细菌分离培养接种技术和生化专家讲座

第三章临床细菌学检验技术

第二节细菌分离培养与判定P35

细菌在适宜条件下方可生长繁殖，临床细菌标本只有经过细菌分离培养判定和药敏试验，才能对感染性疾病作出病原学诊疗和指导临床用药。故细菌分离培养对疾病预防与诊治有主要作用。细菌分离培养接种技术和生化专家讲座第1页一、培养基种类和选择

(一)基本条件1.合格细菌试验室2.合格无菌试验室3.基本设备和器具细菌分离培养接种技术和生化专家讲座第2页(二)培养基培养基(culturemedium)是由人工方法配制而成，专供微生物生长繁殖使用混合营养物制品。用途：①可用于细菌分离纯化、传代和菌种保留②可用于研究细菌生理生化特征③是对病原菌分离判定主要步骤和必不可少伎俩细菌分离培养接种技术和生化专家讲座第3页1.培养基组成成份：⑴营养物质：水、蛋白胨、肉浸液、牛肉膏、糖醇类、血液、无机盐、鸡蛋和动物血清、生长因子（Vit、aa、嘌呤、嘧啶等）。细菌分离培养接种技术和生化专家讲座第4页⑵凝固物质：

最惯用为琼脂(agar)，它是从石花菜中提出来一个半乳糖胶，100℃溶解，40℃凝固，可利用琼脂来改变培养基物理性状(固体或半固体)，它是理想固体培养基赋形剂，其本身不被细菌分解利用，也无营养作用。细菌分离培养接种技术和生化专家讲座第5页⑶抑菌剂和指示剂：不是细菌生长繁殖必需物质，是制备细菌选择、判别培养基和判断结果需要。

惯用抑菌剂有：胆盐、煌绿、亚硫酸钠、亚硒酸钠及一些染料和一些抗生素等。

惯用指示剂有：酚红、中性红、甲基红、溴甲酚紫、溴麝香草酚蓝、中国兰等酸碱指示剂，美兰为惯用氧化还原指示剂。细菌分离培养接种技术和生化专家讲座第6页2.培养基分类液体培养基：牛肉汤

(牛肉浸液+1%蛋白胨

+0.5%NaClpH7.4)半固体培养基：加0.2~0.5%agar固体培养基：营养物+2%agar

按物理性状细菌分离培养接种技术和生化专家讲座第7页基础培养基：是其它培养基基础，如普通肉汤、

普通琼脂平板、斜面、高层营养培养基：BAP、罗-琴培养基、吕氏血清斜面选择培养基：SS平板、BS平板、Mac平板等判别培养基：糖发酵管、MIU、KIA、TSI等特殊培养基：厌氧培养基、高渗培养基等按用途细菌分离培养接种技术和生化专家讲座第8页3.惯用培养基制备⑴肉膏汤制备：

0.3%牛肉浸膏+1%蛋白胨+0.5%NaCl加热溶解，调pH7.4~7.6，分装，121℃，20分钟高压灭菌冷后待用。可用于标本和细菌增菌。⑵普通琼脂平板、斜面、高层：

肉膏汤+2%agar，加热溶解，121℃，20分钟高压灭菌冷至50℃

平皿→普通琼脂平板：分离纯培养和药敏倾倒

试管(斜放)→普通琼脂斜面：增菌、保留细菌试管(直立)→普通琼脂高层：备用

细菌分离培养接种技术和生化专家讲座第9页⑶血琼脂平板：普通琼脂平板营养物质灭菌冷至50℃+5%~10%脱纤维SRbc或RRbc，摇匀，倾倒无菌平皿，冷凝后即成血平板。惯用于营养要求较高细菌分离纯培养和药敏。⑷半固体肉汤：牛肉汤(牛肉浸膏汤)+0.2%~0.5%agar→加热溶化→分装→高压灭菌→冷却即成。惯用于保留菌种和观察细菌动力。细菌分离培养接种技术和生化专家讲座第10页4.选择适当培养基：依据临床标本中细菌需要，选择适当培养基。细菌分离培养接种技术和生化专家讲座第11页二、分离培养（一）细菌分离1.平板划线分离法——分离纯培养

