间接免疫荧光法测ANA

间接免疫荧光法

检测抗核抗体（ANA）制作人：XXX20XX-XX-XX间接免疫荧光法测ANA第1页抗核抗体【本身抗体】：指抗本身组织、器官、细胞及其成份抗体【ANA】：指抗细胞核成份（DNA，RNA，蛋白质和酶）抗体。ANA存在一个谱ANA新概念：抗核酸（Nucleicacid）和核蛋白（Nucleoprotein）抗体总称一些核抗原成份在核仁和胞浆内比核质内更丰富间接免疫荧光法测ANA第2页ANA检测意义有利于疾病诊疗如抗Sm是SLE标识抗体；抗ScL-70是SD标识抗体；抗Jo-1是PM/DM标识抗体；观察疾病活动度和治疗反应研究发病机理间接免疫荧光法测ANA第3页【ANA分类】抗DNA（dsDNA,ssDNA)抗组蛋白（Histone)抗非组蛋白（Nonhistone,ExtractableNuclearAntigen,ENA）抗核仁（Nucleolus）间接免疫荧光法测ANA第4页几个ENA由来及同义词Sm：病人名：SmithRNP:u1RNP或nRNPNuclearRibonucleoproteinSSA:ROSjogren’ssyndromeASSB:La,Ha,Sjogren’ssyndromeBJo-1:病人JohnScL-70:Scleroderma间接免疫荧光法测ANA第5页【ANA由来】中性粒细胞DNP(DNA-Histone)+抗DNP+补体均质体LE细胞LE细胞：并非SLE特有，PM、SD、RA、SS等结缔组织病，药品过敏，慢活肝等亦可阳性。抗DNP取代LE细胞检测+间接免疫荧光法测ANA第6页ANA筛选：间接免疫荧光法++抗原抗体（血清）抗原—抗体第二抗体间接免疫荧光法测ANA第7页ANA筛选：间接免疫荧光法间接免疫荧光法测ANA第8页试验原理：生物薄膜载片上IgA、IgG、IgM类特异性抗体能够与抗核抗原反应；随即，结合抗体可与标识荧光二抗进行反应，并可在荧光显微镜下观察。间接免疫荧光法测ANA第9页抗原人特异性抗体FITC标识抗人抗体FITC

FITC载片试验原理：间接免疫荧光法测ANA第10页生物薄片马赛克TM技术间接免疫荧光法测ANA第11页【试验步骤】间接免疫荧光法测ANA第12页试验步骤一：准备检验加样板是否反应区亲水而周围疏水？假如不是，可用湿纸巾擦拭，必要时可使用家用洗涤剂，再用水彻底冲洗。需要消毒时，可于3％SekuseptExtra（汉高企业）中浸泡1小时。只有当载片平衡到室温后方可打开袋子。不要触及生物薄片。按照要求用记号笔对玻片进行标识。间接免疫荧光法测ANA第13页试验步骤二：样品准备1:100稀释血清标本。每次试验均需加入阳性和阴性对照。对照血清使用前必须混匀。间接免疫荧光法测ANA第14页试验步骤三：加样在加样板每个反应区加入稀释血清，防止产生气泡。滴加完全部待测标本后才开始温育。使用聚苯乙烯加样板。加样体积:25µl/反应区(5x5mm)12345样品1样品2样品3阳性对照阴性对照间接免疫荧光法测ANA第15页试验步骤四：孵育将载片盖在加样板对应凹槽里，反应即开始。确保每个标本均能够与生物薄片相接触，而标本之间不相互接触。室温（18-25℃）温育30分钟。间接免疫荧光法测ANA第16页试验步骤五：冲洗用烧杯盛PBS-Tween缓冲液，流水冲洗载片，然后马上放入装有PBS-Tween缓冲液小杯中浸洗最少5分钟。间接免疫荧光法测ANA第17页试验步骤六：加样

将20μl荧光标识抗人球蛋白（荧光二抗）加入洁净加样板每个反应区。完全加完全部二抗后，方可继续温育（最多可加50个载片）。提议使用连续加样器。加样前应使用加样器混匀。为节约时间，可在第一步温育同时滴加酶结合物至另一个加样板反应区中。间接免疫荧光法测ANA第18页试验步骤七：孵育从PBS-Tween清洗缓冲液中取出一张载片，5秒钟内用吸水纸擦一下后面和边缘后，马上将载片覆有生物薄片一面朝下，盖在加样板凹槽里。注意：为预防破坏基质，不要擦拭反应区间隙。检验生物薄片是否与液滴接触良好，然后继续下一张。从现在开始，注意防止阳光直射载片。室温温育30分钟。间接免疫荧光法测ANA第19页试验步骤八：冲洗用烧杯盛PBS-Tween缓冲液，流水冲洗载片，然后马上放入装有PBS-Tween缓冲液小杯中浸洗最少5分钟。可在每150ml磷酸盐缓冲液中加10滴(150µl)伊文氏蓝进行复染。间接免疫荧光法测ANA第20页试验步骤九：封片在盖玻片上滴加甘油/PBS。封片体积:10µl/反应区(5x5mm)从PBS-Tween清洗缓冲液中取出一张载片，用纸擦干后面和四边，注意不要擦拭反应区间隙。将载片生物薄片朝下置于准备好盖玻片上，马上检验盖玻片是否放入载片凹槽里，如有必要，需调整位置，正确放置。然后再进行下一个载片操作。间接免疫荧光法测ANA第21页试验步骤十：结果判断荧光显微镜下观察荧光。间接免疫荧光法测ANA第22页结果判读：荧光显微镜下观察

细胞核发黄绿色荧光为阳性染色细胞，不发荧光为阴性。抗原片中出现阳性染色细胞为ANA阳性，不然为阴性。阳性待检血清可作深入稀释后测定效价。间接免疫荧光法测ANA第23页【均质型】

细胞核呈均匀一致荧光

间接免疫荧光法测ANA第24页【核仁型】

核仁部分展现荧光间接免疫荧光法测ANA第25页【斑点型】(颗粒型)

细胞核内展现斑点状荧光间接免疫荧光法测ANA第26页【胞浆型】间接免疫荧光法测ANA第27页【着丝点型】间接免疫荧光法测ANA第28页

混合型：存在两种以上类型

混合型：存在两种以上类型间接免疫荧光法测ANA第29页ANA结果判断1：100阴性阴性，标本中未检测到抗核抗体1：100阳性微量对于核均质性、着丝点、核点型等荧光模式，提醒某种风湿性疾病或其它疾病1：320阳性阳性提醒某种风湿病或其它疾病滴度定义：与相同稀释倍数阴性血清相比，能观察到特异性荧光反应最高稀释度间接免疫荧光法测ANA第30页【临床意义】总ANA检测在临床诊疗与判别诊疗中是一个极为主要筛选试验。绝大多数本身免疫性疾病均可呈阳性。ANA阳性者深入检测各亚类ANA抗体对明确诊疗、临床分型、病情观察、预后及治疗评价有主要意义。未经治疗、活动性SLE阳性率为80%－100%。药品性狼疮100%、全身硬皮病、混合性结绨组织病、狼疮性肝炎、原发性胆汁性肝硬化等。干燥综合症（SS）、类风关、桥本甲状腺炎等。间接免疫荧光法测ANA第31页活动性SLE

（95-100%）非活动性SLE

（80-100%）药品诱导红斑狼疮 （100%）混合结缔组织病 （100%）类风湿关节炎 （20-40%）其它风湿性疾病 （20-50%