Promega双萤光素酶报告基因专家讲座

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－萤光素酶汇报基因技术Promega双萤光素酶报告基因专家讲座第1页

自然界萤光

发光海星 发光甲壳虫发光真菌发光节虫Promega双萤光素酶报告基因专家讲座第2页

自然界萤光发光鱼 发光甲虫Promega双萤光素酶报告基因专家讲座第3页

自然界萤光萤火虫Promega双萤光素酶报告基因专家讲座第4页汇报基因作用细胞信号转导路径开启子/增强子受体结合病毒/细胞相互作用转录因子药品诱导作用或”效果”Promega双萤光素酶报告基因专家讲座第5页荧光

-Fluorescence萤光

-LuminescenceFireWormLuminescencevs.FluorescencePromega双萤光素酶报告基因专家讲座第6页萤光（Bioluminescence）荧光（Fluorescence）是化学发光（Chemilumi-nescence）一个，激发能量来自化学反应吸收来自光源光，再发射另一光子萤光发光计（Luminometer）荧光计（Fluorometer）液闪仪（ScintilationCounter）

电荷耦合装置光学成像系统（CCDopiticalimagingsystem）荧光显微镜Promega双萤光素酶报告基因专家讲座第7页各种汇报基因优点和缺点汇报基因优点缺点萤光素酶优越灵敏度高信号值无内源活性需要底物ß-gal灵敏度好细菌，血清等内源活性高需要底物GUS（葡糖醛酸糖苷酶）灵敏度好植物中内源活性低90%E.coli,人／动物细胞中有内源活性酶扩散可引发“过分汇报”需要底物SEAP（分泌性碱性磷酸酶）分泌性汇报基因(不需裂解)在HeLa,癌和其它细胞类型中有高内源活性需要底物CAT（氯霉素转乙酰基酶）-真核细胞没有背景表示-易于使用-设备现成(液闪仪,层析)放射性灵敏度底50ｈ半衰期GFP（绿色荧光蛋白）显微镜:亚细胞定位不需底物背景可能高折叠“情形”可造成信号差异Promega双萤光素酶报告基因专家讲座第8页萤光素酶汇报基因主要优点非放射性检测快（比CAT等）灵敏度高（可比CAT检测灵敏度高100倍）半衰期短（在理想条件下，可检测到10-20摩尔萤光素酶分子。在哺乳动物细胞中半衰期3小时，在植物细胞中半衰期3.5小时。而CAT在哺乳动物细胞中半衰期约50小时）线形范围广

（在10-16

M(10pg/L)至10-8

M(1mg/L)范围内,光强度与萤光素酶浓度成正比）普通比显微镜检测荧光更灵敏

(对多孔板而言)生物萤光比荧光更稳定,因为自然界进化酶能保护光子发射器经过基因工程能够延伸生物萤光性能和能力Promega双萤光素酶报告基因专家讲座第9页萤光素酶汇报基因使用原理:制备含有luc/Rluc

DNA转染提供刺激测量萤光调整序列Luc２Promega双萤光素酶报告基因专家讲座第10页在活细胞中做汇报基因检测外界刺激(导引物)萤光素酶基因蛋白质折叠调整序列加工转录转录因子信号转导翻译反义RNA受体蛋白-蛋白相互作用RNA酶病毒感染和增殖RNAi抑制Promega双萤光素酶报告基因专家讲座第11页开启子/增强子分析“碰撞开启子”:全序列:2)逐步缺失:Promoterluc+LightPromoterluc+LightPromoterluc+Promega双萤光素酶报告基因专家讲座第12页FireflyandRenillaPromega双萤光素酶报告基因专家讲座第13页

萤火虫生物萤光化学萤光素

+ATP+O2萤光素酶Oxyluciferin+AMP+PPi+CO2+

Light萤光素酶:

单体,61,000Daltons辅-底物:

ATP.Mg2+

萤光素:Mg2+Promega双萤光素酶报告基因专家讲座第14页海肾萤光素酶反应Coelenterazine+O2萤光素酶Coelenteramide+CO2+Light萤光素酶: 单体,36,000Daltons萤光素:(Coelenterazine)Promega双萤光素酶报告基因专家讲座第15页EnzymestructuresFireflyRenillaPromega双萤光素酶报告基因专家讲座第16页为何要使用双汇报基因汇报基因A(首要信号)汇报基因B

(第二信号)特异生物学反馈+非特异生物学反馈非特异生物学反馈检测结果比较首要与第二信号确定特异生物学反馈Promega双萤光素酶报告基因专家讲座第17页细胞可能有内源脱乙酰基酶-Gal或GUS活性.