①分区划线

②连续划线2.斜面接种法连续蜿蜒划线，从斜面底部至斜面顶端3.液体接种法在试管内壁与液面交接处管壁上研磨，使细菌混于液体中。4.半固体接种法穿刺接种法细菌分离培养接种技术和生化专家讲座第12页倾注平板法取一定量稀释标本加入无菌平皿，再加入冷至45℃左右定量培养基，混匀，待凝后倒置培养。6.涂布法把稀释定量被检菌液均匀涂布于琼脂平板表面。7.定量接种环法把定量接种环沾取菌液均匀涂布于琼脂平板表面。细菌分离培养接种技术和生化专家讲座第13页(二)细菌培养方法

依据临床初步诊疗及待检细菌种类，可选取不一样环境条件进行培养，惯用培养方法有：1.需氧培养：适合用于需氧菌和兼性厌氧菌，在有氧环境下35℃孵育18~24h。2.CO2培养：适用5%~10%CO2环境才生长良好细菌，如脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、布鲁菌首次分离培养。供给CO2方法有：CO2培养箱、烛缸法、化学法(每升容积0.4gNaHCO3+0.35ml浓HCl)。3.厌氧培养法：适合用于厌氧菌分离培养，惯用方法有厌氧罐法、气袋法和厌氧手套箱法等。细菌分离培养接种技术和生化专家讲座第14页细菌分离培养接种技术和生化专家讲座第15页(三)细菌生长情况在平板上——呈菌落(colony)生长，惯用于细菌分离纯培养在斜面上——呈菌苔或菌落生长，可用于增菌或保存菌种。半固体中——呈迁徙生长(有动力)。可用于观察动力和保种。在液体中——呈表面生长，均匀混浊生长和沉淀生长。可用于增菌和判别细菌。细菌分离培养接种技术和生化专家讲座第16页思索题细菌有哪些分离培养与接种技术？简述细菌在不一样培养基中生长情况及实际意义？细菌分离培养接种技术和生化专家讲座第17页三、生化反应

因为不一样种类细菌酶系统不一样，故其新陈代谢过程中合成代谢产物（毒素）与分解代谢产物（生化反应）也不一样，借此可判别细菌。

生化反应：不一样菌体内含有不一样独特酶系统，故对各底物(糖、蛋白等)分解产物也不一样，用此方法来判别细菌叫生化反应。细菌分离培养接种技术和生化专家讲座第18页（一）碳水化合物代谢试验1.糖(醇、苷)类发酵试验

产酸(+)：丙酮酸、乳酸、甲酸等原理：细菌糖类

产酸产气⊕：CO2、H2

不分解：(-)

因为不一样细菌菌体内酶系统不一样，可分解单糖（葡萄糖）,双糖（乳糖），多糖（淀粉）和醇类（甘露醇），糖苷（水杨苷），代谢产物也不一样，可借此来判别细菌。酶细菌分离培养接种技术和生化专家讲座第19页培养基：肉膏汤+1%待试糖+指示剂→溶化调pH7.4±

→分装→高压灭菌冷后待用。

有液体、半固体、固体或微量生化管几个类型。方法：把分纯细菌→1%糖(醇、苷)类培养基，35℃

18~24h→观察结果。产酸产气：如大肠埃希菌→GS→结果+产酸不产气：如伤寒b、痢疾b→GS→+-培养基不变色：如卡他莫拉菌应用：是判别细菌最主要和最基本试验，尤其是肠杆菌科判定主要试验。⊕⊕细菌分离培养接种技术和生化专家讲座第20页2.氧化-发酵试验(O/F试验)原理：

