一恒定浊度当培养室中浊度超出预期数值时，流速加紧，使浊度降低；当培养室中浊度低于预期数值时，流速减慢，使浊度上升；恒浊器培养工作精度是由光电控制系统灵敏度来决定假如所用培养基中有过量必需营养物，就能够使菌体维持最高生长速率。普通微生物学医学知识专家讲座第60页普通用于菌体以及菌体生长平行代谢产物生产发酵工业（连续发酵）连续发酵与单批发酵相比优点：缩短发酵周期，提升设备利用率；便于自动控制；降低动力消耗及体力劳动强度；产品质量较稳定；缺点：杂菌污染和菌种退化普通微生物学医学知识专家讲座第61页（二）恒化器连续培养使培养液流速保持不变，并使微生物一直在低于其最高生长速率下生长进行繁殖。普通微生物学医学知识专家讲座第62页恒化器连续培养中，必须将某种必需营养物质控制在较低浓度，以限制生长速度，而其它营养物质均过量。细菌生长速率取决于限制性因子浓度，并低于最高生长速率。限制性因子必须是机体生长必不可少营养物质，如氨基酸、铵盐等氮源，或是葡萄糖、麦芽糖等碳源，或者是无机盐、生长因子等物质。因而可在一定浓度范围内决定该机体生长速率。普通微生物学医学知识专家讲座第63页经过控制流速能够得到生长速率不一样但浓度基本恒定培养物主要用于：科研遗传学：突变株分离生理学：不一样条件下代谢改变生态学：模拟自然营养条件建立试验模型普通微生物学医学知识专家讲座第64页第三节微生物生长繁殖控制各种常见物理、化学原因对微生物生长控制（原理和方法）普通微生物学医学知识专家讲座第65页抑制（inhibition）：生长停顿，但不死亡；死亡（death）：生长能力不可逆丧失；防腐（antisepsis）：预防或抑制霉腐微生物在食品等物质上生长；消毒（disinfection）：杀死或灭活病原微生物（营养体细胞）；灭菌（sterilization）：杀死包含芽孢在内全部微生物；化疗（chemotherapy）：杀死或抑制宿主体内病原微生物或病变细胞；参见P160普通微生物学医学知识专家讲座第66页控制微生物生长速率或毁灭不需要微生物，在实际应用中含有主要意义。普通微生物学医学知识专家讲座第67页理化因子是抑菌还是杀菌作用相关原因：理化因子强度或浓度同一浓度理化因子作用时间长短不一样种类微生物同一个微生物不一样生长时期参见P154普通微生物学医学知识专家讲座第68页一、控制微生物化学物质抗微生物剂抗代谢物抗生素控制微生物化学物质普通微生物学医学知识专家讲座第69页1、抗微生物剂一类能够杀死微生物或抑制微生物生长化学物质抗微生物剂（antimicrobialagent）生物合成天然产物人工合成化合物普通微生物学医学知识专家讲座第70页化学物质抗微生物能力测定液体培养法平板培养法最低抑制浓度（minimuminhibitoryconcentration，MIC）试验抑菌环/圈（zoneofinhibition）试验普通微生物学医学知识专家讲座第71页普通微生物学医学知识专家讲座第72页杀菌？抑菌？化学物质抗微生物能力测定液体培养法平板培养法经过这两种方法无法区分抗微生物剂作用效果普通微生物学医学知识专家讲座第73页待测化学物质对数生长培养物定时测定总菌数和活菌数抑菌剂（bacteriostaticagent）杀菌剂（batericide）溶菌剂（bacteriolysis）普通微生物学医学知识专家讲座第74页抗微生物剂消毒剂（disinfectant）防腐剂（antiseptics）普通微生物学医学知识专家讲座第75页防腐剂与消毒剂特点：对一切活细胞都有毒性，不能用于人或动物体内化学治疗。消毒剂：可杀死微生物，通惯用于非生物材料灭菌或消毒。防腐剂：可杀死微生物或抑制其生长，但对于动物或人体组织

无毒害作用，可作为外用抗微生物药品。普通微生物学医学知识专家讲座第76页使微生物蛋白质凝固变性,如酒精等；

破坏菌体酶系统,如过氧化氢等；

增加细胞膜通透性,使细胞发生破裂或溶解.