CAT,-Gal和GUS检测是终点检测.

不能同时对在一个管中组合了萤光素酶和CAT,或-Gal,两个汇报基因检测都灵敏而快速．传统双汇报基因缺点Promega双萤光素酶报告基因专家讲座第18页双萤光素酶汇报基因系统比用CAT和ß-Gal做内对照优点速度样品不需预处理，不需孵育。两次检测在几秒种内完成灵敏两个萤光素酶线性范围超出7个酶浓度数量级。内源萤光素酶背景极低方便一管完成检测，样品无须分份Promega双萤光素酶报告基因专家讲座第19页试验质粒对照质粒用海肾萤光素酶作对照归一试验改变归一反应=对照（海肾萤光素酶)试验(萤火虫萤光素酶)萤火虫萤光素酶海肾萤光素酶用两个萤光素酶做汇报基因（萤火虫+海肾）Promega双萤光素酶报告基因专家讲座第20页数据处理举例第一天 萤光素酶活性(RLU) 比率 归一活性样品处理重复 Ｆ Ｒ （F:R)改变倍数对照１ 5,1282,511２ 7,5533,815３ 10,5555,413

7,7453,913 1.98 1.00处理Ａ１ 5,13764,467２ 40,7123,57488,7877,654

6,02925,232 11.52 5.82处理B1 587,6355,144988,3478,8323 409,8813,564

661,9545,847 113.21 57.18第二天对照１ 15,52920,433 0.76２ 21,89730,841 0.7110,76013,620 0.79

16,06221,631 0.74 1.00处理Ｃ１ 850,23920,843

２ 578,95114,830３ 943,87321,788

791,02119,15441,30 55,81处理D1 14,86519,3-058,96712,28413,76720,246

12,53317,278 0.73 0.99

Δ活性倍数 (F/R)样品=

F/R)对照

第二天处理Ｃ计算以下：

Δ活性倍数 (791,021/19,154)=

（16,062/21,631)

=55.81Promega双萤光素酶报告基因专家讲座第21页GloMax™20/20

SingletubeluminometerPromega双萤光素酶报告基因专家讲座第22页GloMax™96luminometerPromega双萤光素酶报告基因专家讲座第23页WhitemicroplatesforluminescencePromega双萤光素酶报告基因专家讲座第24页Promega企业出品双汇报基因试验产品质粒萤火虫萤光素酶质粒海肾萤光素酶质粒叩头虫萤光素酶质粒检测系统非均质双汇报基因检测系统（通量较低）均质双汇报基因检测系统（适合高通量，自动化）Promega双萤光素酶报告基因专家讲座第25页载体-萤火虫萤光素酶载体pGL3家族pGL3-BasicpGL3-ControlpGL3-EnhancerpGL3-PromoterPromega双萤光素酶报告基因专家讲座第26页pGL3-BasicMapPromega双萤光素酶报告基因专家讲座第27页pGL3-ControlMapPromega双萤光素酶报告基因专家讲座第28页pGL3-EnhancerMapPromega双萤光素酶报告基因专家讲座第29页pGL3-PromoterMapPromega双萤光素酶报告基因专家讲座第30页辅助汇报基因相对萤光单位(RLU)开启子交叉交谈或相互干扰

试验刺激给辅助汇报基因无须要调整

内对照载体可能存在问题Promega双萤光素酶报告基因专家讲座第31页载体

-海肾萤光素酶汇报基因载体第二代第一代phRL-nullpRL-nullphRL-TKpRL-TKphRL-TK(int-)phRL-SV40pRL-SV40phRL-CMVpRL-CMVphRG-BphRG-TKPromega双萤光素酶报告基因专家讲座第32页Renilla

萤光素酶载体系列内含子T7开启子CMV即时早期增强子/开启子phRL-CMV

HSVTK

开启子phRL-TKSV40晚poly(A)