分解GS—氧化型细菌，如微球菌、绿脓b

细菌

分解GS—发酵型细菌，如葡萄c、肠杆菌科

不分解GS—产碱型细菌，如莫拉莫拉菌培养基：HL培养基(蛋白胨2g、NaCl5g、GS10g、agar2.5g、K2HPO4·12H2O0.3g、0.2%溴麝香草酚兰12ml、加蒸馏水至1000ml，调pH7.2）碱性时为绿色，酸性时为黄色。方法：将待测菌同时穿刺接种两支HL培养基，其中一支滴加无菌液体石蜡(高度不少于1cm)，35℃培养48h。有O2有O2或无O2细菌分离培养接种技术和生化专家讲座第21页结果：应用：检测细菌代谢类型，进而判别细菌。如肠杆菌科细菌为发酵型，而非发酵菌为氧化型或产碱型。也可用于葡萄球菌(发酵型)和微球菌(氧化型)区分。注意事项：①对营养要求高细菌应在HL培养基中加入2%血清或0.1%酵母浸膏。②阴性者要延长培养时间3~4天再观察结果。③指示剂不能用酒精溶解。液体石蜡细菌分离培养接种技术和生化专家讲座第22页3.β-半乳糖苷酶(ONPG)试验原理：ONPG

邻-硝基酚

+

β-D-半乳糖试剂：0.75MONPG溶液，为无色，若出现黄色，则不应再用。方法：从KIA斜面上刮取菌苔，加入0.25ml无菌NS制成菌悬液，加入1滴甲苯充分振摇，使β-半乳糖苷酶释放，置37℃水浴5分钟，加入0.25mlONPG试剂，水浴(35~37℃)20min~3h，观察结果。结果：菌悬液展现黄色为阳性。β-半乳糖苷酶水解细菌分离培养接种技术和生化专家讲座第23页应用：

本试验主要用于迟缓发酵乳糖菌株快速判定。

迟缓分解乳糖细菌(宋内志贺菌等)只有β-半乳糖苷酶(胞内酶)，缺乏半乳糖苷渗透酶(胞外酶)或活性很低，故需几天才能将乳糖分解，若采取ONPG试验则可快速(20~30min)得出结果。

因为ONPG与乳糖十分相同，且分子较小，它不需半乳糖苷渗透酶则可进入细胞内，而被细胞内β-半乳糖苷酶分解为半乳糖和黄色邻-硝基酚。

ONPG试验结果不一定与分解乳糖相一致，这主要取决于细菌产生酶及其活性。若无ONPG，可采取5%乳糖代替，同时降低蛋白胨含量。细菌分离培养接种技术和生化专家讲座第24页4.七叶苷水解试验原理：七叶苷(esculin)+H2O七叶素+GS七叶素+Fe2+(培养基中)黑色化合物培养基：

七叶苷培养基、胆汁七叶苷培养基。方法：

把待测菌接种于七叶苷培养基，35~37℃，18~24h。结果：

培养基变黑为阳性，不变色为阴性。应用：

主要用于肠球菌(+)与其它链球菌(-)判别。也可用于革兰阴性杆菌(-)和厌氧菌(+)判别。细菌细菌分离培养接种技术和生化专家讲座第25页5.甲基红试验(methylredtest)原理：GS丙酮酸→乳酸、甲酸、乙酸，pH↓

本试验以甲基红为指示剂，所以：当pH﹥5.4时呈黄色，为阴性当pH﹤4.5时呈红色，为阳性当pH在4.5~5.4时呈桔红色，为弱阳性培养基：葡萄糖蛋白胨水方法：将待测菌接种于上述培养基中，35℃2~4天，加入甲基

红指示剂，马上观察结果。应用：用于判别大肠埃希菌(+)和产气肠杆菌(-)，其它肠杆菌科中沙门菌属、志贺菌属、枸橼酸杆菌属、变形杆菌属均为阳性，而肠杆菌属和哈夫尼亚属均为阴性。产气杆菌细菌分离培养接种技术和生化专家讲座第26页6.V-P试验(Voges-Proskauertest)原理：细菌→GS→丙酮酸乙酰甲基甲醇+CO2乙酰甲基甲醇