如来苏儿等酚类物质。作用机理：普通微生物学医学知识专家讲座第77页

消毒剂广泛用于一些热敏感或无法进行高温灭菌物品或场所灭菌。温度计、带透镜仪器设备、聚乙烯管或导管等；墙壁、楼板、仪器设备等表面和自来水；空气防腐剂通常作为人体外用具！普通微生物学医学知识专家讲座第78页普通微生物学医学知识专家讲座第79页各种抗微生物剂杀菌能力比较标准：石炭酸系数=待测制剂最高稀释度到达同效石炭酸最高稀释度在临床上最早使用消毒剂——石炭酸普通要求：处理时间为10分钟，供试菌为Salmonellatyphi（伤寒沙门菌）因为各种抗微生物剂杀菌机制各不相同，故石炭酸系数仅有一定参考价值。普通微生物学医学知识专家讲座第80页2、抗代谢物（antimetabolite）一类化合物：与必需代谢物含有相同结构

可和特定酶结合

妨碍酶功效

干扰代谢正常进行叶酸反抗物（磺胺）、嘌呤反抗物（6-巯基嘌呤）苯丙氨酸反抗物（对氟苯丙氨酸）、尿嘧啶反抗物（5-FU）胸腺嘧啶反抗物（5-溴胸腺嘧啶）普通微生物学医学知识专家讲座第81页磺胺药品是最早发觉，也是最常见化学治疗剂，抗菌谱广，能治疗各种感染性疾病。大多数革兰氏阳性细菌（如肺炎链球菌、溶血性

链球菌等）一些革兰氏阴性细菌（如痢疾杆菌、流感杆菌等）对放线菌也有一定作用普通微生物学医学知识专家讲座第82页1934年，德国I.G.Farben染料厂G.Domagk一个红色染料（prontosil），白鼠静脉注射，可治疗链球菌感染，但在体外无作用。1935年，深入证实protosil对人链球菌感染也有效。1935年除，Domagk唯一女儿因伤口感染濒于死亡，在绝望中Domagk将还未经过临床试验prontosil注射到女儿体内，结果挽回了女儿生命。法国人Trefuel和英国人Fuller证实：

在体内prontosil转化成了含有抑菌作用磺胺。普通微生物学医学知识专家讲座第83页作用机理：磺胺是叶酸组成部分对氨基苯甲酸结构类似物很多细菌需要自己合成叶酸才能生长磺胺对人体细胞无毒性，因为人缺乏从对氨基苯甲酸合成叶酸相关酶——二氢叶酸合成酶，不能用外界对氨基苯甲酸合成叶酸，必须直接利用叶酸作为生长因子进行生长。普通微生物学医学知识专家讲座第84页普通微生物学医学知识专家讲座第85页普通微生物学医学知识专家讲座第86页3、抗生素（antibiotic）普通微生物学医学知识专家讲座第87页抗生素：一些生物合成或半合成一类次级代谢产物或衍生物，它们在很低浓度时就能抑制或影响它种生物生命活动，如杀死微生物或抑制其生长。自上世纪40年代以来，已找到上万种新抗生素，合成了近10万种半合成抗生素，但其中在临床上惯用仅有几十种。普通微生物学医学知识专家讲座第88页1）作用机制：抑制细菌细胞壁合成

破坏细胞质膜

作用于呼吸链以干扰氧化磷酸化

抑制蛋白质和核酸合成抑制微生物生长或杀死它们普通微生物学医学知识专家讲座第89页普通微生物学医学知识专家讲座第90页普通微生物学医学知识专家讲座第91页普通微生物学医学知识专家讲座第92页普通微生物学医学知识专家讲座第93页普通微生物学医学知识专家讲座第94页青霉素青霉素β-内酰胺环结构与D-丙氨酸末端结构相同，从而能占据丙氨酸位置与转肽酶结合，并将酶灭活，肽链之间无法相互连接，抑制了细胞壁合成。普通微生物学医学知识专家讲座第95页因为不一样微生物之间细胞化学结构和代谢差异，不一样抗生素抗菌谱各异。普通微生物学医学知识专家讲座第96页2）细菌抗药性产生普通微生物学医学知识专家讲座第97页抗性菌株特点：细胞质膜透性改变，使抗生素不能进入细胞或进入后被细胞主动排出；药品作用靶改变；合成了修饰抗生素酶；抗性菌株发生遗传变异，造成合成新多聚体，以取代或部分取代原来多聚体；普通微生物学医学知识专家讲座第98页一、控制微生物物理原因杀死或抑制微生物物理原因温度辐射作用过滤渗透压干燥超声波普通微生物学医学知识专家讲座第99页1、温度当温度超出微生物生长最高温度或低于生长最低温度都会对微生物产生杀灭作用或抑制作用。普通微生物学医学知识专家