SV40早期增强子/开启子phRL-SV40MCSphRL-nullhRL基因Promega双萤光素酶报告基因专家讲座第33页

TK

开启子phRL-TK(Int-)MCSphRG-B合成poly(A)信号转录停顿位点三个读码框终止密码子phRG-TK合成poly(A)信号转录停顿位点三个读码框终止密码子TK

开启子hRL基因SV40晚poly(A)Renilla

萤光素酶载体系列Promega双萤光素酶报告基因专家讲座第34页用萤火虫和海肾两个萤光素酶做汇报基因Dual-Luciferase®双萤光素酶汇报基因系统（非均质检测）E1910，100次E1960，E1980，1000次Dual-GloTM萤光素酶检测系统（均质检测）E2920，10mlE2940，100mlEE2980，10X100mlPromega双萤光素酶报告基因专家讲座第35页均质检测与非均质检测发光细胞+培养基添加试剂细胞+培养基除去培养基发光清洗细胞裂解细胞添加试剂均质检测非均质检测Promega双萤光素酶报告基因专家讲座第36页Dual-Luciferase®汇报基因检测系统组分检测缓冲液II底物（冻干粉）Stop&Glo®缓冲液Stop&Glo®底物,50X被动裂解液,5XPromega双萤光素酶报告基因专家讲座第37页Dual-Luciferase®汇报基因检测步骤裂解细胞被动裂解除去培养基..PBS洗..加1XPLB,振荡15分钟..检测主动裂解除去培养基..PBS洗..在1XPLB中刮下细胞..细胞转移到试管或小瓶中..1-2次冻融..检测检测Promega双萤光素酶报告基因专家讲座第38页双萤光素酶检测方案 1支试管2步检测30秒钟LuciferaseAssayReagentIIPassivelysisbufferStop&GloReagentPromega双萤光素酶报告基因专家讲座第39页DLRTMForHTSPromega双萤光素酶报告基因专家讲座第40页

DLR™双汇报基因检测系统应用举例

α－黑色素刺激激素(α-MSH)对由人酪氨酸酶开启子／增强子控制萤光素酶表示诱导(PromegaeNotes)目标：监测细胞对α-MSH诱导应答材料： 试验载体：pGL3-Try14A:人酪氨酸酶开启子／增强子＋Luc(+)

阳性对照：pGL3-Control

阴性对照：pGL3-Basic

内对照：pRL-SV40

B16-F1细胞（鼠黑素瘤细胞系CRL-6323) DLR™双萤光素酶检测试剂盒 Promega双萤光素酶报告基因专家讲座第41页步骤 前一天：接种细胞，六孔板X3 第二天：共转染：pGL3-Try14A和pRL-SV40（分成两组）

pGL3-Control和pRL-SV40

pGL3-Basic和pRL-SV40 裂解细胞，测量萤光

Promega双萤光素酶报告基因专家讲座第42页Dual-Glo™萤光素酶检测系统检测特点均质检测，为高通量检测而设计萤光信号稳定，2hrs内检测自发萤光低于检测水平Promega双萤光素酶报告基因专家讲座第43页Dual-GloAssay:同一样品中检测两种萤光信号Stableluminescencesignalsforbothreporters

(t1/2~3.5hrs.)>10,000-foldsignalseparationbetweenthe

fireflyandRenillabioluminescencePrimaryreporter:FireflybioluminescenceSecondaryreporter:RenillabioluminescenceCellsinculturemediumAddfirefly

assayreagentAddcombinationfireflyquenchreagent

&RenillaassayreagentPromega双萤光素酶报告基因专家讲座第44页Dual-Gloassay-选择性淬灭萤火虫萤光SelectivequenchoffireflyluminescencePromega双萤光素酶报告基因专家讲座第45页Dual-Glo™萤光素酶检测系统试剂盒组成Dual-Glo™萤光素酶缓冲液Dual-Glo™萤光素酶底物（冻干粉）Dual-Glo™Stop-Glo®缓冲液Dual-Glo™Stop-Glo®底物Promega双萤光素酶报告基因专家讲座第46页操作步骤试剂制备简单将Dual-Glo™萤光素酶缓冲液倒入Dual-Glo™萤光素酶底物中用Dual-Glo™Stop&Glo®缓冲液按1:100稀释Dual-Glo™Stop&Glo®底物