丁二酮(二乙酰)丁二酮+胍基(培养基中精氨酸中含有胍基)→红色化合物培养基：葡萄糖蛋白胨水方法：将待测菌接种于上述培养基中，35℃48h后，加入甲液(6%α-萘酚酒精溶液)和乙液(40%KOH)，振摇。结果：在数分钟内出现红色者为阳性，若无红色出现且置于35℃4h后仍如故者为阴性。应用：本试验与甲基红试验往往同时使用，普通前者为阳性，后者为阴性。脱羧-2HKOH细菌分离培养接种技术和生化专家讲座第27页(二)蛋白质和氨基酸代谢试验1.明胶液化试验：原理：一些细菌半固体明胶氨基酸变成流动液体。方法：待测菌穿刺接种于明胶培养基，22℃7天，观察结果。35℃中明胶自动液化，若在35℃培养，观察前先置于4℃中30分钟后，再看结果。结果：培养基呈液化状态为阳性。应用：肠杆菌科细菌判别。Eg：沙雷菌，普通变形杆菌，奇异变形杆菌，阴沟杆菌；一些厌氧菌如产气荚膜梭菌、脆弱类杆菌；多数假单胞菌也能液化明胶。明胶酶(胞外酶)分解细菌分离培养接种技术和生化专家讲座第28页2.吲哚试验(IndoleTest)原理：

色氨酸吲哚+丙酮酸

吲哚+吲哚试剂(对二甲氨基苯甲醛)→玫瑰吲哚培养基：蛋白胨水方法：将待测菌接种于上述培养基中，35℃24~48h，加入吲哚试剂，观察结果结果：于二者液面交界处出现红色为阳性，不变色为阴性。应用：主要用于肠杆菌科细菌判别，如大肠埃希菌为(+)，产气肠杆菌(-)。色氨酸酶一些细菌细菌分离培养接种技术和生化专家讲座第29页3.硫化氢试验原理：一些细菌能分解培养基中含硫氨基酸产生H2S，当它与培养基中Fe2+或铅离子相遇时，则形成黑褐色FeS或PbS沉淀。此试验可间接用于检测是否产生H2S。培养基：醋酸铁(铅)培养基。方法：将待测菌接种于醋酸铁(铅)培养基中，

35℃培养1~2天，观察结果。结果：培养基变黑为阳性，不变色为阴性。应用：主要用于肠杆菌科中细菌属和种判别。沙门菌属、爱德华菌属、亚利桑那菌属、枸橼酸杆菌属，绝大多数为阳性，其它菌属为阴性。细菌分离培养接种技术和生化专家讲座第30页4.尿素分解试验原理：一些细菌含有尿素酶，使尿素分解产生大量氨，

使培养基呈碱性(酚红为指示剂)，培养基变红。培养基：尿素培养基方法：

将待测菌接种于上述培养基中，35℃培养18~24h，观察结果。结果：培养基变红为阳性，不变色为阴性。应用：主要用于变形杆菌属判定，另外雷氏普罗威登菌和莫根菌也为阳性。细菌分离培养接种技术和生化专家讲座第31页5.苯丙氨酸脱氨酶试验原理：一些细菌可产生苯丙氨酸脱氨酶，使苯丙氨酸脱去氨基，形成苯丙酮酸，加入FeCl3试剂后呈绿色反应。培养基：苯丙氨酸琼脂培养基方法：将待测菌接种于上述斜面培养基中，35℃培养18~24h，滴加3滴FeCl3试剂，自上流下，马上观察结果。若延长时间观察会引发褪色。结果：出现绿色为阳性。应用：主要用于肠杆菌科细菌判定。变形杆菌、摩根摩根菌为阳性。细菌分离培养接种技术和生化专家讲座第32页6.氨基酸脱羧酶试验原理：氨基酸