全部缓冲液存于室温,全部底物存于–20°C两步加入试剂:加,读,加,读>10,000倍信号分离(淬灭)Promega双萤光素酶报告基因专家讲座第47页

用两个萤光素酶做汇报基因

Chroma-LucTM载体

Chroma-Glo®检测试剂

Promega双萤光素酶报告基因专家讲座第48页E.Coli

表示Chroma-LucTM

基因Promega双萤光素酶报告基因专家讲座第49页Chroma-LucTM

基因和载体三个基因: 1.CBRluc

–发红光萤光素酶 2.CBG99luc–发绿光萤光素酶 99.0%DNA相同于CBRluc

3.CBG68luc

-发绿光萤光素酶 68.9%DNA相同于

CBRluc两种载体骨架: 1.对照

–置换了pGL3-Controlluc+

(pCBR-Control,pCBG68-Control,andpCBG99-Control) 2.Basic–置换了pGL3-Basicluc+

(pCBR-Basic,pCBG68-Basic,andpCBG99-Basic)Promega双萤光素酶报告基因专家讲座第50页合成Chroma-LucTM

萤光素酶载体骨架ControlBasicEnhancerChroma-LucTM

基因SV40开启子SV40增强子SV40增强子(合成或天然基因)Chroma-LucTM

基因Chroma-LucTM

基因Promega双萤光素酶报告基因专家讲座第51页Chroma-Glo™检测化学Luciferin+ATP+O2LuciferaseOxyluciferin+AMP+PPi+CO2+LightLuciferase:

Monomeric,61,000DaltonsCo-substrates:

ATP.Mg2+

Luciferin:Promega双萤光素酶报告基因专家讲座第52页不一样颜色，一样试剂？C2´C2旋转，较少能量，红光不旋转，较多能量,黄绿光

Promega双萤光素酶报告基因专家讲座第53页Chroma-LucTM

萤光素酶滤光片选择510/60nm610nmLongpassPromega双萤光素酶报告基因专家讲座第54页Chroma-Glo™检测特点为高通量检测设计，检测96-、384-孔板均质检测需要带滤光片萤光发光计Promega双萤光素酶报告基因专家讲座第55页pGL4:ANewFamilyofReporterVectorsPromega双萤光素酶报告基因专家讲座第56页Nextgenerationreportervectors(pGL4)ImprovedReporterPerformancePromega双萤光素酶报告基因专家讲座第57页ImprovedExpressionofluc2Provides5-10xhigherexpressionthanluc+

inmammaliancellsLargereductionofconsensussiteswhereinappropriateinteractionswithhostmayoccurPromega双萤光素酶报告基因专家讲座第58页Sitesremovedfromvector,reportergenes,andselectablemarkers:RestrictionsitesVertebrateTFbindingsitesPromotermodulesEukaryoticspliceacceptorand

donorsitesEukaryoticpolyAsitesKozaksequencesReductioninConsensusBindingSitesPromega双萤光素酶报告基因专家讲座第59页IncreasedResponseUsing

RapidResponseLuciferasesComparedtoregularluciferase,RapidResponse™luciferasesgavehigherinductioninshortertime.Inductionat3h19279150Promega双萤光素酶报告基因专家讲座第60页为何需要快速反应萤光素酶基因？

（现存汇报基因缺点）研究者想要汇报基因应答与细胞事件在时间上更加快地耦联需要更强应答较长敷育时间可能造成检测到次级效应(假阳性)RapidResponseTM

汇报基因技术(不稳定萤光素酶基因)Promega双萤光素酶报告基因专家讲座第61页细胞内汇报基因池信号新表示汇报基因为何快速应答汇报基因应答性更强?快速应答非-快速应答新表示汇报基因信号Promega双萤光素酶报告基因专家讲座第62页基于汇报基因稳定性动力学模型Promega双萤光素酶报告基因专家讲座第63页pGL4RapidResponseReportersGeneDesignVector

Gene

DesignpGL4.10[luc2] luc2pGL4.11[luc2P] luc2PpGL4.12[luc2CP] luc2CPpGL4.70[hRluc] hRlucpGL4.71[hRlucP] hRlucPpGL4.72[hRlucCP] hRlucCP

luc2hRlucluc2hPESTluc2hCL1hPESThRluchPESThRluchCL1hPESTPromega双萤光素酶报告基因专家讲座第64页