胺+CO2，胺使培养基变碱，指示剂则变色。培养基：氨基酸脱羧酶和氨基酸对照培养基。方法：将待测菌接种于上述培养基中，35℃1~4天，观察结果。结果：对照管呈黄色，测定管呈紫色(溴甲酚紫为指示剂)为阳性，若测定管也为黄色则为阴性。若对照管呈紫色则试验毫无价值。应用：主要用于肠杆菌科细菌判定。沙门菌属中除伤寒和鸡沙门菌外，均阳性。志贺菌中除宋内和鲍氏外，均阴性特异脱羧酶细菌分离培养接种技术和生化专家讲座第33页赖氨酸→尸胺鸟氨酸→腐胺精氨酸→精胺细菌分离培养接种技术和生化专家讲座第34页(三)碳源和氮源利用试验1.枸橼酸盐利用试验(citratetest)原理：一些细菌能分解枸橼酸盐(取得碳源)，使培养基变碱(原pH6.8→pH↑)，培养基(溴麝香草酚兰为指示剂)由淡绿变为深蓝色。培养基：枸橼酸盐斜面培养基方法：将待测菌接种于上述培养基中，35℃1~4天，观察结果。结果：由淡绿变为深蓝色为阳性，不变色为阴性。应用：用于肠杆菌科中菌与属判定。如沙门菌属、克雷伯菌属普通为阳性，其它菌属普通为阴性。细菌分离培养接种技术和生化专家讲座第35页2.丙二酸盐利用试验原理：一些细菌能将丙二酸盐分解成碳酸钠，使培养基变碱(原pH6.8→pH↑)，培养基(溴麝香草酚兰为指示剂)由淡绿变为深蓝色。培养基：丙二酸盐培养基方法：将待测菌接种于上述培养基中，35℃1~2天，观察结果。结果：培养基由淡绿变为深蓝色为阳性(指示剂同上)，不变色为阴性。应用：用于肠杆菌科中菌属间判定。克雷伯菌属，亚利桑那菌为阳性。细菌分离培养接种技术和生化专家讲座第36页IMViC试验*：是判别细菌惯用一组生化试验。

IMVC如：大肠埃希菌++--产气肠杆菌--++细菌分离培养接种技术和生化专家讲座第37页（四）各种酶类试验1.氧化酶试验(kovactest)原理：还原型细胞色素C氧化型细胞色素C四甲基对苯二胺有色醌类化合物方法：①滤纸法：取洁净滤纸一小块，沾菌少许，滴加试剂。②试剂纸片法：将滤纸片浸泡于试剂中制成试剂纸片，取菌涂于试剂纸片上。 ③菌落法：直接滴加试剂于被检菌落上。结果：10秒钟内呈深紫色为阳性。同时应以铜绿假单胞菌(+)与大肠埃希菌(-)做对照。应用：主要用于肠杆菌科细菌与假单胞菌判别（发酵菌与非发酵菌判别），另外奈瑟菌属和莫拉菌属也呈阳性反应。细菌氧化酶氧化型细胞色素C细菌分离培养接种技术和生化专家讲座第38页2.触酶试验(H2O2酶试验)原理：含有触酶细菌，能催化H2O2生成水和新生态氧，继而形成份子氧出现气泡。即：H2O2H20+O2↑(出现气泡)试剂：3%过氧化氢溶液方法：玻片法和试管法结果：产生气泡为阳性，不产生气泡为阴性应用：惯用于G+C初步判定，如葡萄球菌(+)，而链球菌为(-)。触酶细菌分离培养接种技术和生化专家讲座第39页3.硝酸盐还原试验(nitratereductivetest)原理：硝酸盐亚硝酸盐+氨亚硝酸盐+试剂→颜色反应(红色)培养基：硝酸盐培养基试剂：甲液(对氨基苯磺酸溶液)；乙液(α萘胺醋酸溶液)方法：将待测菌接种于硝酸盐培养基中，35℃1~4天，加入0.1ml甲、乙等量混合液，摇匀，马上观察结果。结果：呈红色为阳性，若加入试剂后无颜色反应可能为：

①硝酸盐没有被还原，试验为阴性。②若再加入少许锌粉，呈红色者则表明试验确为阴性，若仍不产生红色者为假阴性(锌＋亚硝酸＝红色芳基肼)应用：如肠杆菌科细菌均为阳性